或至少20倍，來增強(qiáng)由具有纖 維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解。
[0045] β -葡糖苷酶：術(shù)語" β -葡糖苷酶"意指一種β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原性β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β -D-葡萄糖。
[0046] 出于本發(fā)明的目的，根據(jù)文丘里（Venturi)等人，2002,來自嗜熱毛殼菌嗜 奠變種的胞外β-D-葡糖苷酶：產(chǎn)生、純化以及一些生物化學(xué)特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:productio n, purification and some biochemical properties)，基石出微生物學(xué)雜志(J. Basic Microbiol. )42:55-66的程序使用對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為底物來測(cè)定 β-葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的β-葡糖苷酶定義為在25°C、pH 4.8下，在含有0.01% TWEEN? .20 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯）的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM 對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子。
[0047] 纖維二糖水解酶：術(shù)語"纖維二糖水解酶"意指一種1，4_β-D-葡聚糖纖維二 糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 91)，其催化纖維素、纖維寡糖、或任何含有β-1，4-連接葡萄糖的 聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從而從鏈的還原性或非還原性末端釋放纖維二糖 (泰里（Teeri)，1997,結(jié)晶纖維素降解：對(duì)纖維二糖水解酶的功能的新認(rèn)識(shí)（Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生 物技術(shù)趨勢(shì)（Trends in Biotechnology) 15:160-167;泰里等人，1998,里氏木霉纖維二糖 水解酶：對(duì)結(jié)晶纖維素為何如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊（Biochem. Soc. Trans. )26:173-178) 〇
[0048] 根據(jù)里弗（Lever)等人，1972，分析生物化學(xué)（Anal. Biochem. ) 47:273-279 ; 范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)（FEBS Letters)， 149:152-156 ;范?帝伯赫和克萊森斯（Claeyssens)，1985,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合 會(huì)快報(bào)，187:283-288 ;以及湯美（Tomme)等人，1988,歐洲生物化學(xué)雜志（Eur. J. Biochem.) 170:575-581所描述的程序來測(cè)定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，湯美等 人的方法可以用于測(cè)定纖維二糖水解酶活性。
[0049] 內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語"葡聚糖內(nèi)切酶"是指內(nèi)切-1，4-(1，3 ;l，4)-f3_D-葡聚糖 4_葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，它催化纖維素、纖維素衍生物（例如羧甲基纖維素和羥乙 基纖維素）、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合的β-1，3葡聚糖（例如谷物β-D-葡聚 糖或木葡聚糖）中的β -1，4鍵，以及含有纖維素組分的其他植物材料的內(nèi)切水解。
[0050] 可以通過測(cè)量底物粘度的降低或通過還原糖測(cè)定所確定的還原性末端的增 加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性（張（Zhang)等人，2006,生物技術(shù)進(jìn)展（Biotechnology Advan Ces)24:452-481)。為了本發(fā)明的目的，使用羧甲基纖維素（CMC)作為底物，根據(jù)在 Ghose，1987,純粹與應(yīng)用化學(xué)（Pure and Appl. Chem.) 59 :257-268 中所述的過程，在 pH 5、 40 °C下，確定內(nèi)切葡聚糖酶的活性。
[0051] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0052] 本發(fā)明涉及使用一種發(fā)酵生物，從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，例如，乙醇的方法。
[0053] 在第一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇的方法，該方法包括以下步 驟
[0054] i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項(xiàng)液化該含淀粉材料：
[0055] --種α -淀粉酶；
[0056] -任選地一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80°C /70°C下的相對(duì)活性的、超過 20 %的熱穩(wěn)定性值；以及
[0057] -任選地一種產(chǎn)碳水化合物源的酶；
[0058] ii)使用一種產(chǎn)碳水化合物源的酶進(jìn)行糖化；
[0059] iii)使用一種發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；
[0060] 其中在發(fā)酵過程中或同時(shí)糖化發(fā)酵過程中存在或添加一種纖維素分解組合物。
[0061] 步驟ii)和iii)可以依序或同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟ii)和iii) 同時(shí)進(jìn)行。該α-淀粉酶，任選的熱穩(wěn)定性蛋白酶，任選的產(chǎn)碳水化合物源的酶，優(yōu)選葡糖 淀粉酶，和/或，任選的一種支鏈淀粉酶可以在液化步驟i)之前和/或過程中添加。本發(fā) 明的組合物可以適當(dāng)?shù)赜糜诒景l(fā)明的方法中。然而，也可以分開添加這些酶。α -淀粉酶的 實(shí)例可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添加的α-淀粉酶部分中。熱穩(wěn)定性 蛋白酶的實(shí)例可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添加的蛋白酶部分中。適合 的任選的產(chǎn)碳水化合物源的酶的實(shí)例，優(yōu)選熱穩(wěn)定性產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是一種熱 穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添加的產(chǎn)碳水化合物源 的酶部分中。適合的任選的支鏈淀粉酶可以發(fā)現(xiàn)于下文的"液化過程中存在的和/或添 加的支鏈淀粉酶"-部分中。
[0062] 液化過程中的pH可以在4-7之間。在一個(gè)實(shí)施例中，液化過程中的pH是從 4. 5-5. 0,例如在4. 5-4. 8之間。在另一個(gè)實(shí)施例中，在高于5. 0-6. 5,例如在高于5. 0-6. 0， 例如在高于5. 0-5. 5,例如在5. 2-6. 2之間，例如約5. 2,例如約5. 4,例如約5. 6,例如約5. 8 的PH下進(jìn)行液化。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，溫度可以高于初始糊化溫度。術(shù)語"初始糊化溫度"指典型地通過加 熱，淀粉開始溶解的最低溫度。針對(duì)不同淀粉，該溫度可以變化。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施例中，液化步驟i)過程中的溫度范圍是從70-100°C，例如在75-95°C 之間，例如在75-90°C之間，優(yōu)選在80-90°C之間，例如在82-88°C之間，例如約85°C。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法在步驟i)之前進(jìn)一步包括以下步驟：
[0066] a)優(yōu)選地通過干式碾磨來減小含淀粉材料的粒度；
[0067] b)形成一種包含該含淀粉材料和水的漿體。
[0068] 該含淀粉起始材料（如全谷物）可以例如經(jīng)過碾磨減少粒度，以便展開結(jié)構(gòu)、增大 表面積并且允許進(jìn)一步加工。通常，存在以下兩種類型的方法：濕式和干式碾磨。在干式碾 磨中，整個(gè)谷粒被碾磨并且使用。濕式碾磨使胚芽與粗粉（淀粉顆粒和蛋白質(zhì)）良好分離。 濕式碾磨時(shí)常應(yīng)用于在例如糖漿的生產(chǎn)中使用淀粉水解產(chǎn)物的，場(chǎng)所。干式和濕式碾磨兩 者都是淀粉領(lǐng)域所熟知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選干式碾磨。在一個(gè)實(shí)施例中，該粒度被減少至 0. 05至3. 0mm、優(yōu)選0. 1-0. 5mm之間，或使得至少30%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、 甚至更優(yōu)選至少90%的含淀粉材料適合通過一個(gè)具有0. 05至3. Omm篩網(wǎng)、優(yōu)選0. 1-0. 5mm 篩網(wǎng)的篩子。在另一個(gè)實(shí)施例中，至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，尤其是至少 90%的含淀粉材料適合通過一個(gè)具有#6篩網(wǎng)的篩子。
[0069] 該水性漿體可以包含含淀粉材料的從10-55w/w_%干固體（DS)，優(yōu)選25_45w/ 界-%干固體（03)，更優(yōu)選3〇-4〇￥/\￥-%干固體（^)。
[0070] 該漿體可以加熱至超過初始糊化溫度，優(yōu)選至80-90°C之間，pH 4-7之間，優(yōu)選在 4. 5-5. 0之間或5. 0和6. 0之間，持續(xù)30分鐘至5小時(shí)，例如約2小時(shí)。
[0071] 該α -淀粉酶，任選的熱穩(wěn)定性蛋白酶，任選的產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn) 定性葡糖淀粉酶，和/或任選的支鏈淀粉酶可以初時(shí)添加到該水性漿體中以開始液化（稀 釋）。在一個(gè)實(shí)施例中，這些酶中僅有一部分被添加到該水性漿體中，而這些酶中的剩余部 分在液化步驟i)過程中添加。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明，液化步驟i)進(jìn)行0. 5-5小時(shí)，例如1-3小時(shí)，例如典型地約2小時(shí)。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施例中，該水性漿體在經(jīng)受步驟i)中的液化之前可以噴射蒸煮以進(jìn)一 步使該漿體糊化。該噴射蒸煮可以在ll〇_145°C之間，優(yōu)選120-140°C，例如125-135°C，優(yōu) 選約130°C的溫度下進(jìn)行約1-15分鐘，優(yōu)選進(jìn)行約3-10分鐘，尤其是約5分鐘左右。
[0074] 糖化與發(fā)酵
[0075] -種或多種產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶，可以是在糖化步驟ii)和/ 或發(fā)酵步驟iii)過程中存在的和/或添加的。該產(chǎn)碳水化合物源的酶優(yōu)選地可以是葡糖 淀粉酶，但還可以是選自下組的一種酶，該組由以下各項(xiàng)組成：β-淀粉酶、麥芽糖淀粉酶、 和α -葡糖苷酶。在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過程中添加的產(chǎn)碳水化合物源的 酶典型地與任選地在液化步驟i)過程中添加的任選的產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是熱穩(wěn) 定性葡糖淀粉酶不同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該產(chǎn)碳水化合物源的酶，特別是葡糖淀粉酶 是與真菌α -淀粉酶一起添加的。
[0076] 產(chǎn)碳水化合物源的酶（包括葡糖淀粉酶）的實(shí)例可以發(fā)現(xiàn)于下文的"糖化和/或 發(fā)酵過程中存在的和/或添加的產(chǎn)碳水化合物源的酶部分中。
[0077] 當(dāng)依序進(jìn)行糖化和發(fā)酵時(shí)，糖化步驟ii)可以在本領(lǐng)域中熟知的條件下進(jìn)行。例 如，糖化步驟ii)可以持續(xù)達(dá)從約24至約72小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行預(yù)糖化。預(yù)糖化 在30-65°C之間，典型地是約60°C的溫度下典型地持續(xù)40-90分鐘。在一個(gè)實(shí)施例中，在同 時(shí)糖化發(fā)酵（"SSF)中，預(yù)糖化之后是發(fā)酵過程中的糖化。糖化典型地在從20-75°C、優(yōu)選 地從40-70°C，典型地約60°C的溫度下并且在4與5之間的pH下、一般在約pH 4. 5下進(jìn)行。
[0078] 同時(shí)糖化發(fā)酵（"SSF"）廣泛地用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)方法中，尤其是乙 醇生產(chǎn)方法中。當(dāng)進(jìn)行SSF時(shí)，同時(shí)進(jìn)行糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)。不存在針對(duì)糖化 的保持階段，意指一起添加發(fā)酵生物（例如酵母）以及一種或多種酶。然而，還考慮了分開 添加發(fā)酵生物以及一種或多種酶。根據(jù)本發(fā)明，SSF可典型地在從25°C至