利用實時熒光定量pcr技術(shù)獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥效檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用實時巧光定量PCR技術(shù)獲取多糖 類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，隨著養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，禽病的發(fā)生變得越來越復雜，靠疫苗和藥物已經(jīng) 不能阻止疫病的發(fā)生，如何增強家禽機體自身的免疫功能變的越來越重要。中藥免疫增強 劑是近年來研究與應用得比較多的中藥免疫制劑，中草藥主要通過對機體免疫器官發(fā)育的 促進效果，增加非特異性免疫和特異性免疫等，從而增強機體的免疫能力。中藥的免疫增強 作用與其活性物質(zhì)有關(guān)，多糖是許多中藥的主要免疫活性物質(zhì)，中草藥多糖是增強機體免 疫的物質(zhì)基礎(chǔ)，對促進和恢復機體免疫機能的效果最為明顯。目前對于中草藥多糖免疫增 強效果的檢測，主要依靠血清學試驗檢測抗體、動物回歸試驗檢測各項生活指標，如測定中 性粒細胞的吞隧功能、T淋己細胞轉(zhuǎn)化率等。運些方法繁瑣費時、靈敏度不高、工作量大、效 率低。
[0003] 實時巧光定量PCR(如anti化tive Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，W巧 光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對 待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。具有快速高效、靈敏度高、特異性強等特 點。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)有利用實時巧光定量PCR來獲取多糖類中藥對家禽 免疫增強作用中間信息的方法，因此建立巧光實時定量PCR檢測多糖類中藥對家禽免疫增 強作用的方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供利用實時巧光定量PCR技術(shù)獲取多糖類中藥對 家禽免疫功能增強作用中間信息的方法，從而解決上述【背景技術(shù)】中的問題。
[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0006] 利用實時巧光定量PCR技術(shù)獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的 方法，包括如下步驟：
[0007] (1)提取動物血液樣品的基因組RNA;
[000引 （2)將步驟(1)所得的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0009] (3)在巧光定量PCR反應體系中分別加入β-actin引物、化-巧I物（即白介素-2引 物）、步驟(2)得到的cDNAW及巧光染料反應液，混勻，進行PCR擴增；
[0010] (4)PCR擴增結(jié)束后，根據(jù)巧光實時定量PCR專用儀對結(jié)果進行分析，根據(jù)IL-巧口 β- actin基因的Ct值，通過相對Ct法即2-A AGt法，來計算IL-2基因 mRNA的相對表達量，所述IL-2 基因 mRNA的相對表達量即為多糖類中藥對動物免疫功能增強效果中間信息。
[0011] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知曉，化-2基因 mRNA的相對表達量，無法直接得出動物的健 康狀況。但是IL-2基因 mRNA的相對表達量卻在一定程度上反映了動物免疫系統(tǒng)的活度，對 于多糖類中藥是否對家禽免疫功能起到增強效果起到一定的指示作用。因此，通過實時巧 光定量PCR技術(shù)來檢測IL-2基因 mRNA的相對表達量，可W獲取多糖類中藥對家禽免疫功能 增強作用的中間信息。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明直接目的并不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只是對脫離動物 體的血液樣品進行處理或檢測，W獲取作為中間結(jié)果的信息和方法。獲取的中間信息能作 為反映多糖類中藥是否對家禽免疫功能具有增強作用及作用大小的輔助性手段。
[0013] 本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(1)中的動物血液樣品是指動物飼 喂多糖類中藥后獲取的離體血液樣品。
[0014] 本發(fā)明中，作為一種進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（1)中的動物血液樣品是指 雞飼喂多糖類中藥后的獲取的離體血液樣品。
[0015] 本發(fā)明中，作為一種進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述多糖類中藥包括黃巧多糖、香茹 多糖和構(gòu)杞多糖中的一種或幾種。
[0016] 本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(3)中，β-actin引物包括
[0017] β-actin 引物1:5 ' -GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3 ' 和 [001 引 β-actin引物2:5' -CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3'。
[0019] 本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(3)中，比-2引物包括
[0020] 比-2 引物 1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 ' 和
[0021] 比-2引物2:5'-AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3'。烙解曲線顯示，引物特異性良好，見 圖1。
[0022] 本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(3)中，所述巧光定量PCR反應體系 中β-actin引物、比-巧I物的濃度均為0.1~0.5皿ol/L;PCR擴增時變性溫度為94~95°C，反 應時間為Imin;退火溫度為58~ere,反應時間為Imin;循環(huán)數(shù)為35~45。
[0023] 本發(fā)明中，作為一種進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述巧光定量PCR反應體系中β- actin引物、化-巧I物的濃度均為0.2ymol/L;PCR擴增時變性溫度為95°C，反應時間為Imin; 退火溫度為60°C，反應時間為Imin;循環(huán)數(shù)為40。
[0024] 由于采用了 W上技術(shù)方案，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0025] 本發(fā)明提供的巧光實時定量PCR檢測方法操作簡單，具有較高的靈敏度、良好的特 異性，對獲取多糖類中藥對動物體的免疫增強作用的中間信息具有廣泛的適用性，輔助判 斷多糖類中藥對動物體的免疫增強效果。
[0026] 本發(fā)明提供的檢測方法可W通過獲取的中間信息對多糖類中藥對動物的免疫功 能增強作用進行輔助性的相對定量，可W比較不同中草藥免疫功能增強作用的大小，從而 篩選效果良好的中草藥應用于臨床。
[0027] 本發(fā)明提供的檢測方法反應條件溫和，擴增快速高效，化左右即可完成，不需要電 泳，與普通PCR相比更快速、靈敏，而且沒有污染。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實時巧光定量PCR反應中IL-2基因引物的烙解曲線。
[0029] 圖2為飼喂黃巧多糖后，實時巧光定量PCR檢測雞IL-2基因相對于對照表達量的變 化倍數(shù)。
[0030] 圖3為飼喂香茹多糖后，實時巧光定量PCR檢測雞IL-2基因相對于對照表達量的變 化倍數(shù)。
[0031] 圖4為飼喂構(gòu)杞多糖后，實時巧光定量PCR檢測雞IL-2基因相對于對照表達量的變 化倍數(shù)。
【具體實施方式】
[0032] 為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0033] 本實施例W如下的步驟為前提進行。
[0034] (1)提取動物血液樣品的基因組RNA，所述動物血液樣品是指雞飼喂多糖類中藥后 的獲取的離體血液樣品，而多糖類中藥則采用了黃巧多糖、香茹多糖和構(gòu)杞多糖中的一種；
[0035] (2)將步驟(1)所得的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0036] (3)在巧光定量PCR反應體系中分別加入β-actin引物、化-巧I物（即白介素-2引 物）、步驟(2)得到的cDNA W及巧光染料反應液，混勻，進行PCR擴增，其中，β-actin引物包括 β-actin引 物 l:5'-GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3'和β-actin引 物 2:5'- CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3 '，IL-2 引物包括化-2 引物1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 ' 和 比-2引物2:5 ' -AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3 '，所述巧光定量PCR反應體系中β-actin引物、 比-2引物的濃度均為0.1~0.5皿ol/MPCR擴增時變性溫度為94~95°C，反應時間為Imin; 退火溫度為58~ere,反應時間為Imin;循環(huán)數(shù)為35~45;
[0037] (4)PCR擴增結(jié)束后，根據(jù)巧光實時定量PCR專用儀對結(jié)果進行分析，根據(jù)IL-2基因 和β-actin的Ct值，通過相對Ct法即2-A AGt法，來計算IL-2基因 mRNA的相對表達量，所述IL-2 基因 mRNA的相對表達量即為多糖類中藥對動物免疫功能增強效果中間信息。
[0038] 為了證明本發(fā)明的效果，下述實施例進行了對比試驗。
[0039] 下述實施例中使用的實驗材料、試劑及引物：
[0040] TRI pure LS Reagent購于Invihogen公司；SYBR green real-time PCR mix購 于Toyobo公司；Reverse Transcription system貝勾自Promega公司。
[0041 ] 根據(jù)GenBank上公布的雞化-2基因序列用Primer 5軟件設(shè)計用于Real-time PCR 反應的引物，W持家基因 β-actin作內(nèi)參，具體序列如下：
[0042] β-actin 引物1:5 ' -GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3 '
[0043] β-actin 引物2:5 ' -CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3 '
[0044] IL-2 引物1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 '
[0045] IL-2 引物2:5 ' -AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3 '
[0046] 實施例一
[0047] 利用實時巧光定量PCR技術(shù)獲取多糖類中藥對家禽免疫功能增強作用中間信息的 方法，具體步驟為：
[0048] 1)取20只非免疫健康成年雞，隨機分為兩組。實驗組將黃巧多糖%劑量飼喂， 連續(xù)7天，對照組W生理鹽水代替。在停藥的第1(1、5(1、10(1、15(1、20(1、25(1、30(1分別屯、臟采取 抗凝血5ιΛ;
[0049] 2)利用TRI pure LS Reagent試劑盒提取血液樣品的基因組RNA;
[(Κ)加]3)按常規(guī)方法用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse化anscription System將提取的全血基 因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0051] 4)用T0Y0B0公司的SYBO膨Green Realtime PCR Master Mix(code No.QPK- 201)進行Real-time PCR，儀器為Applied Biosystems 7500Rea