Sels基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因的應(yīng)用，特別是涉及一種SELS基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和 預(yù)后的關(guān)鍵。目前，在我國(guó)肝癌的定性診斷仍以檢測(cè)血清AFP (甲胎蛋白）為主，呈現(xiàn)如下 特點(diǎn)：60%以上的肝癌病例血清AFP > 400 μ g/L ;目前還沒有其他腫瘤標(biāo)志物的特異性可 與AFP相媲美；AFP檢測(cè)較少依賴影像學(xué)設(shè)備和新技術(shù)。AFP是目前全球應(yīng)用最為廣泛的肝 癌腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年，其敏感性為40%~65%，特異性為76%~96%，如此的敏 感性和特異性均不令人滿意。因此，發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性高的新的腫瘤標(biāo)志物將是提高肝 癌早期診斷水平的關(guān)鍵。除AFP外，近年來用于肝癌檢測(cè)的其他血清標(biāo)志物還包括：甲胎 蛋白異質(zhì)體、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II (GGT- II)、堿性磷酸酶同工酶I、醛縮酶同工酶A (ALD-A)、巖藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、異常凝血酶原、鐵蛋白與酸性鐵蛋白等。AFP異 質(zhì)體和異常凝血酶原的應(yīng)用提高了肝癌患者的檢出率，但早期診斷和指導(dǎo)個(gè)性化治療的分 子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰(zhàn)。一般認(rèn)為以下四類生物分子常作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志 物：①癌胚和糖蛋白抗原；②酶和同工酶；③細(xì)胞因子；④基因。
[0003] 然而，關(guān)于人SELS基因在腫瘤的表達(dá)譜及與腫瘤發(fā)生的關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一 步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種SELS基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，使肝癌診 斷更加準(zhǔn)確、快速。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種SELS基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝 癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0006] 所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或基因 芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
[0007] 在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SELS基因的 引物。
[0008] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SELS基因的引物。其 中，用于制備用RT-PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌產(chǎn)品中的一對(duì)特異擴(kuò)增SELS基因的引物， 所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對(duì)的下 游引物序列具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其互補(bǔ)序列。
[0009] 所述用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與SELS蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克 隆抗體和單克隆抗體。
[0010] 所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與SELS基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與SELS基因的核酸序列雜交的探針。
[0012] 在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對(duì)SELS蛋白特異的抗 體。例如，將提純的人SELS基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。 同樣，表達(dá)人SELS蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā) 明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時(shí)制備。本發(fā)明的抗體包 括可以阻抑SELS功能的抗體，也可以是不影響人SELS功能的抗體。每一類抗體都可以通 過對(duì)人SELS基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人SELS基因產(chǎn)物及其片段可以用 重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的SELS基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以 利用在原核細(xì)胞例如E. coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如 糖基化或磷酸化SELS蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中 產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。
[0013] 在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述 探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可 以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至 60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信 號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿 基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15~25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)最好少 于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0014] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)SELS基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，因此，SELS基 因及其表達(dá)產(chǎn)物(蛋白產(chǎn)物）可作為診斷肝癌的特異性標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快 速。
【附圖說明】
[0015] 下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：
[0016] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中RT-PCR檢測(cè)SELS基因在20例肝癌病人中癌旁組織及 癌組織中的表達(dá)情況示意圖，其中，N指癌旁組織，C指肝癌組織。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
[0018] 實(shí)施例1RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SELS基因在肝癌組織中的表達(dá)情況
[0019] RT-PCR 是指將逆轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription ;RT)反應(yīng)和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合 在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或 定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及Sl核酸酶分析在內(nèi) 的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly (A)選擇性RNA。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR 可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA 的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。
[0020] 1、組織分離
[0021] 實(shí)驗(yàn)用組織來源于原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取 病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中（-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷 為最終依據(jù)。
[0022] 2、總核糖核酸（RNA)的抽提試劑盒
[0023] 抽提總核糖核酸（RNA)采用TRIZOL (Invitrogen),該試劑是基于酸性酚一步抽提 法生產(chǎn)的。TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí) 能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。 收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。用于抽提總核糖核酸（RNA)所用 的器皿和水均進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無核糖核酸酶的環(huán)境。
[0024] 3、核糖核酸（RNA)抽提步驟
[0025] RNA提取的一般步驟是：破碎組織一分離RNA -沉淀RNA -洗滌RNA -融解RNA - 保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎組織，加入β-ΜΕ可以抑制RNA酶活性。分離RNA -半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑， 加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA-般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA -般用乙 醇、3Μ NaAc (pH-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉， 此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解 RNA -般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的 樣品(如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存 更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中 提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的 降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲 酰胺中，存于_70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的 RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA :加入 NaAc 至 0· 3M，12, 000X g 離心 5 分鐘。
[0026] 4、cDNA 的合成
[0027] (1)冰浴離心管里面加入模板RNA4 μ L(1 μ g/ μ L)，隨機(jī)引物2 μ L(20pmol/ μ L)， 去離子水5 μ L，混勻，離心3-5秒；
[0028] (2) 70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對(duì)）；
[0029] (3)加入5XM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈緩沖液4 μ L(200U/ μ I)，RNase抑制劑 1 μ L (Ribonuclease Inhibitor，40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP2 μ L (2. 5mM，TaKaRa)(這些應(yīng)該先 配好，然后分再裝到每一管)，混勻；
[0030] (4) 37°C水浴5分鐘，加入1 μ L M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶（200U/ μ 1)，混勻；
[0031] (5) 37°C水浴1小時(shí)(此步是反轉(zhuǎn)錄過程）；
[0032] (6) 70°C、10分鐘結(jié)束反應(yīng)(此處是滅活酶活性，避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾)，產(chǎn)物 置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)，余下的-70°C保存。
[0033] 5、RT-PCR的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增
[0034] 理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物 可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)：典型的引物18到 24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能 性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配 對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。選擇GC含量為40%到 60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加 引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形 成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。避免3'末端富含