一組用于鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的特異性引物和探針及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組用于鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測(cè)的特異性引物和探針及相應(yīng)的定量PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus)是從健康人腸道分離出的一株乳桿菌，也是目前全 球研宄最多的益生菌之一。該菌能夠耐受動(dòng)物消化道環(huán)境，具有能夠在人和動(dòng)物腸道內(nèi)定 植，調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、提高機(jī)體免疫力和預(yù)防齲齒等功能特性。在 自然發(fā)酵的食品和一些發(fā)酵工業(yè)中，鼠李糖乳桿菌作為發(fā)酵劑可以抑制乳制品中霉菌生 長(zhǎng)，并在發(fā)酵時(shí)間、黏度感官等方面有所改善，延長(zhǎng)了產(chǎn)品的壽命。因此檢測(cè)鼠李糖乳桿菌 的含量對(duì)于檢測(cè)乳酸菌中有益菌含量，抑制發(fā)酵食品及乳制品中致病菌及腐敗菌的生長(zhǎng)作 用至關(guān)重要。
[0003] 乳桿菌種類多，表型相似，很難快速準(zhǔn)確區(qū)分，而傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法盡管使用不同的選 擇性培養(yǎng)基，但是對(duì)于乳制品或是動(dòng)物腸道中鼠李糖乳桿菌的鑒定和技術(shù)仍然存在問題。 傳統(tǒng)方法易受培養(yǎng)條件的影響，檢測(cè)效率有限，檢測(cè)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時(shí)耗 力，因此，迫切需要研宄建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)新方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其較 高的可重復(fù)性、靈敏性以及準(zhǔn)確性在微生物定量以及乳酸菌定量研宄領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0004] 實(shí)時(shí)焚光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性檢測(cè) 邁上量化的臺(tái)階，實(shí)現(xiàn)了 PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污 染的問題，它相對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)先進(jìn)、操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、絕對(duì)定量和快速檢測(cè)的 目的，同時(shí)具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合乳酸菌的檢測(cè)。采用乳 桿菌種特異性、定量檢測(cè)方法，可以簡(jiǎn)化益生菌的檢測(cè)程序、提高檢測(cè)效率，能提高我國(guó)益 生菌的檢測(cè)能力，完善保健食品的質(zhì)量監(jiān)管，并為益生菌產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一組用于鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物和 探針及相應(yīng)的定量PCR檢測(cè)試劑盒。能廣泛應(yīng)用于快速、靈敏、特異性好的檢測(cè)鼠李糖乳桿 菌。
[0006] 本發(fā)明提供一組用于鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物和探 針，所述引物和探針的核苷酸序列如下：
[0007] 上游引物：5 ' -GCGAATACGATTATCCTGGTGAT-3 ' ；
[0008] 下游引物：5 ' -AGGATCGCCTTCAAGTGCTTT-3 ' ；
[0009] 探針：5' -ATATTCCTGTTCTCCGCGGTTCTGCC-3' ；
[0010] 所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2。
[0011] 上述引物和探針的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述衍生序列包括引物序列 的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一至數(shù)個(gè)堿基得 到的序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述探針的5'端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM、TET、J0E、HEX或VIC，3'端標(biāo)記的 是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0013] 本發(fā)明還提供一種鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包 括權(quán)利要求1所述的引物和探針。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述試劑盒在定量檢測(cè)鼠李糖乳桿菌含量中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用為定量檢測(cè)益生菌酸奶、干酪中鼠李糖乳桿菌含量。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供鼠李糖乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，步驟如 下：⑴制備標(biāo)準(zhǔn)品：將鼠李糖乳桿菌延伸因子tuf保守基因片段插入到載體PMD18-T中， 獲得含有tuf保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述鼠李糖乳桿菌tuf保守基因 片段序列參見序列表中SEQ ID No. 1的第529-982位核苷酸序列；
[0017] (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；
[0018] (3)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對(duì)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反 應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；
[0019] (4)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行鼠李糖乳桿菌的快速定量檢測(cè)。
[0020] 優(yōu)選地，所述鼠李糖乳桿菌tuf保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的：
[0021] 上游引物為 5'-TTGAAAGCACTTGAAGGCGA-3' ；
[0022] 下游引物為 5' -TGGAGAAGAATGGCGTATGAC-3'。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（3)中所述引物和探針的用量均為1. 6 μ 1。
[0024] 優(yōu)選地，步驟（3)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2分鐘， 94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。
[0025] 本發(fā)明提供用于對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物和探針，通過提取待 檢測(cè)樣品的RNA，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確快速、 靈敏、特異性好、定量待測(cè)標(biāo)本中鼠李糖乳桿菌含量的目的。本發(fā)明所提供的引物和探針可 對(duì)乳制品中的鼠李糖乳桿菌含量進(jìn)行定性、定量分析，對(duì)判斷乳制品中鼠李糖乳桿菌活性 菌的含量具有重要意義，本發(fā)明將在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0026] 附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0027] 圖1為引物和探針體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a代表上下游引物1.6yL，探針 1. 6 μ L ;b代表上下游引物1. 6 μ L，探針0. 8 μ L ;C代表上下游引物2 μ L，探針0. 8 μ L ;d代 表上下游引物luL，探針1.6yL;e代表上下游引物lyL，探針1.0yL;f代表上下游引物 2 μ L，探針I(yè). 0 μ L ;g代表上下游引物1 μ L，探針0. 8 μ L ;h代表上下游引物1. 6 μ L，探針 1.0 yL ;i代表上下游引物2 yL，探針1.6 yL ;
[0028] 圖2為靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a代表質(zhì)粒濃度為1.00X 109C〇pieS/ml、b代 表質(zhì)粒濃度為1.0 OX l〇8copies/ml、c代表質(zhì)粒濃度為1.0 OX 107copies/ml、d代表質(zhì) 粒濃度為1.0 OX 106copies/ml、e代表質(zhì)粒濃度為1.0 OX 105copies/ml、f代表質(zhì)粒濃 度為1.0 OX 104copies/ml、g代表質(zhì)粒濃度為1.0 OX 103copies/ml、h代表質(zhì)粒濃度為 1.0 OX 102copies/ml ；
[0029] 圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為鼠李糖乳桿菌質(zhì)粒，未出現(xiàn) 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪 乳桿菌、保加利亞乳酸菌、嗜酸乳桿菌、卷曲乳酸菌、嗜酸乳酸菌、陰性對(duì)照；
[0030] 圖4為鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用引物、探針和所用序列測(cè)定工作均由生工生物工 程（上海）股份有限公司合成和完成。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為 自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0032] 實(shí)施例1 tuf基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0033] 要建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng) 包含高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。延伸因子（EF-Tu) tuf基因廣泛存在 于原核生物中，主要生物功能是在蛋白質(zhì)合成過程中負(fù)責(zé)肽鏈的延伸，tuf基因同16S rRNA 基因一樣具有保守性，也常作為乳酸菌分類及系統(tǒng)發(fā)育研宄的一個(gè)可靠標(biāo)記，但tuf基因 比16S rRNA的序列可變性強(qiáng)，同源率低，因此比較實(shí)用于親緣關(guān)系比較近的菌株之間的分 類研宄。本發(fā)明采用鼠李糖乳桿菌tuf作為靶序列。本部分主要采用PCR技術(shù)擴(kuò)增鼠李 糖乳桿菌tuf基因，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體pMDIS-T中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒 pMD18-T-Lrhtuf，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR鑒定和測(cè)序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標(biāo)準(zhǔn) 品，為下一步的方法及評(píng)估奠定基礎(chǔ)。
[0034] 一、模板DNA的制備
[0035] 提取鼠李糖乳桿菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株）基因組DNA，用作tuf基因 PCR擴(kuò)增的模板。步驟 如下：
[0036] (1)取Iml菌懸液，8000r/min離心5分鐘，棄上清液；
[0037] (2)加入10%蔗糖的TE緩沖液400 μ 1懸浮菌液沉淀，混勻后加入20mg/ml的溶 菌酶