專利名稱：：向rna噬菌體的病毒樣顆粒內(nèi)包裝寡核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)包含適合在上述方法中使用的寡核苷酸的核苷酸組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過本發(fā)明的方法可以獲得的核苷酸組合物及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供組合物，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述組合物通過本發(fā)明的方法可以獲得，其中所述組合物優(yōu)選地具有至少98%、最優(yōu)選至少99%的純度。
背景技術(shù)：
：包裝有寡核苷酸的RNA噬菌體的病毒樣顆粒是免疫系統(tǒng)的強(qiáng)刺激物(WO2003/024481A2),并且廣泛應(yīng)用在現(xiàn)代接種治療中。已經(jīng)描述了生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，例如，在WO2003/024481A2、WO2004/000351Al、WO2004/084940A1和WO2004/007538A2中?；谥亟M病毒樣顆粒解裝配、外殼蛋白純化和所述外殼蛋白在核酸存在下重裝配的方法最常使用。有效的和可以放大的生產(chǎn)RNA噬菌體的重組病毒樣顆粒的方法在WO2005/117963A1中公開。大規(guī)模純化不含內(nèi)毒素的完整病毒樣顆粒的方法在WO2007/039552A1中公開。由重組產(chǎn)生的病毒樣顆粒("解裝配")制備外殼蛋白的方法已經(jīng)公開，尤其是在WO2003/024481A2以及本申請(qǐng)的實(shí)施例部分中公開?，F(xiàn)有技10術(shù)中公開的外殼蛋白在核酸存在下裝配("重裝配")的方法在效率、可放大性和裝配產(chǎn)物的純度方面不是最優(yōu)化的。特別是，現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)使用聚集的具有特定顆粒大小(在此用相對(duì)峰開始時(shí)間表征，見下文)的寡核苷酸可以顯著提高"重裝配"方法的效率。本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N效率顯著提高的、產(chǎn)生極高純度的包裝產(chǎn)物的"重裝配"方法。一般并且優(yōu)選地，此處公開的"重裝配"方法獲得至少約為75%的蛋白質(zhì)收率和寡核苷酸收率，并且產(chǎn)生純度一般并且優(yōu)選地至少為99%的產(chǎn)物(包含包裝有寡核苷酸的病毒樣顆粒的組合物)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)核苷酸組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)。在所述方法過程中，所述病毒樣顆粒是通過在寡核苷酸的存在下所述RNA噬菌體的外殼蛋白自裝配而形成的。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在聚集的寡核普酸的存在下進(jìn)行外殼蛋白的自裝配時(shí)，該方法的效率可以顯著提高。通常，至少包含一個(gè)polyG區(qū)段(stretch)的寡核苷酸能夠聚集。寡核苷酸的聚集狀態(tài)可以使用所述RNA噬菌體的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)，用大小排阻HPLC中的相對(duì)峰開始時(shí)間進(jìn)行表征。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相對(duì)峰開始時(shí)間為50_110%、優(yōu)選80-95%的寡核苷酸是最佳的。這對(duì)應(yīng)于表觀分子量處于所述RNA噬菌體的衣殼的表觀分子量或略低的范圍內(nèi)的寡核香酸聚集體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有所需相對(duì)峰開始時(shí)間的寡核苷酸可以通過使所述寡核香酸經(jīng)歷聚集過程來獲得。因此，本發(fā)明第一方面是一種生產(chǎn)包含寡核苷酸的核普酸組合物的方法，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述方法包括以下步驟(a)在溶液II中提供一種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；并且其中所述溶液II的pH為5-8;并且其中所述溶液II包含陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液II中所述陽離子的濃度至少為20mM，其中所述陽離子優(yōu)選地選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca21。Mg2+;(b)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III,其中所述溫度III為50-99。C;和(c)在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(d)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,其中所述溫度IV低于50。C;其中所述步驟優(yōu)選地按照給定順序進(jìn)行。當(dāng)寡核苷酸制品包含具有最佳顆粒大小和窄大小分布的聚集物時(shí)，所述外殼蛋白的自裝配最有效。進(jìn)一步令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)了當(dāng)寡核苷酸在聚集步驟之前進(jìn)行解聚步驟時(shí)，可以更有效地控制寡核苷酸的聚集狀態(tài)并且獲得具有更窄大小分布的寡核苷酸制品。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。因此，本發(fā)明的第二方面是一種生產(chǎn)包含寡核苷酸的核苷酸組合物的方法，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述方法包括以下步驟(a)在溶液I中提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；并且其中所述溶液I具有堿性pH;(b)將所述寡核香酸解聚，其中所述解聚包括以下步驟(i)調(diào)節(jié)溶液I的溫度至溫度I，其中所述溫度I為4-70。C;(ii)在所述溫度I下在所述溶液I中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所迷寡核苷酸具有110%以上的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iii)調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II，其中所述溫度II為0-70。C;(c)調(diào)節(jié)所述溶液I的pH至pH5-8;和(d)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包括以下步驟(i)在溶液II中提供所述寡核苷酸，其中所述溶液II為pH5-8并且包含陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液II中的所述陽離子的濃度至少為20mM,并且其中優(yōu)選地所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+;(ii)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，其中所述溫度III為50-99°C;(iii)在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iv)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,其中所述溫度IV低于50。C;其中所述步驟優(yōu)選地按照給定順序進(jìn)行。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。12本發(fā)明的第三方面是一種包含寡核苷酸的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物可以通過上述任意一種方法獲得，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間。所述核普酸組合物可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。本發(fā)明的第四方面是一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核香酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供一種包含寡核苷酸的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物是通過本發(fā)明第一和第二方面的任意一種方法可以獲得的核苷酸組合物；(c)產(chǎn)生一種混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。本發(fā)明的第五方面是一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供寡核苷酸，(i)其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；和(ii)其中所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。本發(fā)明的第六方面是一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供寡核苷酸，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述13提供包括以下步驟(i)在溶液II中提供寡核苷酸，其中所述溶液II為pH5-8并且含有陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液II中的所述陽離子的濃度至少為20mM,并且其中優(yōu)選地所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+;(ii)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III,其中所述溫度III為50-99。C;和(iii)在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iv)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV，其中所述溫度IV低于50。C;其中步驟(i)至(iv)優(yōu)選地按照給定順序進(jìn)行；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。本發(fā)明的第七方面是一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供寡核苷酸，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述提供包括以下步驟(i)在溶液I中提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；并且其中所述溶液I具有堿性pH;(ii)解聚所述寡核苷酸，其中所述解聚包括以下步驟(l)調(diào)節(jié)溶液I的溫度至溫度I，其中所述溫度I為4-70。C;(2)在所述溫度I下在所述溶液I中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有110%以上的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(3)調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II,其中所述溫度II為0-70。C;(iii)調(diào)節(jié)所述溶液I的pH至pH5-8;和(iv)聚集所述寡核普酸，其中所述聚集包括以下步驟(l)在溶液II中提供所述寡核普酸，其中所述溶液II為pH5-8并且包含陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液II中的所述陽離子的濃度至少為20mM，并且其中優(yōu)選地所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+;(2)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度in，其中所述溫度III為50-99。C;(3)在所述溫度III下在所述溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(4)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,其中所述溫度IV低于50。C;其中步驟(i)至(iv)優(yōu)選地按照給定順序進(jìn)行；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。本發(fā)明的第八方面是通過本發(fā)明的任意一種方法可以獲得的核苷酸組合物在生產(chǎn)組合物的方法中的用途，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)。本發(fā)明的第九方面是通過本發(fā)明的任意一種方法可以獲得的組合物，所述組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是QP,并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核苷酸是G8-8(SEQIDN0:6)或G10(SEQIDNO:8),優(yōu)選G10(SEQIDNO:8)，并且再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述組合物的純度至少為98%,更優(yōu)選至少99%,最優(yōu)選至少99.2%。圖1:Q(3衣殼標(biāo)準(zhǔn)物(上)和聚集的G10(下)的大小排阻HPLC層析圖。HPLC如實(shí)施例4所述進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間為8.532分鐘，聚集的G10的峰開始時(shí)間為7.510分鐘。因此，聚集的G10的相對(duì)峰開始時(shí)間為88%(7.510min/8.532min*100)。圖2:未處理的GIO、聚集的寡核苷酸G10和QP衣殼標(biāo)準(zhǔn)物的大小排阻HPLC層析圖。HPLC如實(shí)施例4所述進(jìn)行。(A)在聚集前未進(jìn)行解聚處理的聚集的G10顯示與Q(3衣殼相當(dāng)?shù)幕蛘吒叩谋碛^分子量(A,盒2)。相對(duì)峰開始時(shí)間約為75%。(B)在聚集之前如實(shí)施例151所述進(jìn)行過解聚處理的聚集的G10顯示比QP衣殼更低的表觀分子量(B,盒2)。相對(duì)峰開始時(shí)間約為88%。圖3:未處理的、解聚的和聚集的G10寡核苷酸和包裝有G10的重裝配的VLP的CD語。使用22.5jliM的寡核苷酸濃度記錄光語，然后標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化，按照=100xCD信號(hào)[mdeg]/L[cm]xc[mM]計(jì)算橢圓率。圖4:通過分析型大小排阻層析法表征純化的QJ3外殼蛋白。(A)純化的Q卩VLP的樣品。觀察到的峰(比值A(chǔ)260/A280-2)是由VLP的RNA核心主要貢獻(xiàn)的，因?yàn)镽NA在260nm處的吸光系數(shù)比外殼蛋白的吸光系數(shù)大約高100倍。(B)解裝配反應(yīng)的上清液的樣品。在大約12分鐘時(shí)出現(xiàn)蛋白質(zhì)樣峰指示釋放的外殼蛋白。此外，幾種未沉淀的RNA分子在6.8-11分鐘范圍內(nèi)存在。(C)純化的Q(3外殼蛋白的樣品。在TSKG5000PWxl柱(TosohBioscience)上在PBS中進(jìn)行分圖5:(A)天然Q(3VLP、(D)Q卩GIOVLP和包裝成分(B)寡核苷酸G10和(C)Q(3外殼蛋白的分析型大小排阻層析分析。觀察到的Q卩GIOVLP(D)峰(比值A(chǔ)260/A280=1.74)由VLP的G10核心主要貢獻(xiàn)，因?yàn)镚10在260nm處的吸光系數(shù)比外殼蛋白的吸光系數(shù)大約高130倍。在TSKG5000PWxl柱(TosohBioscience)上在PBS中進(jìn)行分析。圖6:天然Q(3VLP和體外裝配的Q卩GIO的非還原性SDS-PAGE分析。指示出了外殼蛋白五聚體和六聚體的位置((a)分子量標(biāo)準(zhǔn)，(b)Q(3VLP,(c)Q卩GlO)。發(fā)明詳述除非另外明確說明，下面描述的定義和實(shí)施方案適用于本發(fā)明的任一方面和實(shí)施方案，特別是本發(fā)明的方法、組合物、核苷酸組合物和用途。除非另外定義，此處使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。16"寡核苷酸"此處使用的術(shù)語寡核苷酸是指單鏈脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選的寡核苷酸包含至少一個(gè)如下定義的polyG區(qū)段。更優(yōu)選的寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)所述的polyG區(qū)段。非常優(yōu)選的寡核苷酸包含恰好兩個(gè)polyG區(qū)段，其中優(yōu)選地所述兩個(gè)polyG區(qū)段中的一個(gè)位于所述寡核香酸的5'末端或者3'末端。甚至更優(yōu)選的寡核普酸包含恰好兩個(gè)polyG區(qū)段，其中所述兩個(gè)polyG區(qū)段中的一個(gè)位于所述寡核普酸的5，末端而所述兩個(gè)polyG區(qū)段中的一個(gè)位于所述寡核苷酸的3'末端。典型且優(yōu)選地，此處使用的寡核苷酸由6-1000個(gè)、優(yōu)選10-1000個(gè)、更優(yōu)選10-200個(gè)、再更優(yōu)選10-100個(gè)、再更優(yōu)選20-40個(gè)、最優(yōu)選30個(gè)核苷酸組成。進(jìn)一步優(yōu)選的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個(gè)核苷酸組成。再更優(yōu)選的寡核苷酸由24-32個(gè)核苷酸、更優(yōu)選大約30個(gè)核苷酸組成。術(shù)語寡核苦酸也指至少包含一個(gè)修飾的核苷酸的分子，其中優(yōu)選地所述修飾的核苷酸選自(a)核苷酸類似物或(b)包含骨架修飾的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個(gè)選自下組的修飾的核苷酸(a)肽核酸，(b)肌苷，(c)三苯曱基化(tritylated)堿基,(d)硫代磷酸酯，(e)烷基硫代磷酸酯，(f)5-硝基吲哚脫氧呋喃核糖基，(g)5-曱基脫氧胞嘧啶，和(h)5,6-二氬-5，6-二羥基脫氧胸苷。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含或者由硫代磷酸化的核苷酸組成。硫代磷酸化的核普酸受到保護(hù)而不在細(xì)胞或生物體中降解，因此是優(yōu)選的核苷酸修飾。進(jìn)一步優(yōu)選的是一般在自然中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)、酶或代謝修飾形式的多核苷酸。但是，優(yōu)選的寡核苷酸只由未修飾的核苷酸即腺苷、胸苷、鳥苷和/或胞苷組成。進(jìn)一步優(yōu)選的寡核苷酸只由磷酸二酯鍵結(jié)合的核苷酸組成。非常優(yōu)選的寡核苷酸是含有非曱基化的CpG的寡核苷酸，其包含至少1個(gè)，優(yōu)選1、2、3或4個(gè)CpG基序。更優(yōu)選的寡核苷酸包含回文序列，其中優(yōu)選地所述回文序列包含至少1個(gè)，優(yōu)選l、2、3或4個(gè)CpG基序。更優(yōu)選的寡核苷酸包含回文序列，其中優(yōu)選地所述回文序列包含或者優(yōu)選地由序列GACGATCGTC(SEQIDNO:l)組成。更優(yōu)選的寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列在其5'端的側(cè)翼為polyG區(qū)段，并且所述回文序列在其3'端的側(cè)翼為polyG區(qū)段，其中優(yōu)選地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:1)。非常優(yōu)選的寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列在其5'末端的側(cè)翼為至少3-10個(gè)，優(yōu)選4-IO個(gè)鳥苷個(gè)體，并且所述回文序列在其3，末端的側(cè)翼為至少3-10個(gè)，優(yōu)選4-10個(gè)鳥苷個(gè)體，其中優(yōu)選地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:l)。"polyG區(qū)段"術(shù)語polyG區(qū)段涉及寡核苷酸區(qū)段，其中所述區(qū)段由至少3個(gè)連續(xù)鳥苷殘基組成。優(yōu)選的polyG區(qū)段由3-25個(gè)、優(yōu)選4-20個(gè)、更優(yōu)選4-15個(gè)、最優(yōu)選4-10個(gè)連續(xù)鳥苷個(gè)體組成。進(jìn)一步優(yōu)選的polyG區(qū)段由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)連續(xù)鳥苷個(gè)體組成。"CpG基序"此處使用的術(shù)語"CpG基序"是指短DNA序列，優(yōu)選單鏈DNA序列，其包含胞嘧啶(C)-鳥。票呤(G)二核苷酸，其中C是非曱基化的，并且優(yōu)選地所述CG二核苷酸是磷酸二酯鍵結(jié)合的。優(yōu)選地，CpG基序在所述CG二核苷酸的5，和/或3'側(cè)包含至少1個(gè)，優(yōu)選1、2或3個(gè)額外的核苷酸，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述額外的核苷酸不包含CG二核苷酸。"相對(duì)峰開始時(shí)間，，術(shù)語"相對(duì)峰開始時(shí)間"是一個(gè)指示寡核苷酸的聚集狀態(tài)的參數(shù)。寡核苷酸的相對(duì)峰開始時(shí)間通過分析型大小排阻HPLC確定，其中優(yōu)選地所述HPLC基本上、優(yōu)選地完全使用下列參數(shù)進(jìn)行柱TSKgel5000PWXL7.8mm*30.0cm(Lot:5PWX06GNMH3304,Art:08023,TosohBioscience)洗脫液PBS(20mM磷酸鈉緩沖液中的150mMNaCl,pH7.2)注入體積流速梯度運(yùn)4亍時(shí)間波長柱加熱器溫度:40.0|il(優(yōu)選地含有約20pM-約500nM的濃度)0.8ml/min等度20min215、260和280nm,在260nm評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)25。C自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8。C;并且其中使用所述RNA噬菌體的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)物。所述寡核苷酸相對(duì)于所述RNA噬菌體的衣殼的相對(duì)峰開始時(shí)間X。/。如下計(jì)算X%=寡核苷酸的峰開始時(shí)間[min]除以標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間[min]x100%，其中寡核苷酸的峰開始時(shí)間被確定為可以檢測(cè)到寡核苷酸的洗脫時(shí)的時(shí)間，并且標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間被確定為所述標(biāo)準(zhǔn)物出現(xiàn)最大峰值的時(shí)間。因此，在其中所述RNA噬菌體例如是噬菌體AP205的實(shí)施方案中，在所述HPLC中使用AP205的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)物，所述寡核苷酸的相對(duì)峰開始時(shí)間相對(duì)于所述AP205標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行計(jì)算。重要的是，在不涉及RNA噬菌體的實(shí)施方案中，相對(duì)峰開始時(shí)間總是使用噬菌體QP的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行確定。此外，如果所述HPLC中適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物的選擇具有任何不確定性，使用噬菌體Q(3的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)物，相對(duì)于所述噬菌體Q(3的衣殼確定相對(duì)峰開始時(shí)間。因此，在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過所述HPLC確定所述相對(duì)峰開始時(shí)間，其中優(yōu)選地所述標(biāo)準(zhǔn)物是噬菌體QP的衣殼，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述相對(duì)峰開始時(shí)間相對(duì)于所述噬菌體QP的衣殼進(jìn)行確定。"包裝的"此處使用的術(shù)語"包裝的"是指寡核苷酸相對(duì)于病毒樣顆粒的狀態(tài)。術(shù)語"包裝到VLP內(nèi)的寡核苷酸"或"包裝有寡核苷酸的VLP"的使用是等同的。此處使用的術(shù)語"包裝的"是指非共價(jià)結(jié)合，優(yōu)選地是指離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵。非常優(yōu)選地，此處使用的術(shù)語"包裝的"是指所述寡核苷酸包封或部分包封于VLP內(nèi)。例如，寡核苷酸，優(yōu)選具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間的寡核苷酸，可19以被VLP包封，而不需存在實(shí)際的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，或者存在非共價(jià)結(jié)合。典型且優(yōu)選地，包裝有寡核苷酸的VLP保護(hù)所述寡核苷酸免于降解，優(yōu)選地免于DNAse水解。因此，在優(yōu)選的含義中，術(shù)語"包裝的"表示包裝狀態(tài)的寡核苷酸不會(huì)被DNAse水解。更優(yōu)選地，術(shù)語"包裝的"表示寡核苷酸不會(huì)被DNAse水解，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，該DNAse是DNAseI或Benzonase。再更優(yōu)選地，術(shù)語"包裝的"表示寡核苷酸不會(huì)被Benzonase水解。寡核苷酸對(duì)于DNAse(例如DNasel或Benzonase)的可及性優(yōu)選地如WO2003/024481A2的實(shí)施例11-17(參見其中第111頁)所述測(cè)定。在優(yōu)選的含義中，當(dāng)用Benzonase(190UBenzonase/mg外殼蛋白，在含有2mMMgCh的pH7.2的緩沖液中，20-25。C,18h)處理后從VLP中可以回收至少90%、優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的寡核苷酸時(shí)(例如，在溴化乙錠染色的凝膠中)，所述VLP被認(rèn)為包裝有所述寡核苷酸。技術(shù)人員顯然知道這樣的試驗(yàn)需要適當(dāng)?shù)膶?duì)照，并且可能需要適應(yīng)VLP和寡核苷酸的具體組合。在更優(yōu)選的含義中，當(dāng)用Benzonase(190UBenzonase/mg夕卜殼蛋白，在含有2mMMgCl2的pH7.2的緩沖液中，20-25。C，18h)處理后從RNA噬菌體的VLP中可以回收至少90%、優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的寡核苷酸時(shí)，所述寡核普酸被認(rèn)為包裝在所述RNA噬菌體的VLP內(nèi)。在非常優(yōu)選的含義中，當(dāng)用Benzonase(190UBenzonase/mg夕卜殼蛋白，在含有2mMMgCl2的pH7.2的緩沖液中，20-25。C，18h)處理后從RNA噬菌體的VLP中可以回收至少90%、優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的寡核苷酸G10(SEQIDNO:8)時(shí)，所述G10被認(rèn)為包裝在所述RNA噬菌體的VLP內(nèi)。在更特定的含義中，當(dāng)用Benzonase(190UBenzonase/mg外殼蛋白，在含有2mMMgCl2的pH7.2的緩沖液中，20-25°C，18h)處理后從RNA噬菌體QP、AP205、GA或fr的VLP中可以回收至少90%、優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的寡核苷酸G10(SEQIDNO:8)時(shí)，所述G10被認(rèn)為包裝在所述RNA噬菌體的VLP內(nèi)。在非常特定的含義中，當(dāng)用Benzonase(190UBenzonase/mg外殼蛋白，在含有220mMMgCl2的pH7.2的緩沖液中，20-25。C,18h)處理后從RNA噬菌體Q卩的VLP中可以回收至少90%、優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%的含非曱基化CpG的寡核苷酸時(shí)，寡核苷酸G10(SEQIDNO:8)被認(rèn)為包裝在所述RNA噬菌體Q卩的VLP內(nèi)。"外殼蛋白"此處使用的術(shù)語"外殼蛋白"是指能夠合并到噬菌體或RNA噬菌體的衣殼裝配體內(nèi)的RNA噬菌體的蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語外殼蛋白是指形成RNA噬菌體的衣殼或RNA噬菌體的VLP的蛋白質(zhì)。典型且優(yōu)選地，RNA噬菌體的外殼蛋白具有二聚體結(jié)構(gòu)。此處使用的"(重組)外殼蛋白的片段"，特別是重組外殼蛋白的片段，被定義為一種多肽，其長度分別是野生型外殼蛋白或野生型重組蛋白長度的至少70%,優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，并且優(yōu)選地保持形成VLP的能力。優(yōu)選地，該片段通過至少一個(gè)內(nèi)部缺失、至少一個(gè)截短或者至少一個(gè)它們的組合而獲得。術(shù)語"重組外殼蛋白的片段"或"外殼蛋白的片段"進(jìn)一步包括如下的多肽，它分別與野生型外殼蛋白有至少80%、優(yōu)選90%、甚至更優(yōu)選95%的氨基酸序列同一性，并且優(yōu)選地能夠裝配為病毒樣顆粒。術(shù)語"突變外殼蛋白"是指分別具有來源于野生型重組蛋白或外殼蛋白的氨基酸序列的多肽，其中氨基酸序列與野生型序列至少80%、優(yōu)選地至少85%、90%、95%、97%或99%相同，并且優(yōu)選地保持裝配為VLP的能力。此處使用的"病毒樣顆粒(VLP)"是指非復(fù)制性的或非傳染性的，優(yōu)選非復(fù)制性且非傳染性的病毒顆粒，或者指非復(fù)制性或非傳染性的，優(yōu)選非復(fù)制性且非傳染性的類似于病毒顆粒的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選病毒的衣殼。此處使用的術(shù)語"非復(fù)制性"是指不能復(fù)制VLP所包含的基因組。此處使用的術(shù)語"非傳染性"是指不能進(jìn)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和/或非傳染性的，因?yàn)樗狈θ炕虿糠植《净蚪M或基因組功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒樣顆粒是一種病毒顆粒，其中病毒基因組已經(jīng)被物理或化學(xué)滅活，通過解裝配和重裝配或者通過將純化的蛋白質(zhì)裝配為VLP而除去。典型且更優(yōu)選地，病毒樣顆粒缺乏病毒基因組的全部或部分的復(fù)制性和傳染性成分。本發(fā)明的病毒樣顆粒可以含有與它們的基因不同的核酸。本發(fā)明病毒樣顆粒的一個(gè)典型且優(yōu)選的實(shí)施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體(優(yōu)選RNA噬菌體)的病毒衣殼。術(shù)語"衣殼，，是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體。一般有60、120、180、240、300、360和360個(gè)以上的病毒蛋白質(zhì)亞單位。典型且優(yōu)選地，這些亞單位的相互作用導(dǎo)致形成具有固有的重復(fù)組織的病毒衣殼，其中所述結(jié)構(gòu)一般且優(yōu)選地是球形。例如，RNA噬菌體的衣殼具有二十面體對(duì)稱的球形。"RNA噬菌體的病毒樣顆粒"此處使用的術(shù)語"RNA噬菌體的病毒樣顆粒"是指包含或者優(yōu)選地基本由或者由RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段組成的病毒樣顆粒。另外，類似于RNA噬菌體的結(jié)構(gòu)的RNA噬菌體的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和/或非傳染性的，并且至少缺乏編碼RNA噬菌體的復(fù)制機(jī)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)基因，一般也缺乏編碼一種或多種負(fù)責(zé)病毒附著于或進(jìn)入宿主的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)基因。優(yōu)選的來源于RNA噬菌體的VLP顯示出二十面體對(duì)稱，并且由180個(gè)亞單位組成。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語RNA噬菌體的病毒樣顆粒優(yōu)選地涉及通過RNA噬菌體的重組外殼蛋白的自裝配獲得的大分子結(jié)構(gòu)，或其片段或突變體，其中優(yōu)選地所述自裝配在寡核苷酸的存在下發(fā)生。"能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑"能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑是阻止在所述混合物中自發(fā)形成病毒樣顆粒的試劑。技術(shù)人員能夠通過實(shí)驗(yàn)確定所述試劑的化學(xué)性質(zhì)和合適的濃度，例如，通過如實(shí)施例9所公開的大小排阻層析法分析所述混合物。能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑，當(dāng)在室溫下、優(yōu)選地在22。C下溫育所述混合物至少1小時(shí)后，通過如實(shí)施例9所公開的大小排阻層析法沒有檢測(cè)到病毒樣顆粒。但是，能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑不會(huì)不可逆地修飾所述外殼蛋白，從所述混合物中除去所述試劑將會(huì)導(dǎo)致病毒樣顆粒的自發(fā)形成。優(yōu)選的能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑包括去污劑、鹽酸胍和尿素，最優(yōu)選的是尿素。優(yōu)選的去污劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫20、22TritonX100等。一般且優(yōu)選地，能夠阻止外殼蛋白自裝配的試劑還包括使通過所述外殼蛋白的半胱氨酸殘基形成的分子間二硫鍵保持還原狀態(tài)的還原劑。"蛋白質(zhì)收率"本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)收率被確定為相對(duì)于所述混合物中所含的外殼蛋白量，所述方法的最后一步后作為病毒樣顆?；厥盏耐鈿さ鞍椎牧浚渲袃?yōu)選地所述外殼蛋白的量通過Bradford蛋白質(zhì)分析來確定。一般且優(yōu)選地，所述混合物中所含的外殼蛋白的至少70%、優(yōu)選地至少75%在所述方法的最后一步后作為病毒樣顆粒被回收，其中優(yōu)選地所述最后一步是所述無菌過濾。"寡核苷酸收率"本發(fā)明方法的寡核苷酸收率被確定為相對(duì)于所述混合物中所含的所述寡核苷酸的量，所述方法的最后一步后可以從所述病毒樣顆粒中回收的寡核苷酸的量，其中優(yōu)選地從所述病毒樣顆粒中回收的所述寡核苷酸的量基本或者優(yōu)選地完全按照實(shí)施例9中所公開的確定。一般且優(yōu)選地，在所述方法的最后一步后，從所述病毒樣顆粒中回收所述混合物中所含的寡核苷酸的至少70%、優(yōu)選地至少75%，其中優(yōu)選地所述最后一步是所述無菌過濾。"純度"本發(fā)明組合物的純度通過分析型大小排阻HPLC測(cè)定，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述HPLC在基本上、優(yōu)選地完全如實(shí)施例4所述的毒樣顆粒的峰面積相對(duì)于同一層析圖的總峰面積的百分比。一般且優(yōu)選地，本發(fā)明組合物的純度為至少98%，優(yōu)選地至少99%。"一個(gè)"、"一種"當(dāng)術(shù)語"一個(gè)"、"一種"在本文中使用時(shí)，除非另外指出，它們的意思是"至少一個(gè)/種"或"一個(gè)/種或多個(gè)/種"。"大約"在本申請(qǐng)的含義中，表述"大約"具有+/-10%的含義。例如，大約100是指90-110。本發(fā)明提供生產(chǎn)包含聚集的寡核苷酸的核苷酸組合物的方法。更詳細(xì)地，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)包含寡核香酸的核苷酸組合物的方法，苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述方法包括以下步驟(a)在溶液II中提供寡核苷酸，其中所述寡核普酸優(yōu)選地在其5，末端具有至少3個(gè)鳥苷個(gè)體并且在其3'末端具有至少3個(gè)鳥苷個(gè)體；并且其中所述溶液II的pH為5-8;并且其中所述溶液n包含陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液n中所述陽離子的濃度為至少20mM，其中所述陽離子優(yōu)選地選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+;(b)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，其中所述溫度III為50-99°C;和(c)在溫度m下在溶液n中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(d)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV，其中所述溫度IV低于50。C;其中所述步驟優(yōu)選地按照給定的順序進(jìn)行。下面描述的所有實(shí)施方案都以任意組合適用于該方法。如上所述，已發(fā)現(xiàn)使所述寡核苷酸在所述聚集步驟之前經(jīng)歷解聚步驟是有利的，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸完全解聚。寡核苷酸的完全解聚是指在優(yōu)選地基本如實(shí)施例4所述進(jìn)行的大小排阻HPLC中寡核苷酸的表觀分子量對(duì)應(yīng)于可能來源于所述寡核苷酸序列的分子量。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生產(chǎn)包含寡核苷酸的核苷酸組合物的方法，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，所述方法包括以下步驟(a)在溶液I中提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少一個(gè)polyG區(qū)段；并且其中所述溶液I具有堿性pH;(b)解聚所述寡核苷酸，其中所述解聚包括以下步驟(i)調(diào)節(jié)溶液I的溫度至溫度I，其中所述溫度I為4-70。C;(ii)在所述溫度I下在所述溶液l中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有高于110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iii)調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II，其中所述溫度II為0-70。C;(c)調(diào)節(jié)所述溶液I的pH至pH5-8;和(d)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包括以下步驟(i)在溶液II中提供所述寡核苷酸，其中所述溶液II為pH5-8并且含有陽離子，其中優(yōu)選地所述溶液II中所述陽離子的濃度為至少20mM，并且優(yōu)選地所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+;(ii)調(diào)節(jié)溶24液II的溫度至溫度III,其中所述溫度III為50-99°C;(iii)在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核普酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iv)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,其中所述溫度IV低于50。C;其中所述步驟優(yōu)選地按照給定的順序進(jìn)行?？赡馨糠志奂墓押塑账岬奈刺幚淼墓押塑账嵩趬A性pH下發(fā)生解聚。升高的溫度可以促進(jìn)解聚過程。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液I的pH為8-13,優(yōu)選10-13,最優(yōu)選12。溶液I可以包含任何緩沖液或者試劑，可以包含允許調(diào)節(jié)pH為8-13的任何本領(lǐng)域中已知的緩沖液或試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶液I包含氫氧化物，優(yōu)選金屬氫氧化物，最優(yōu)選堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，優(yōu)選;成金屬的氬氧化物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氫氧化物是氫氧化鉀或氫氧化鈉，最優(yōu)選氫氧化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液I中所述氬氧化物、優(yōu)選所述氫氧化鈉的濃度為10mM-200mM,更優(yōu)選約25mM，最優(yōu)選25mM。為了避免寡核苷酸的降解，溫度I優(yōu)選地不超過90。C,溫度I不超過70。C。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度I為室溫，優(yōu)選19-25。C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度I為4-70。C,優(yōu)選20-70。C,更優(yōu)選45-70。C，優(yōu)選約50。C,最優(yōu)選50。C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述溫度I下在所述溶液I中對(duì)所述寡核苷酸進(jìn)行所述溫育，直到所述寡核苷酸完全解聚。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，在所述溫度I下在所述溶液I中對(duì)所述寡核普酸進(jìn)行所述溫育，直到所述寡核苷酸的相對(duì)峰開始時(shí)間高于110%,優(yōu)選高于130%,最優(yōu)選地高于135%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在所述溫度I下在所述溶液I中對(duì)所述寡核苷酸的所述溫育進(jìn)行30-190min,優(yōu)選50-90min，最優(yōu)選70min。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液I中所述寡核苷酸的濃度為50^M-2mM,優(yōu)選50-500|tiM，更優(yōu)選200-300jxM,最優(yōu)選260pM。寡核苷酸的解聚可以通過中和或酸化溶液I和/或降低溫度來終止。因此，所述方法進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)所述溶液I的pH至pH8或更低，優(yōu)選至pH5-8的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行所述pH的調(diào)節(jié)直到所述pH為6-7，最優(yōu)選地直到所述pH約為6。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述所述溶液I的pH的調(diào)節(jié)通過向所述溶液I中加入酸進(jìn)行。本領(lǐng)域周知的任何無機(jī)酸或有機(jī)酸可以用于該目的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸選自磷酸、鹽酸和有機(jī)酸，其中所述有機(jī)酸優(yōu)選地選自曱酸、乙酸和檸檬酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸是無機(jī)酸。優(yōu)選地，所述酸是磷酸或鹽酸，最優(yōu)選磷酸。所述方法進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II，其中優(yōu)選地所述溫度II為0-70。C，并且其中優(yōu)選地所述溫度II低于溫度I。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溫度II為0-25。C,優(yōu)選0-10。C，最優(yōu)選0-2。C。該方法進(jìn)一步包括聚集所述寡核苷酸的步驟。寡核苷酸的聚集是通過在大約中性pH和高于50。C的溫度下在含有能夠支持G-四元DNA結(jié)構(gòu)形成的陽離子的溶液中溫育所述寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)的(參見，SimonssonT.,Biol.Chem.382:621-628)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陽離子選自Na+、K+、Rb+、NH4+、Cs+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、N產(chǎn)和Mg2+。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg2+，更優(yōu)選地，所述陽離子是Na+或K+，最優(yōu)選地，所述陽離子是Na+。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃度在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含所述寡核苷酸的溶液II是通過向所述溶液I中添加所述陽離子而獲得的，其中優(yōu)選地所述添加在所述溶液I的pH調(diào)節(jié)之后進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溶液II是選自Na+、K+、Rb+、NH4+、Cs+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、N產(chǎn)和Mg2+的任意陽離子的混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溶液II是選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca"和Mg"的任意陽離子的混合物。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物包含或者優(yōu)選地由Na+和K+組成。26在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液II包含至少20mM，優(yōu)選至少100mM,更優(yōu)選200-275mM,最優(yōu)選250mM的所述陽離子或者所述陽離子混合物。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液II包含250mM的Na+和K+,最優(yōu)選250mM的Na+。在再進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液II包含250mM的氯化鈉或氯化鉀，最優(yōu)選250mM的氯化鈉。^旦是，任何本領(lǐng)域周知的鈉、鉀、4妄、鋰、鈣或鎂鹽都可以用于該目的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溶液II中所述寡核苷酸的濃度為50^M-2mM，優(yōu)選100-300fiM，最優(yōu)選175]liM。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，其中所述溫度III為50-99。C，優(yōu)選80-90。C，更優(yōu)選約85。C,最優(yōu)選85。C。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法包括在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%、優(yōu)選80-95%、更優(yōu)選80-90%、再更優(yōu)選83-90%、再更優(yōu)選85-90%、最優(yōu)選88。/。的相對(duì)峰開始時(shí)間。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸為G10(SEQIDN0:8),并且進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110%、優(yōu)選80-95%、更優(yōu)選80-90%、再更優(yōu)選83-90%、再更優(yōu)選85-90%、最優(yōu)選88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。獲得具有所需相對(duì)峰開始時(shí)間的寡核苷酸所需的溫育時(shí)間取決于寡核苷酸的序列和純度，其范圍一般且優(yōu)選地是從大約5分鐘至大約30分鐘。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是G10(SEQIDNO:8)，所述寡核苷酸在所述溫度III下在所述溶液II中的所述溫育進(jìn)行9-24分鐘。聚集過程通過使溶液II冷卻到50。C以下來終止。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,其中所述溫度IV低于50。C,并且優(yōu)選地所述溫度IV為0-25。C，更優(yōu)選0-10。C，最優(yōu)選0-2。C。已發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明方法中使用的加熱和/或冷卻速率對(duì)獲得的聚集27寡核苷酸的收率和顆粒大小分布具有影響。特別是，在將該方法放大到較高的批量體積的過程中發(fā)現(xiàn)，使用至少3.6°C/min的變溫速度(即加熱或冷卻速率)可以進(jìn)一步提高收率和顆粒大小分布。技術(shù)人員通過將關(guān)于反應(yīng)容器的反應(yīng)體積、幾何形狀和導(dǎo)熱性的過程條件和所選的溫差標(biāo)準(zhǔn)化，可以實(shí)現(xiàn)確定的溫度變化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)溶液I的溫度至溫度I，所述調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II,所述調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，和/或所述調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV,使用至少3.6。C/min的變溫速度進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，采用至少3.6。C/min的變溫速度進(jìn)行，其中優(yōu)選地所述變溫速度為大約7°C/min。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV采用至少3.6。C/min的變溫速度進(jìn)行，其中優(yōu)選地所述變溫速度為大約7。C/min。為了能夠形成聚集物，所述寡核苷酸包含至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)polyG區(qū)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸在其5'末端包含至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)鳥苷個(gè)體，在其3'末端包含至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)鳥苷個(gè)體。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸在其5，末端包含至少4個(gè)鳥苷個(gè)體并且在其3'末端包含至少4個(gè)鳥苷個(gè)體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸在其5'末端包含至少3個(gè)、最多20個(gè)、優(yōu)選地最多15個(gè)鳥苷個(gè)體，在其3，末端包含至少3個(gè)、最多20個(gè)、優(yōu)選地最多15個(gè)鳥苷個(gè)體。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸在其5'末端包含至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)，最多11個(gè)鳥苷個(gè)體，在其3'末端包含至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)、最多10個(gè)鳥苷個(gè)體。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是含有非甲基化的CpG的寡核苷酸，優(yōu)選地其中所述含有非曱基化的CpG的寡核苷酸包含兩個(gè)polyG區(qū)段，其中優(yōu)選地每個(gè)所述polyG區(qū)段由至少4個(gè)鳥苷個(gè)體組成，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述含有非曱基化的CpG的寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列位于所述polyG區(qū)段之間。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸在其5，末端包含至少3個(gè)，優(yōu)選至少4個(gè)鳥苷個(gè)體，并且在其3，末端包含至少3個(gè)，優(yōu)選至少4個(gè)鳥苷個(gè)體，其中所述寡核苷酸進(jìn)一步包含回文序列，其中優(yōu)選地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDN0:1)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含回文序且其中所述回文序列在其5'端的側(cè)翼為至少3個(gè)，優(yōu)選至少4個(gè)，最多15個(gè)鳥苷個(gè)體，并且其中所述回文序列在其3，端的側(cè)翼為至少3個(gè)，優(yōu)選至少4個(gè)，最多15個(gè)鳥苷個(gè)體。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含10-1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選10-200個(gè)核苷酸，更優(yōu)選10-100個(gè)核苷酸，再更優(yōu)選20-40個(gè)核苷酸，最優(yōu)選30個(gè)核苷酸。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含或者優(yōu)選地由選自下組的核酸序歹'j組成(a)"G4-4"GGGGGACGATCGTCGGGG(SEQIDN0:2);(b)"G5-5"GGGGGGACGATCGTCGGGGG(SEQIDNO:3);(c)"G6-6"GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:4);(d)"G7-7"GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:5);(e)"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6);(f)"G9-9"GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQIDNO:7);(g)"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8);(h)"Gil"GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQIDNO:9)，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯鍵合的核苷酸組成。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含或者優(yōu)選地由核酸序列"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8)組成，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯鍵合的核苷酸組成。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含寡核苷酸的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物通過上述任意一種方法、通過單獨(dú)或者任意組合地實(shí)施上述任一種實(shí)施方案可以獲得。特別是，本發(fā)明涉及一種包含寡核苷酸29的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物通過上述任意一種方法可以獲得，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%,優(yōu)選80-95%，更優(yōu)選80-90%,更優(yōu)選83-90%,再更優(yōu)選85-90%,最優(yōu)選88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸組合物包含寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含或者優(yōu)選地由選自下組的核酸序列組成(a)"G4-4，，GGGGGACGATCGTCGGGG(SEQIDNO:2);(b)"G5-5"GGGGGGACGATCGTCGGGGG(SEQIDNO:3);(c)"G6-6，，GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQIDNO:4);(d)"G7-7"GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:5);(e)"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6);②"G9-9"GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQIDNO:7);(g)"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8);(h)"Gil"GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQIDNO:9)，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯鍵合的核苷酸組成。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中中，所述核苷酸組合物包含寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含或者優(yōu)選地由核酸序列"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGCSEQIDNO:8)組成，其中優(yōu)選地所述寡核普酸完全由磷酸二酯鍵合的核苷酸組成。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸組合物包含寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由核酸序列"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8)組成，其中所述寡核苷酸完全由磷酸二酯鍵合的核苷酸組成，并且其中所述寡核苷酸具有50-110%，優(yōu)選80-95%,更優(yōu)選80-90%,更優(yōu)選83-90%,再更優(yōu)選85-90%,最優(yōu)選88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。如前所述，本發(fā)明的核苷酸組合物可用于生產(chǎn)組合物的方法中，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，因?yàn)楸景l(fā)明的核苷酸組合物中所含的聚集的寡核苷酸有利于RNA噬菌體外殼蛋白的自裝配，因而有利于RNA噬菌體的病毒樣顆粒的形成，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒中。因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供包含寡核苷酸的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物是通過本發(fā)明的任意一種方法可以獲得的核苷酸組合物；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。相對(duì)峰開始時(shí)間為50-110%的寡核香酸對(duì)于本發(fā)明的目的是最有用的，而具有較高或較低相對(duì)峰開始時(shí)間的寡核苷酸可能導(dǎo)致低收率。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核普酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供寡核苷酸，(i)其中所述寡核苷酸優(yōu)選地包含至少一個(gè)polyG區(qū)段；和(ii)其中所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒.所述方法可以包括任意組合的此處所述的任一種特征和實(shí)施方案。技術(shù)人員通過采用標(biāo)準(zhǔn)方法從RNA噬菌體中純化所述外殼蛋白能夠產(chǎn)生和純化RNA噬菌體的外殼蛋白。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選的是通過在大腸桿菌中表達(dá)所述外殼蛋白而產(chǎn)生的。獲得RNA噬菌體的外殼蛋白的方法在實(shí)施例部分中公開。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含或者31基本由或者由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體選自(a)p藍(lán)菌體Q)3;(b)噬菌體R17;(c)噬菌體fr;(d)噬菌體GA;(e)噬菌體SP;(f)噬菌體MS2;(g)噬菌體Mll;(h)噬菌體MX1;(i)噬菌體NL95;(j)噬菌體f2;(k)噬菌體PP7;和噬菌體AP205。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體是噬菌體Q(3。用于表達(dá)和純化RNA噬菌體(特別是噬菌體Q(3)的病毒樣顆粒的過程和方法在WO2006/125821A2和WO2007/039552A1中公開，它們?cè)诖艘胱鳛閰⒖?。RNA噬菌體的外殼蛋白可以通過病毒樣顆粒的解裝配獲得，例如，如本文實(shí)施例所述。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體是噬菌體AP205。AP205VLP的可裝配突變形式，包括第5位氨基酸的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白，也可以在本發(fā)明的實(shí)施中應(yīng)用。WO2004/007538,特別是實(shí)施例1和實(shí)施例2中，描述了如何獲得包含AP205外殼蛋白的VLP,由此，特別是描述了它們的表達(dá)和純化。WO2004/007538在此引入作為參考。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體是噬菌體fr。重組VLP形式的fr外殼蛋白可以如PushkoP等人((1993)ProtEngin6:883-891)所述獲得。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體是噬菌體GA。GAVLP可以通過將經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄從GA噬菌體中分離的GA外殼蛋白cDNA克隆到pQbl85內(nèi)而獲得，這在例如WO2004/007538中描述。Fr和GAVLP的解裝配可以容易地如下進(jìn)行在任選地添加有濃度為0.1M的乙酸的7M尿素中溫育VLP。通過離子交換層析，在允許明顯量的外殼蛋白流過而核酸保留的pH下，或者在外殼蛋白也被吸附到柱上并隨后被鹽梯度洗脫的pH下，從外殼蛋白中進(jìn)一步純化核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含或者優(yōu)選地由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQIDNO:IO(Q(3CP);(b)SEQIDNO:10和SEQIDNO:ll(Q(3Al蛋白)的混合物；(c)SEQIDN0:12(R17外殼蛋白)；(d)SEQIDNO:13(fr外殼蛋白)；(e)SEQIDNO:1432(GA外殼蛋白)；(f)SEQIDNO:15(SP外殼蛋白)；(g)SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的混合物；(h)SEQIDNO:17(MS2外殼蛋白)；(i)SEQIDNO:18(M11外殼蛋白)；(j)SEQIDNO:19(MX1外殼蛋白)；(k)SEQIDNO:20(NL95外殼蛋白)；(1)SEQIDNO:21(f2外殼蛋白)；(m)SEQIDNO:22(PP7外殼蛋白)；和(n)SEQIDNO:23(AP205外殼蛋白)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含或者優(yōu)選地由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQIDNO:10;(b)SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的混合物;(c)SEQIDNO:13;(d)SEQIDNO:14;(e)SEQIDNO:23。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述外殼蛋白包含或者優(yōu)選地由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQIDNO:10;和(b)SEQIDNO:10和SEQIDNO:l1的混合物。此外，本發(fā)明可以使用其中暴露的賴氨酸殘基被替換為精氨酸的噬菌體QP的突變外殼蛋白。這樣，在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含、基本由或者由WO02/056905(參見其中的實(shí)施例18)公開的突變Q卩外殼蛋白組成。進(jìn)一步地，也已證明RNA噬菌體外殼蛋白在細(xì)菌宿主中表達(dá)后自裝配(Kastelein，RA.等人,Gene23:245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.NaukSSSR287:452-455(1986)，Adhin,MR.等人,Virology170:238-242(1989),Priano,C.等人，J.Mol.Biol.249:283-297(1995))。特別是已經(jīng)公開了GA(Ni,CZ.,等人，ProteinSci.5:2485-2493(1996),Tars,K等人，J.Mol.Biol.271:759-773(1997))和fr(PushkoP.等人，Prot.Eng.6:883-891(1993)，Liljas,L等人JMol.Biol.244:279-290，(1994))的生物學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)。已經(jīng)確定了幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)(Golmohammadi，R.等人，Structure4:543-554(1996))。典型且優(yōu)選地，此處公開的生產(chǎn)組合物的方法在室溫下進(jìn)行，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核普酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法在15-30。C,優(yōu)選地在19-25。C，最優(yōu)選地在22°C下進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物的所述產(chǎn)生、所述從所述混合物中除去所述試劑和/或所述讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒在15-30。C,優(yōu)選地在19-25。C，最優(yōu)選地在22。C下進(jìn)行。所述方法包括產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物中所述外殼蛋白的濃度為0.5-10mg/ml，優(yōu)選1-4mg/ml，最優(yōu)選2.5mg/ml，其中優(yōu)選地所述濃度通過Bradford分析測(cè)定。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物中所述寡核苷酸的濃度為12.5-250|iM，更優(yōu)選25-100^M，最優(yōu)選62.5pM。為了獲得包裝過程的最佳收率，所述混合物中所述寡核苷酸和所述外殼蛋白的摩爾比為0.5-1.2,優(yōu)選0.6-0.8，最優(yōu)選0.7。每個(gè)外殼蛋白使用較少的寡核苷酸將導(dǎo)致低收率，而使用過量的寡核苷酸則會(huì)提高成本，并且可能產(chǎn)生低純度的產(chǎn)物。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物中所述外殼蛋白的濃度為2.5mg/ml，所述混合物中所述寡核苷酸的濃度為62.5pM。病毒外殼蛋白，特別是RNA噬菌體的外殼蛋白，通常具有自裝配為衣殼結(jié)構(gòu)例如病毒樣顆粒的強(qiáng)烈傾向。盡管不是在每種情況下都是這樣，但是在許多情況下在存在核酸如RNA或DNA的情況下這種傾向?qū)?huì)提高。為了在所述外殼蛋白發(fā)生自裝配之前獲得所述外殼蛋白和所述寡核苷酸的最佳混合，所述混合物包含能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑。典型且優(yōu)選地，所述試劑包括變性化合物。生物化學(xué)領(lǐng)域知道大量的變性化合物，包括去污劑、尿素或鹽酸胍。優(yōu)選的去污劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫20、TritonX100等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性化合物是尿素或鹽酸胍，其中優(yōu)選地所述混合物中所述變性化合物(優(yōu)選地所述尿素)的濃度為0.25-7.2M,優(yōu)選1M。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性化合物是尿素，所述混合物中所述尿素的濃度為0.5-2M,優(yōu)選0.7-1.5M,更優(yōu)選0.8-1.2M，最優(yōu)選1M。34在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物的pH大約為中性，優(yōu)選地所述pH為6-8，更優(yōu)選6.8-7.5，最優(yōu)選地所述pH為7.2。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物包含磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鈉緩沖液，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述混合物中所述磷酸鹽緩沖液的終濃度為2-100mM，更優(yōu)選10-50mM,最優(yōu)選大約20mM。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述混合物進(jìn)一步包含鹽，其中優(yōu)選地所述鹽是囟化物，優(yōu)選堿土金屬的氯化物，更優(yōu)選地所述鹽是氯化鉀或氯化鈉或它們的組合，最優(yōu)選地，所述鹽是氯化鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物中所述鹽或所述鹽的組合的濃度，優(yōu)選地所述氯化鈉的濃度，為0-1M,優(yōu)選0-550mM，更優(yōu)選0-350mM,再更優(yōu)選50-350mM,最優(yōu)選250mM。某些RNA噬菌體，特別是噬菌體Q|3、噬菌體AP205和噬菌體fr的衣殼和/或病毒樣顆粒，通過形成所述衣殼或病毒樣顆粒的蛋白質(zhì)亞單位之間的分子間二硫4建而被穩(wěn)定化。向所述混合物中添加還原劑使所述二硫鍵保持還原狀態(tài)，從而支持了阻止所述外殼蛋白的自裝配。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑因而進(jìn)一步包括還原劑，其中所述還原劑優(yōu)選地選自DTT(二碌u赤蘚糖醇)、(3-巰基乙醇、TCEP和其它本領(lǐng)域周知的還原劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述還原劑是DTT，其中優(yōu)選地所述混合物中所述DTT的濃度為1-25mM,優(yōu)選2.5mM。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體是噬菌體QP、噬菌體AP205或噬菌體fr,并且所述試劑進(jìn)一步包括還原劑，其中優(yōu)選地所述還原劑是DTT，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述混合物中所述DTT的濃度為1-25mM,優(yōu)選2.5mM。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含能夠在所述病毒樣顆粒中形成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基，并且所述試劑進(jìn)一步包括還原劑，其中優(yōu)選地所述還原劑是DTT，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述混合物中所述DTT的濃度為1-25mM，優(yōu)選2.5mM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述產(chǎn)生所述混合物包括向所述混合物中添加(i)所述外殼蛋白；(ii)所述能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；和(iii)所述寡核普酸，其中優(yōu)選地所述添加按照給定順序進(jìn)行，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述混合物在添加所述寡核苷酸之前混合。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在所述除去所述試劑之前溫育所述混合物的步驟，其中優(yōu)選地所述溫育進(jìn)行大約50-70分鐘，優(yōu)選大約60分鐘。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物的溫育在15-30。C下進(jìn)行，更優(yōu)選地在19-25。C下進(jìn)行，最優(yōu)選地在22。C下進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物的所述溫育包括攪拌所述混合物，其中優(yōu)選地所述攪拌以大約50-200rpm進(jìn)行，最優(yōu)選地以大約100rpm進(jìn)行。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物的所述溫育進(jìn)行大約60分鐘，并且所述混合物的所述溫育包括攪拌所述混合物，其中優(yōu)選地所述攪拌以大約100rpm進(jìn)4亍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述從所述混合物中除去所述試劑是通過使用第一緩沖液的第一緩沖液交換進(jìn)行的，其中優(yōu)選地所述第一緩沖液交換通過透析或者通過連續(xù)流過濾進(jìn)行，優(yōu)選地通過連續(xù)流過濾進(jìn)行。所述第一緩沖液交換通過具有允許保留所述外殼蛋白和自裝配的VLP的分子量截止值的膜進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液交換通過膜進(jìn)行，其中所述膜的分子量截止值為1-50kD、優(yōu)選5-30kD，最優(yōu)選30kD。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液交換通過分子量截止值為1-50kD、優(yōu)選30kD的膜通過連續(xù)流過濾進(jìn)行，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述第一緩沖液的體積是所述混合物體積的大約6倍。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜是分子量截止值為30kD的Biomax-5(PES)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液交換是通過分子量截止值為1-50kD、優(yōu)選30kD的膜通過連續(xù)流過濾進(jìn)行的，其中將滲透流速調(diào)節(jié)為大約961/(m2*h)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液包含鹽，其中優(yōu)選地所述第一緩沖液的鹽組成與所述混合物的鹽組成相同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液中的所述鹽是卣化物，優(yōu)選堿土金屬的氯化物，更優(yōu)選地所述鹽是氯化鉀或氯化鈉或它們的組合，最優(yōu)選地，所述鹽是氯化鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液中所述鹽或所述鹽組合的濃度，優(yōu)選地所述氯化鈉的濃度，為0-1M,優(yōu)選0-550mM,更優(yōu)選0-350mM,再更優(yōu)選50-350mM，最優(yōu)選250mM。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一緩沖液的pH為6-8，更優(yōu)選6.8-7.5，最優(yōu)選地所述pH為7.2。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第一緩沖液包含磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鈉緩沖液，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述第一緩沖液中所述磷酸鹽緩沖液的終濃度為2-100mM,更優(yōu)選10-50mM,最優(yōu)選大約20mM。為了穩(wěn)定在自裝配反應(yīng)中形成的所述病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒優(yōu)選地與能夠在所述病毒樣顆粒中形成分子間二硫鍵的氧化劑接觸。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使所述病毒樣顆粒接觸氧化劑的步驟，其中優(yōu)選地所述氧化劑選自(a)過氧化氫，其中優(yōu)選地所述過氧化氫的濃度為0.25-50mM,優(yōu)選2mM;(b)氧；(c)谷胱甘肽；(d)抗壞血酸鹽；(e)Cu2+;和(f)Fe3+。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNA噬菌體為噬菌體QI3、噬菌體AP205或噬菌體fr，并且所述方法進(jìn)一步包括使所述病毒樣顆粒接觸氧化劑的步驟，其中優(yōu)選地所述氧化劑選自(a)過氧化氫，其中優(yōu)選地所述過氧化氬的濃度為0.25-50mM,優(yōu)選2mM;(b)氧；(c)谷胱甘肽；(d)Cu2+;和(e)Fe3+,并且最優(yōu)選地所述氧化劑為過氧化氫，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述過氧化氫的濃度為0.25-50mM，優(yōu)選2mM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述外殼蛋白包含能夠在所述病毒樣顆粒中形成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地所述外殼蛋白是噬菌體QP、噬菌體AP205或噬菌體fr的外殼蛋白，并且所述方法進(jìn)一步包括使所述病毒樣顆粒接觸氧化劑的步驟，其中優(yōu)選地所述氧化劑選自(a)過氧化氫，其中優(yōu)選地所述過氧化氫的濃度為0.25-50mM,優(yōu)選2mM;(b)氧；(c)谷胱甘肽；(d)Cu2+;和(e)Fe3+,并且其中最優(yōu)選地所述氧化劑為過氧化氫，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述過氧化氫的濃度為0.25-50mM,<尤選2mM。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化所37述病毒樣顆粒的步驟，其中優(yōu)選地所述純化包括使用第二緩沖液的第二緩沖液交換，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述第二緩沖液是藥學(xué)可接受的緩沖液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二緩沖液交換使用第二緩沖液進(jìn)行，其中優(yōu)選地所述第二緩沖液交換通過透析或者通過連續(xù)流過濾進(jìn)行，優(yōu)選地通過連續(xù)流過濾進(jìn)行。所述第二緩沖液交換通過其分子量截止值允許保留所述病毒樣顆粒、優(yōu)選地允許所述外殼蛋白和/或所述寡核苷酸透過的膜進(jìn)行。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二緩沖液交換通過分子量截止值為100-1000kD、優(yōu)選300kD的膜進(jìn)行，其中優(yōu)選地所第二緩沖液交換通過連續(xù)流過濾進(jìn)行。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜是分子量截止值為300kD的PLCMK-300。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第二緩沖液交換通過分子量截止值為100-1000kD、優(yōu)選300kD的膜通過連續(xù)流過濾進(jìn)行，其中優(yōu)選地交換所述混合物體積的大約10倍，并且進(jìn)一步優(yōu)選地將滲透流速調(diào)節(jié)為大約1001/(m2*h)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法包括濃縮所述病毒樣顆粒，其中優(yōu)選地進(jìn)行所述濃縮，直到所述組合物中所述病毒樣顆粒的終濃度為1-5mg蛋白質(zhì)/ml，優(yōu)選大約2.5mg蛋白質(zhì)/ml，其中優(yōu)選地所述濃度通過Bradford蛋白質(zhì)分析測(cè)定，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述病毒樣顆粒溶解在所述第二緩沖液中。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過能夠保留所述病毒樣顆粒的膜進(jìn)行所述濃縮，其中優(yōu)選地所述膜的分子量截止值為100-1000kD,優(yōu)選大約300kD,并且進(jìn)一步優(yōu)選地以低于1001/(11*1112)、優(yōu)選地大約301/(Mm、的通過所述膜的滲透流速進(jìn)行所述濃縮。濃縮步驟中的低流速阻止了產(chǎn)物的沉淀。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括無菌過濾所述病毒樣顆粒的步驟，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒包含在所述第二緩沖液中，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述無菌過濾通過0.1-0.451im、優(yōu)選大約0.22pm的膜過濾器進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)組合物的方法具有蛋白質(zhì)收率，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆38粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述蛋白質(zhì)收率為至少50%，優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,再更優(yōu)選至少75%,最優(yōu)選至少80%。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)組合物的方法具有寡核苷酸收率，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述寡核苷酸收率為至少50%,優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，再更優(yōu)選至少75%，最優(yōu)選至少80%。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含所述病毒樣顆粒的所述組合物具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、再更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的純度。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)組合物的方法具有寡核苷酸收率，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述寡核苷酸收率為至少50%，優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%，再更優(yōu)選至少75%，最優(yōu)選至少80%。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)組合物的方法具有蛋白質(zhì)收率和寡核苷酸收率，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述蛋白質(zhì)收率為至少50%,優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%,再更優(yōu)選至少75%,最優(yōu)選至少80%。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含所述病毒樣顆粒的所述組合物中每100pg外殼蛋白包含15-30pg，優(yōu)選20-25pg，最優(yōu)選大約20jag所述寡核苷酸，其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒是噬菌體QP的病毒樣顆粒，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核苷酸是G10(SEQID39NO:8),其中再進(jìn)一步優(yōu)選地包含所述病毒樣顆粒的所述組合物具有至少98%、優(yōu)選至少99%的純度，其中再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述外殼蛋白的定量通過Bradford蛋白質(zhì)分析進(jìn)行，并且再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述寡核苷酸的定量基本上、優(yōu)選地完全如實(shí)施例9所述進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過本發(fā)明的任一種方法可以獲得的核苷酸組合物在生產(chǎn)組合物的方法中的應(yīng)用，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核普酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中優(yōu)選地所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供所述核苷酸組合物；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒；其中優(yōu)選地所述核普酸組合物中包含的所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述RNA噬菌體是QP,再進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核苷酸是G10(SEQIDNO:8)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間的寡核苷酸在生產(chǎn)組合物的方法中的應(yīng)用，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中優(yōu)選地所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供所述寡核苷酸；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒；其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是QP,并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核苷酸是G10(SEQIDNO:8)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過本發(fā)明的任一種方法可以獲得的組合物，所述組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是QP，并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核普酸是G10(SEQIDNO:8),再進(jìn)一步優(yōu)選地所述組合物的純度為至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%,再更優(yōu)選至少98%,最優(yōu)選至少99%,并且再進(jìn)一步優(yōu)選地，包含所述病毒樣顆粒的所述組合物中每100pg外殼蛋白包含15-30pg、優(yōu)選20-25pg、最優(yōu)選大約20pg的所述寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過本發(fā)明的任一種方法可以獲得的組合物，所述組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核香酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是QP,并且進(jìn)一步優(yōu)選地所述寡核苷酸是G10(SEQIDNO:8),其中更進(jìn)一步優(yōu)選地所述組合物的純度為至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%,再更優(yōu)選至少98%,最優(yōu)選至少99%,其中所述寡核苷酸不一皮DNAse水解。實(shí)施例實(shí)施例1寡核苷酸G10(SEQIDNO:8)的解聚和聚集G10的定量:根據(jù)用340nm處的吸收校正的260nm處的紫外吸收對(duì)G10進(jìn)行定量，其中在1cm光程長度時(shí)，1A26。-34o對(duì)應(yīng)于27.8jig/ml的濃度。解聚(IO.Oml規(guī)模，260uMG10,25mMNaOH,50°C,70min):稱重45.91mgG10力口入15ml試管中。將粉末溶解在ll.Oml純化水中(c=325.3|aM;通過光語法測(cè)量)。將8.0ml寡核苷酸溶液與250pl1MNaOH和1.75ml純化水在15ml試管中混合(260GIO，25mMNaOH)。混合物在50°C水浴中解聚70分鐘。在冰上冷卻該溶液后，用0.5MHC1調(diào)節(jié)pH至pH5.31;加入540iul0,5MHC1和5|ul1MNaOH。聚集(IO.Oml規(guī)模，175uMGIO,250mMNa+,85°C,9-24min):將417.1ml解聚的G10溶液、2.13ml純化水和770pi3MNaCl在15ml試管中混合(175寡核苷酸，250mMNa+)?；旌衔镌?5°C水浴中溫育9分鐘。該溶液在冰/水浴中冷卻，并貯存在冰上直到使用。聚集的寡核苷酸溶液應(yīng)當(dāng)在制備后3小時(shí)內(nèi)使用。實(shí)施例2寡核苷酸G4-4的解聚和聚集解聚:制備260|liM寡核普酸G4-4(SEQIDNO:2)和25mMNaOH在純化水中的溶液。將溶液加熱到50。C保持70分鐘，然后在冰上冷卻，用0.5MHC1調(diào)節(jié)溶液的pH至pH5-8。聚集:包含解聚的G4-4的溶液用純化水和3MNaCl稀釋至終濃度為230|LiMG4-4和250mMNa+。采用6.8。C/min的加熱升溫速度將混合物加熱到80。C數(shù)分鐘(2-70min)。溫育后，采用6.8°C/min的降溫速度將該混合物冷卻至0-2。C。通過大小排阻HPLC分析產(chǎn)物(參見實(shí)施例4)顯示獲得聚集的寡核苷酸。(相對(duì)峰開始時(shí)間88%)。實(shí)施例3寡核苷酸的解聚和聚集解聚:分別制備260|uM寡核苷酸G5-5(SEQIDNO:3)、G6-6(SEQIDNO:4)、G7匿7(SEQIDNO:5)、G8-8(SEQIDNO:6)、G9-9(SEQIDNO:7)和Gl1(SEQIDNO:9)和25mMNaOH在純化水中的溶液。將溶液加熱到50。C70min,然后在冰上冷卻，使用0.5MHC1將溶液的pH調(diào)節(jié)至pH5-8。聚集:包含解聚的寡核苷酸的溶液用純化水和3MNaCl稀釋至終濃度為230iliM寡核苷酸和250mMNa+。采用6.8。C/min的加熱升溫速度將混合物加熱到80。C數(shù)分鐘(2-70min)。溫育后，采用6.8°C/min的降溫速度將該混合物冷卻至0-2。C。通過大小排阻HPLC分析聚集過程的產(chǎn)物(參見實(shí)施例4)。實(shí)施例4通過大小排阻HPLC分析寡核苷酸G10的聚集狀態(tài)GIO的聚集狀態(tài)通過分析型大小排阻HPLC進(jìn)行分析，使用下列條件柱TSKgel5000PWXL7.8mm*30.0cm(Lot:5PWX06GNMH3304，Art:08023,TosohBioscience)洗脫液PBS(20mM磷酸鈉緩沖液中的150mMNaCl,pH7.2)注入體積濃度)流速梯度運(yùn)行時(shí)間波長柱加熱器溫度:40.0iul(優(yōu)選地包含大約20iLiM-大約500)iM的0.8ml/min等度20min215、260和280nm,在260nm評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)25°C自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8。C使用噬菌體QP的衣殼作為標(biāo)準(zhǔn)物。G10相對(duì)于Q(3衣殼的峰開始時(shí)間X%(相對(duì)峰開始時(shí)間Q[3)如下計(jì)算X%=寡核普酸的峰開始時(shí)間[min]除以QP衣殼標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間[min]x100%,其中寡核苷酸的峰開始時(shí)間確定為可以;險(xiǎn)測(cè)到寡核苷酸的洗脫時(shí)的時(shí)間，并且QP衣殼標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間確定為所述標(biāo)準(zhǔn)物出現(xiàn)最大峰值的時(shí)間。寡核苷酸G10和作為標(biāo)準(zhǔn)物的噬菌體Q(3衣殼的洗脫曲線的一個(gè)實(shí)例如圖1所示?；趫D1所示的層析圖，聚集的寡核苷酸計(jì)算得到88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。實(shí)施例543未處理的、解聚的和聚集的寡核苷酸G10的相對(duì)峰開始時(shí)間的比較確定基本如實(shí)施例1所述制備的解聚的和聚集的G10的相對(duì)峰開始時(shí)間，并且與從供應(yīng)商處獲得的未處理的G10的相對(duì)峰開始時(shí)間進(jìn)行比較。解聚的G10顯示138%的相對(duì)峰開始時(shí)間(136.9-140.3%;11=5)。未經(jīng)歷實(shí)施例1所述的解聚/聚集處理的G10制品顯示與解聚的G10相同范圍內(nèi)的相對(duì)峰開始時(shí)間。在解聚和聚集后，發(fā)現(xiàn)G10的峰開始時(shí)間為88%。實(shí)施例6解聚步驟的影響未處理的寡核苷酸G10和如實(shí)施例1所述解聚的寡核苷酸G10基本如實(shí)施例1所述進(jìn)行聚集處理，其中選擇如下的聚集條件175iiMGlO,250mMNa+(通過加入3MNaCl),于85。C溫育16分鐘，然后在冰上冷卻。兩種制品都使用QP衣殼和未處理的G10作為標(biāo)準(zhǔn)物通過大小排阻HPLC進(jìn)行分析(參見實(shí)施例4)。得到的HPLC層析圖如圖2所示。未處理的G10含有聚集的G10(參見圖2A和2B,盒1)。在聚集之前沒有解聚的聚集的G10顯示與QP衣殼相當(dāng)或更高的表觀分子量(圖2A,盒2)。相對(duì)峰開始時(shí)間約為75%。在聚集之前解聚的聚集的G10顯示比Q卩衣殼更低的表觀分子量(圖2B,盒2)。相對(duì)峰開始時(shí)間約為88%。實(shí)施例7通過圓二色性分析寡核苷酸GIO的聚集狀態(tài)利用JASCOJ-715分光光度計(jì)在200nm和300nm之間記錄未處理的、解聚的和聚集的G10(基本如實(shí)施例1所述制備)以及包裝有G10的QP衣殼(如實(shí)施例10所述獲得的QbG10)的CD譜(圖3)。聚集的G10的光鐠的特征是強(qiáng)陽性帶(高橢圓形)，在262nm處具有最大值，在240nm處為波谷。這些信號(hào)據(jù)報(bào)道對(duì)應(yīng)于具有平行方向的鏈的DNA四鏈體的典型光錯(cuò)(Lu等人，Biochemistry31，p.2455，1992)。重要的是，在聚集的G10的存在下重裝配的VLP譜中，CD譜在250nm-300nm區(qū)域中的形狀沒有變化。因此，G10似乎在包裝時(shí)沒有經(jīng)歷構(gòu)象變化。在262nm處振幅的輕微增加可能反映了聚集的G10選擇性包裝到Q|3衣殼內(nèi)，與仍然含有一部分非聚集分子的聚集的G10相比，在包裝后產(chǎn)生較高比例的四鏈體。相反，未處理的G10的光譜的特征在于低橢圓性，而沒有確定的表示缺乏確定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)元件的最大值。對(duì)于解聚的G10也觀察到低CD信號(hào)，盡管在295nm處出現(xiàn)最大值和在262nm處出現(xiàn)最小值可能反映了某些反平行四鏈構(gòu)象異構(gòu)體的存在(P.Balagurumoorthy等人，NucleicAcidsResearch20,p.4061,1992)。實(shí)施例8通過解裝配/重裝配包裝Q(3VLP和G10OBVLP的解裝配:PBS(20mM磷酸鹽，150mMNaCl,pH7.5)中的45mgQ(3VLP(2.5mg/ml,通過Bradford分析測(cè)定)用10mMDTT在室溫和攪拌條件下還原15分鐘。然后，加入氯化鎂至0.7M的終濃度，并且在室溫和攪拌條件下繼續(xù)溫育15分鐘，導(dǎo)致包封的宿主細(xì)胞RNA沉淀和伴隨的VLP分解。將溶液在4。C下以4000rpm離心10分鐘(Eppendorf5810R，固定角轉(zhuǎn)頭A-4-62，在下面的所有步驟中使用)，以從溶液中除去沉淀的RNA。含有釋放的二聚體Q(3外殼蛋白的上清液用于層析純化步驟。通過陽離子交換層析法和大小排阻層析法純化OB外殼蛋白:將含有二聚體外殼蛋白、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和殘余宿主細(xì)胞RNA的解裝配反應(yīng)的上清液力口到SP—SepharoseFF片主(xkl6/20,6ml,AmershamBioscience)上。該柱用pH7的20mM磷酸鈉緩沖液平衡，用水1:15稀釋樣品以調(diào)節(jié)電導(dǎo)率低于10mS/cm,以實(shí)現(xiàn)外殼蛋白與柱的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。結(jié)合的外殼蛋白的洗脫通過直到20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度完成，并且以大約25ml的級(jí)分體積收集蛋白質(zhì)。在室溫下進(jìn)行層析，在所有步驟中流速均為5ml/min,并于260nm和280nm監(jiān)測(cè)吸光度。第二步，將分離的Q卩外殼蛋白(從陽離子交換柱上洗脫的級(jí)分)加到用pH7.2的20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉平衡的SephacrylS-100HR才主(xk26/60,320ml,AmershamBioscience)上。在室溫下以2.5ml/min的流速進(jìn)行層析，并于260nm和280nm監(jiān)測(cè)吸光度。收集5ml的級(jí)分。通過分析型大小排阻層析法表征純化的0(3外殼蛋白純化的Q卩外殼蛋白的樣品通過分析型大小排阻層析法進(jìn)行分析(圖1C),并且比較-i)完整的Q(3VLP(圖4A)，它從大腸桿菌裂解液中純化并且用作純化步驟的原材料，和ii)解裝配反應(yīng)的上清液(圖4B)。圖4C中不存在任何RNA樣峰(A280/A260的典型比值=0.5)而存在唯一的蛋白質(zhì)樣峰(A280/A260的典型比值-1.7)指示RNA分子與外殼蛋白的有效分離。通過滲濾裝配O3G10:純化的外殼蛋白(在20mM磷酸鈉pH7.2,250mMNaCl中)與水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G10寡核苷酸(基本如實(shí)施例1所述制備)的儲(chǔ)備液混合?；旌衔锏捏w積為50ml，成分的終濃度為1mg/ml外殼蛋白、1.0M尿素、250mMNaC1、2.5mMDTT和0.24mg/mlGIO。然后使用30kDa截止值的柱(PelliconXL,Millipore)和10ml/min的橫向流速和2.5ml/min的滲透流速，在室溫下相對(duì)于300ml20mM磷酸鈉250mMNaClpH7.2滲濾該溶液。加入11202至7mM的終濃度，并在室溫下溫育該溶液1小時(shí)，以誘導(dǎo)二硫鍵的形成。然后使用300kDa截止值的柱(PelliconXL，Millipore)和10ml/min的才黃向流速和2.5ml/min的滲透流速，將該溶液相對(duì)于500ml20mM磷酸鈉150mMNaClpH7.2滲濾，以從裝配的Q卩GIO產(chǎn)物中除去過量的11202和未包裝的G10寡核苷酸。實(shí)施例9Q(3G10包裝產(chǎn)物的分析和包裝方法收率的測(cè)定46通過分析型大小排阻層析法表征包裝的OBG10VLP:包裝的Q(3G10VLP的樣品通過分析型大小排阻層析法進(jìn)行分析(圖5)并且與從大腸桿菌裂解液中純化的完整QPVLP進(jìn)行比較。所述分析型大小排阻層析法使用如下的參數(shù)進(jìn)行柱Bio-SilSEC250,7.8x300mm,目錄號(hào)125-0062洗脫液50mM磷酸鈉pH6.5,150mMNaCl梯度等度柱溫度25。C自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8。C流速1.0ml/min興脊1.0mg/ml蛋白質(zhì)注入體積40|ul評(píng)價(jià)波長280腿帶寬4nm運(yùn)行時(shí)間20min樣品制備用洗脫液將樣品稀釋為1.0mg/ml,立即振蕩樣品并于4。C以16000g離心10分鐘。與代表天然Q(3VLP的峰以相同保留時(shí)間遷移的峰證實(shí)了產(chǎn)物中存在正確裝配的VLP。觀察到的Q(3G10VLP的峰(圖5D)是由VLP的核酸成分主要貢獻(xiàn)的，因?yàn)楹怂嵩?60nm處的吸光系數(shù)比外殼蛋白的吸光系數(shù)高100倍以上。發(fā)現(xiàn)純化的Q(3G10VLP的A260/A280比值為1.70(1.65-1.76;n=5)，這是G10的特征(A260/A280=1.74),其中發(fā)現(xiàn)QpVLP的A260/A280比值為1.87(1.85-1.90;n=10)，這是RNA的特征。通過SDS-PAGE分析表征包裝的OBG10VLP:包裝的Q(3G1047樣品通過非還原性SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖6)，并且與從大腸桿菌裂解物中純化的完整Q(3VLP進(jìn)行比較。外殼蛋白的二硫鍵連接的五聚體和六聚體形式的條帶的形成證實(shí)了產(chǎn)物中存在正確裝配的VLP，其類似于完整Q(3VLP,表明體外裝配的QPG10VLP中外殼蛋白單元具有正確的結(jié)構(gòu)排列。包裝的寡核香酸G10的定量為了還原二硫鍵，將QPG10VLP樣品(0.25mg/ml,在PBS中)用0.1mMTCEP(三(2-氯乙基)磷酸酯)處理(室溫15分鐘)。向還原的樣品中加入NaCl(1M終濃度)，混合物在60°C下溫育15分鐘，以便沉淀蛋白質(zhì)成分。離心后，將得到的上清液于95。C溫育5分鐘，在冰上冷卻1分鐘，然后測(cè)量A260值。上清液中寡核苷酸GIO的濃度按照下式計(jì)算c(G10)(mg/ml)=A260x1.12x9600/344580,其中1.12=樣品中鹽含量的校正系數(shù)9600=寡核苷酸G10的分子量344580=寡核苷酸G10的比摩爾吸光系數(shù)。包裝的寡核苷酸GIO的量一般為0.2mg/mgQ[3外殼蛋白。Q[3G10VLP的G10含量和包裝反應(yīng)的收率計(jì)算如實(shí)施例8所述通過VLP的裝配/重裝配將聚集的G10包裝到Q(3VLP內(nèi)。加入953mgG10寡核香酸用于與4000mg純化的Q(3二聚體重裝配。該反應(yīng)產(chǎn)生每100pg蛋白質(zhì)包含20ligG10寡核苷酸的Q(3G10(蛋白質(zhì)含量通過Bradford分析或HPLC測(cè)定)。包裝反應(yīng)的G10收率為63%,蛋白質(zhì)收率為75%。實(shí)施例10通過滲濾裝配Q(3G10和收率的測(cè)定純化的QP外殼蛋白基本如實(shí)施例8所述獲得。20mM磷酸鈉pH7.2,250mMNaCl中的外殼蛋白與水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G10寡核苷酸(基本如實(shí)施例1所述制備；解聚的G10的相對(duì)峰開始時(shí)間為135%,聚集的G10的相對(duì)峰開始時(shí)間為88%)的儲(chǔ)備液混合?；旌衔锏捏w積為1.6L,成分的終濃度為2.5mg/ml外殼蛋白、l,OM尿素、250mMNaCl、2.5mMDTT和0.6mg/mlG10。然后使用30kDa截止值的柱(PelliconMini2，0.11112過濾面積，Millipore)和384L/(h*m2)的橫向流速和9617(11*1112)的滲透流速，在室溫下相對(duì)于9.6L20mM磷酸鈉250mMNaClpH7.2滲濾該溶液。加入11202至2mM的終濃度，并在室溫下溫育該溶液1小時(shí)，以誘導(dǎo)二硫鍵的形成。然后使用300kDa截止值的柱(PelliconMini2,0.11112過濾面積，Millipore)和3001/(h^m"的橫向流速和1001/(11*1112)的滲透流速，將溶液相對(duì)于16L20mM磷酸鈉150mMNaClpH7.2滲濾，以從裝配的Q卩GIO產(chǎn)物中除去過量的11202和未包裝的G10寡核苷酸。通過切向流過濾將產(chǎn)物濃縮為2.5mg/ml并且通過0.22濾器過濾。主要的過程步驟總結(jié)在表l中。表l'.QPG10的裝配和純化的過程步驟總結(jié)過程步驟參數(shù)過程步驟輸出G10的解聚G10濃度260|_iMNaOH濃度25mM溫度50°C加熱時(shí)間70分鐘規(guī)模.1gG10，V=440ml(10ml等份)G10的相對(duì)峰開始時(shí)間138%解聚的G10溶液的中和l吏用的酸0.5MH3PO4pH7.2G10溶解的再聚集G10濃度175|liMNa+濃度250mM溫度85°C加熱時(shí)間10分鐘規(guī)模1.1gG10,V=654ml(10ml等份)G10的相對(duì)峰開始時(shí)間88%原材料的融化溫度22。CQp二聚體溶液49<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>滲透流速<100l/(h*m2)V=1.21QbGlO的過濾0.22PES膜過濾器生物負(fù)擔(dān)減少產(chǎn)物的純度通過大小排阻層析法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)為99.28%，即,如實(shí)施例4所述進(jìn)行的層析中，QbG10峰占整個(gè)峰面積的99.28%。蛋白質(zhì)收率和寡核普酸收率如實(shí)施例8所述測(cè)定。整個(gè)過程中的蛋白質(zhì)收率為75%。整個(gè)過程中的寡核苷酸收率為75%。實(shí)施例11G10的聚集狀態(tài)對(duì)裝配過程的影響當(dāng)在如實(shí)施例8所述的裝配過程中使用相對(duì)峰開始時(shí)間為139%的G10時(shí)，只形成了^f及少量的GbGlO,無法分離到VLP產(chǎn)物。實(shí)施例12AP205和GA355VLP與G10通過解裝配/重裝配的包裝解裝配緩沖液A(5mMNaP04pH6.8，100mMNaCl，2mMMgCb)中的50-100mgAP205或GA355VLP(通過Bradford分析測(cè)定)與分另'J為1mg/ml和5U/ml的UNAseA(Sigma)和Benzonase(Novagen)于30。C溫育16小時(shí)。對(duì)于AP205VLP，在加入RNAseA和Benzonase之前，通過加入20mMDTT然后在37。C溫育30分鐘，進(jìn)行內(nèi)部二硫鍵的還原。在加入lMNaCl后，通過于70。C溫育15分鐘誘導(dǎo)病毒外殼蛋白的沉淀。沉淀的外殼蛋白通過于4。C以27,000g離心10分鐘沉積。棄去含有RNAseA、Benzonase和降解的核酸的上清液。將沉淀物重懸浮在緩沖液B(20mMNaP04pH7.2，6M尿素)中并且于室溫溫育10分鐘。通過陽離子交換層析純化外殼蛋白通過于4。C以27，000g離心10分鐘澄清溶液。棄去極少量的沉淀物，將含有解裝配的外殼蛋白的上清液加到用緩沖液B(20mMNaP04pH7.2,6M尿素)平衡的SP51SepharoseTMFF柱(16/20,AmershamBiosciences)上。棄去流過液。用緩沖液B(15CV)充分沖洗后，用從緩沖液B到緩沖液C(20mMNaP04pH7.2，1M尿素)的線性梯度調(diào)整柱子，梯度長度為37.5CV。在加樣、沖洗和洗脫過程中，監(jiān)測(cè)254nm和280nm的吸光度。外殼蛋白作為一個(gè)級(jí)分被緩沖液D(20mMNaP04pH6.5,1M尿素，300mMNaCl)洗脫下來，通過LDS-PAGE和隨后的考馬斯染色分析。將洗脫下來的蛋白質(zhì)級(jí)分作為"解裝配的外殼蛋白，，保存在4。C。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測(cè)定。重裝配:純化的AP205或GA355外殼蛋白以相對(duì)于G10寡核苷酸5倍過量的量(w/w)使用。外殼蛋白與G10寡核苷酸在含有1M尿素和2.5mMDTT的重裝配緩沖液中混合，并在室溫下溫育1小時(shí)。溫育后，重裝配混合物相對(duì)于5升PBS透析24小時(shí)。得到的懸浮液在4。C下以27，000g離心10分鐘。棄去極少量的沉淀物。上清液含有重裝配的和包裝的VLP。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測(cè)定，重裝配的和包裝的VLP用離心過濾裝置(AmiconUltra15,10KMWCO)濃縮。重裝配的和包裝的VLP的純化將最多25mg總蛋白質(zhì)加樣到用PBS平4軒的SepharoseTMCL-4B(26/60,AmershamBiosciences)上。在室溫下用平衡緩沖液以1.25ml/min的流速進(jìn)行大小排阻層析。在洗脫過程中監(jiān)測(cè)254nm和260nm處的吸光度。分離到兩個(gè)峰。高分子量主峰位于低表觀分子量小峰之前。主峰顯示的表觀分子量與如SE-HPLC顯示的純化的VLP—致。包裝有G10寡核苷酸的AP205或GA355VLP的分析基本如WO03/024481的實(shí)施例16(p.131ff)所述進(jìn)行。實(shí)施例13FRVLP和G10通過解裝配/重裝配的包裝解裝配:緩沖液A(5mMNaP04pH6.8,100mMNaCl，2mMMgCl2)中的50-100mgFRVLP(通過Bradford分析測(cè)定)與分別為1mg/ml和5U/ml的RNAseA(Sigma),口Benzonase(Novagen)于30°C溫育16小時(shí)。加入lMNaCl后，通過于70。C溫育15分鐘誘導(dǎo)FR外殼蛋白的沉淀。沉淀的外殼蛋白通過于4°C以27,000g離心10分鐘沉積。棄去含有RNAseA、Benzonase和降解的核酸的上清液。將沉淀物重懸浮在緩沖液B(20mMNaP04pH7.2,6M尿素)中并且于室溫溫育10分鐘。通過陽離子交換層析純化FR外殼蛋白通過于4。C以27，000g離心10分鐘澄清溶液。棄去極少量的沉淀物，將含有解裝配的外殼蛋白的上清液加到用緩沖液B平衡的SPS印haroseTMFF柱(16/20,AmershamBiosciences)上。棄去流過液。用緩沖液B(15CV)充分沖洗后，用從緩沖液B到緩沖液C(20mMNaP04pH7.2,1M尿素)的線性梯度調(diào)整柱子，梯度長度為37.5CV。在加樣、沖洗和洗脫過程中，監(jiān)測(cè)254nm和280nm的吸光度。FR外殼蛋白作為一個(gè)級(jí)分^t緩沖液D(20mMNaP04pH6.5，1M尿素，300mMNaCl)洗脫下來，通過LDS-PAGE和隨后的考馬斯染色進(jìn)行分析。將洗脫下來的蛋白質(zhì)級(jí)分作為"解裝配的外殼蛋白"保存在4°C。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測(cè)定。重裝配:純化的FR外殼蛋白以相對(duì)于G10寡核苷酸5倍過量的量(w/w)使用。FR外殼蛋白與G10寡核苷酸在含有1M尿素和2.5mMDTT的重裝配緩沖液中混合，并在室溫下溫育1小時(shí)。溫育后，重裝配混合物相對(duì)于5升PBS透析24小時(shí)。將得到的懸浮液在4。C下以27,000g離心10分鐘。棄去極少量的沉淀物。上清液含有重裝配的和包裝的FRVLP。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford分析測(cè)定，重裝配的和包裝的FRVLP用離心過濾裝置(AmiconUltra15，10KMWCO)濃縮。重裝配的和包裝的FRVLP的純化將最多25mg總蛋白質(zhì)加樣到用PBS平衡的SepharoseTMCL-4B(26/60,AmershamBiosciences)上。在室溫下用平衡緩沖液以1.25ml/min的流速進(jìn)行大小排阻層析。在洗脫過程中監(jiān)測(cè)254nm和260nm處的吸光度。分離到兩個(gè)峰。高分子量主峰位于低表觀分子量小峰之前。主峰顯示的表觀分子量與如SE-HPLC顯示的純化的FRVLP—致。包裝有Gl0寡核苷酸的FRVLP的分析基本如WO03/024481的實(shí)施例16(p.131ff)所述進(jìn)行。實(shí)施例14通過滲濾裝配QJ3G8和收率的測(cè)定純化的QP外殼蛋白基本如實(shí)施例8所述獲得。20mM磷酸鈉pH7.2,250mMNaCl中的外殼蛋白與水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G8寡核苷酸(基本如實(shí)施例3所述制備；解聚的G8的相對(duì)峰開始時(shí)間為113%,聚集的G8的相對(duì)峰開始時(shí)間為88%)的儲(chǔ)備液混合。混合物的體積為1.6L,成分的終濃度為1mg/ml外殼蛋白、l.OM尿素、250mMNaCl、2.5mMDTT和0.24mg/mlG8。然后使用30kDa截止值的柱(PelliconMini2，0.1012過濾面積，Millipore)和384L/(h*m2)的^f黃向流速和96L/(l^m"的滲透流速，在室溫下相對(duì)于9.6L20mM磷酸鈉250mMNaClpH7.2滲濾該溶液。加入H202i2mM的終濃度，并在室溫下溫育該溶液1小時(shí)，以誘導(dǎo)二硫鍵的形成。然后使用300kDa截止值的柱(PelliconMini2,0.11112過濾面積，Millipore)和3001/("m"的橫向流速和1001/(11*012)的滲透流速，將溶液相對(duì)于16L20mM磷酸鈉150mMNaClpH7.2滲濾，以便從裝配的Q卩G8產(chǎn)物中除去過量的11202和未包裝的G8寡核苷酸。通過切向流過濾將產(chǎn)物濃縮為2.5mg/ml并且通過0.22|am濾器過濾。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)包含寡核苷酸的核苷酸組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在溶液I中提供寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；并且其中所述溶液I具有堿性pH；(b)解聚所述寡核苷酸，其中所述解聚包括以下步驟(i)調(diào)節(jié)溶液I的溫度至溫度I，其中所述溫度I為4-70℃；(ii)在所述溫度I下在所述溶液I中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有高于110％的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iii)調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II，其中所述溫度II為0-70℃；(c)調(diào)節(jié)所述溶液I的pH至pH5-8；和(d)聚集所述寡核苷酸，其中所述聚集包括以下步驟(i)在溶液II中提供所述寡核苷酸，其中所述溶液II為pH5-8并且含有至少20mM陽離子，其中所述陽離子選自Na+、K+、NH4+、Li+、Ca2+和Mg2+；(ii)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度III，其中所述溫度III為50-99℃；(iii)在溫度III下在溶液II中溫育所述寡核苷酸，其中進(jìn)行所述溫育直到所述寡核苷酸具有50-110％的相對(duì)峰開始時(shí)間；和(iv)調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV，其中所述溫度IV低于50℃。2.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度I為45-70°C，優(yōu)選約50。C，最優(yōu)選50。C。3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度II低于溫度I,并且優(yōu)選地溫度II為0-25。C,最優(yōu)選0-2°C。4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度III為80-90。C,優(yōu)選約85。C，最優(yōu)選85。C。5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述調(diào)節(jié)所述溶液I的溫度至溫度II以至少3.6°C/min的變溫速度進(jìn)行。6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溫度IV為0-25°C,優(yōu)選0-2°C。7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述調(diào)節(jié)溶液II的溫度至溫度IV以至少3.6。C/min的變溫速度進(jìn)行。8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溶液I為pH8-13，優(yōu)選12。9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溶液I包含堿金屬的氫氧化物，優(yōu)選氫氧化鉀或氫氧化鈉，最優(yōu)選氫氧化鈉，其中所述氫氧化物的濃度為10mM-200mM,優(yōu)選約25mM，最優(yōu)選25mM。10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述調(diào)節(jié)所述溶液I的pH通過向所述溶液I中添加酸進(jìn)行，其中優(yōu)選地所述酸是磷酸。11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中進(jìn)行所迷溶液I的pH的所述調(diào)節(jié)直到所述pH為6-7。12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述陽離子為Na+或K+,其中優(yōu)選地所述陽離子為Na+。13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溶液II包含200-275mM的所述陽離子，優(yōu)選250mM。14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溶液I中的所述寡核苷酸的濃度為50jiM-2mM,最優(yōu)選260pM。15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述溶液II中的所述寡核苷酸的濃度為50juM-2mM,優(yōu)選100-300jaM,最優(yōu)選175jiM。16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中進(jìn)行所述寡核苷酸在溫度in下在溶液n中的所述溫育，直到所述寡核苷酸具有80-95%、優(yōu)選80-90%、更優(yōu)選83-90%、再更優(yōu)選85-90%、最優(yōu)選88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述寡核苷酸在其5'末端具有至少3個(gè)、最多15個(gè)鳥苷個(gè)體，在其3'末端具有至少3個(gè)、最多15個(gè)鳥苷個(gè)體。18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含回文序列，其中優(yōu)選地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQIDNO:l)，進(jìn)一步優(yōu)選地所述回文序列在其5，末端側(cè)翼為至少3個(gè)、最多15個(gè)鳥苦個(gè)體，并且其中所述回文序列在其3'末端側(cè)翼為至少3個(gè)、最多15個(gè)烏苷個(gè)體。19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含10-1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選10-200個(gè)核苷酸，更優(yōu)選10-100個(gè)核苷酸，再更優(yōu)選20-40個(gè)核普酸，最優(yōu)選30個(gè)核苷酸。20.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含選自下組的核酸序列(a)"G4-4"GGGGGACGATCGTCGGGG(SEQIDNO:2);(b)"G5-5"GGGGGGACGATCGTCGGGGG(SEQIDNO:3);(d)"G7-7"GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQIDNO:5);(e)"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6);(f)"G9-9"GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ1DNO:7);(g)"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8);00"G11"GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG(SEQIDNO:9)。21.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述寡核苷酸具有核酸序列"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6)。22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述寡核苷酸具有核酸NO:8)。23.—種包含寡核普酸的核苷酸組合物，其中所述核苷酸組合物通過權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法可以獲得，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有50-110%、優(yōu)選80-95%、更優(yōu)選80-90%、再更優(yōu)選83-90%、再更優(yōu)選85-90%、最優(yōu)選88%的相對(duì)峰開始時(shí)間。24.權(quán)利要求23的核苷酸組合物，其中所述寡核苷酸具有核酸序列"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6)或"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8)，其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有核酸序列"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8)。25.—種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供寡核苷酸，(i)其中所述寡核苷酸至少有一個(gè)polyG區(qū)段；且(ii)其中所述寡核苷酸具有50-110%的相對(duì)峰開始時(shí)間；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。26.—種生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，所述方法包括以下步驟(a)提供所述RNA噬菌體的外殼蛋白；(b)提供權(quán)利要求23或24任一項(xiàng)的核苷酸組合物；(c)產(chǎn)生混合物，其中所述混合物包含(i)所述外殼蛋白；(ii)能夠阻止所述外殼蛋白自裝配的試劑；(iii)所述寡核苷酸；(d)從所述混合物中除去所述試劑；和(e)讓所述外殼蛋白自裝配為病毒樣顆粒。27.權(quán)利要求25或26任一項(xiàng)的方法，其中所述外殼蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌體的重組蛋白或其片段組成。28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA噬菌體選白(a)噬菌體QP;(b)噬菌體R17;(c)噬菌體fr;(d)噬菌體GA;(d)噬菌體SP;(e)噬菌體MS2;(f)噬菌體Mll;(g)噬菌體MX1;(h)噬菌體NL95;(i)噬菌體f2;(j)噬菌體PP7;和(k)噬菌體AP205。29.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA噬菌體是30.權(quán)利要求25-28AP205。31.權(quán)利要求25-28fr。32.權(quán)利要求25-28GA。中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA噬菌體是中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA噬菌體是中任一項(xiàng)的方法，其中所述RNA噬菌體是33.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述外殼蛋白包含選自下組的序列或者優(yōu)選地由該序列組成0)SEQIDNO:10(Q(3CP);(b)SEQIDNO:10和SEQIDNO:ll(Q卩Al蛋白)的混合物；(c)SEQIDNO:12(R17外殼蛋白)；(d)SEQIDNO:13(fr外殼蛋白)；(e)SEQIDNO:14(GA外殼蛋白)；(f)SEQIDNO:15(SP外殼蛋白)；(g)SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的混合物；(h)SEQIDNO:17(MS2外殼蛋白)；(i)SEQIDNO:18(M11外殼蛋白)；(j)SEQIDNO:19(MX1外殼蛋白)；(k)SEQIDNO:20(NL95外殼蛋白)；(1)SEQIDNO:21(f2外殼蛋白)；(m)SEQIDNO:22(PP7外殼蛋白)；和(n)SEQIDNO:23(AP205外殼蛋白)。34.權(quán)利要求25-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述混合物中所述外殼蛋白的濃度為1-4mg/ml，優(yōu)選2.5mg/ml。35.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述混合物中所述寡核苷酸的濃度為25-100(iM,優(yōu)選62.5)liM。36.權(quán)利要求25-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述混合物中所述寡核苷酸和所述外殼蛋白的摩爾比為0.5-1.2,優(yōu)選0.7。37.權(quán)利要求31-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑包括選自尿素和鹽酸胍的變性化合物，其中優(yōu)選地所述變性化合物是尿素，進(jìn)一步優(yōu)選地所述混合物中所述尿素的濃度為0.25-7.2M,優(yōu)選1M。38.權(quán)利要求25-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑還包括還原劑。39.權(quán)利要求25-31和33-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述外殼蛋白包含能夠在所述病毒樣顆粒中形成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基，并且其中所述試劑還包括還原劑。40.權(quán)利要求38或39任一項(xiàng)的方法，其中所述還原劑是DTT,其中優(yōu)選地所述混合物中所述DTT的濃度為1-25mM，優(yōu)選2.5mM。41.權(quán)利要求25-40中任一項(xiàng)的方法，其中所述從所述混合物中除去所述試劑通過應(yīng)用第一緩沖液的第一緩沖液交換進(jìn)行，其中所述第一緩沖液包含氯化鈉，其中優(yōu)選地所述第一緩沖液中所述氯化鈉的濃度為0-1M，優(yōu)選0-550mM，更優(yōu)選0-350mM，再更優(yōu)選50-350mM,最優(yōu)選250mM。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述第一緩沖液交換通過膜進(jìn)行，其中所述膜的分子量截止值為1-50kD，優(yōu)選5-30kD,最優(yōu)選30kD。43.權(quán)利要求25-42中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括將所述病毒樣顆粒與氧化劑相接觸的步驟，其中優(yōu)選地所述氧化劑選白(a)過氧化氫，其中優(yōu)選地所述過氧化氫的濃度為0.25-50mM，優(yōu)選2mM;(b)氧；(c)谷胱甘肽；(d)Cu2+;和(e)Fe3+。44.權(quán)利要求25-43中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括純化所述病毒樣顆粒的步驟，優(yōu)選地所述純化包括使用第二緩沖液的第二緩沖液交換，其中所述第二緩沖液是藥學(xué)上可接受的緩沖液。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述第二緩沖液交換使用膜進(jìn)行，其中所述膜的分子量截止值為100-1000kD，優(yōu)選300kD。46.權(quán)利要求25-45中任一項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)收率為至少75%,和/或寡核苷酸收率為至少75%。47.通過權(quán)利要求l-24的任一種方法可以獲得的核苷酸組合物在權(quán)利要求26-45中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。48.包含(i)至少一個(gè)polyG區(qū)段且(ii)相對(duì)峰開始時(shí)間為50-110%的寡核苷酸在權(quán)利要求25-45中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。49.通過權(quán)利要求25-45中任一項(xiàng)的方法可以獲得的組合物，所述組合物優(yōu)選地包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒才羊顆4立內(nèi)。50.權(quán)利要求49的組合物，其中所述RNA噬菌體是噬菌體Q(3、噬菌體AP205、噬菌體fr或噬菌體GA,其中優(yōu)選地所述RNA噬菌體是噬菌體Q卩。51.權(quán)利要求49或50任一項(xiàng)的組合物，其中所述寡核苷酸具有核酸序列"G8-8"GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQIDNO:6)或"G10"GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQIDNO:8),其中優(yōu)選地所述寡核苷酸具有核酸序列"G10"52.權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物的純度為至少80%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少95%，再更優(yōu)選地至少98%,最優(yōu)選地至少99%。53.權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的組合物，其中所述寡核苷酸不會(huì)被DNAse水解。全文摘要本發(fā)明提供生產(chǎn)組合物的方法，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)包含適合在前述方法中使用的寡核苷酸的核苷酸組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過本發(fā)明的方法可以獲得的核苷酸組合物及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供組合物，該組合物包含(i)病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒，和(ii)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被包裝到所述病毒樣顆粒內(nèi)，其中所述組合物通過本發(fā)明的方法可以獲得，并且其中所述組合物優(yōu)選地具有至少98％、最優(yōu)選至少99％的純度。文檔編號(hào)C12N15/117GK101466720SQ200780021918公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日發(fā)明者K·普羅巴,M·金澤勒爾申請(qǐng)人:賽托斯生物技術(shù)公司