專利名稱：單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單花粉全基因組擴(kuò)增庫的制備方法，尤其涉及單花粉全基 因組擴(kuò)增庫的快速制備方法、試劑配方及技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)植物性細(xì)胞遺傳物質(zhì)的多次 分析。
背景技術(shù)：
花粉是植物的性細(xì)胞，其遺傳分離規(guī)律直接決定了雜種一代的性狀表 現(xiàn)。單花粉PCR檢測技術(shù)已經(jīng)在幾個(gè)物種上成功，但由于單個(gè)花粉分離和裂解的困難， 以及單花粉只含痕量遺傳物質(zhì)，PCR檢測只能做一次，不能重復(fù)檢測，限制了現(xiàn)有分子生物學(xué)技術(shù)在單花粉遺傳分析in染色體制圖上的應(yīng)用。而要對花粉進(jìn)行分子遺傳分析，如分子標(biāo)記，則需要對同一個(gè)單花粉進(jìn)行不同引物、多次PCR反應(yīng)，由于單個(gè)花 粉只含有痕量的DNA，進(jìn)行一次PCR反應(yīng)尚且困難，更不用說進(jìn)行多次PCR檢測?，F(xiàn) 有研究尚停留在如何進(jìn)行單個(gè)花粉PCR反應(yīng)。如能將單個(gè)花粉粒分離、裂解并進(jìn)行全 基因組復(fù)制擴(kuò)增，將單個(gè)花粉的DNA放大到上百萬倍，則問題就會迎刃而解。全基因 組擴(kuò)增技術(shù)(Whole Genome Amplification, WGA)是近年來發(fā)展起來的新型DNA復(fù) 制技術(shù)，它提供了一種從微量基因組DNA獲取大量遺傳信息的途徑，在人類遺傳分析 方面應(yīng)用較多(Blanco et al. 1989; Zhang et al. 1992; Esteban et al. 1993)， 尤其為法醫(yī)處理微量檢材提供了一個(gè)有用的工具，有關(guān)技術(shù)方面的詳細(xì)信息可訪問西 格瑪 (SIGMA ) 公司全基因組擴(kuò)增技術(shù)專業(yè)網(wǎng)站 http://www. sigmaaldrich. com/Life—Science/Molecular—Biology/PCR/Product—Li nes/Whole—Genome_Amplification.html。利用全基因組擴(kuò)增技術(shù)(WGA)制備單花粉 全基因組擴(kuò)增庫以實(shí)現(xiàn)對植物生殖細(xì)胞的遺傳分析，國內(nèi)外尚沒有同類研究報(bào)道。通過花粉粒群體研究親本的遺傳規(guī)律，關(guān)鍵在于建立單花粉PCR方法和實(shí)現(xiàn)單花 粉的多次分子檢測。由于花粉粒作為單倍體細(xì)胞本身只含有微量的DNA，比常規(guī)PCR 方法利用的模板含量低得多，所以單花粉PCR是一個(gè)限制因子；花粉粒非常小，又相 互粘連，使得分離單花粉粒成為另一個(gè)限制因子。另外，自然條件下花粉粒在花粉囊 裂解后只能存活幾分鐘(Fritz and Lukaszewski 1989; Khatun and Flowers 1995; Luna et al. 2001)。因此基于花粉活性的研究，取樣和遺傳分析的效率顯得很重要。 目前，應(yīng)用于花粉粒的PCR檢測技術(shù)還主要停留在PCR技術(shù)的驗(yàn)證性研究方面，少數(shù) 幾種植物的單花粉PCR檢測技術(shù)基本建立(Aziz and Sauve 2003; Li a丄1990; Matsunaga s丄1999; Parducci et a丄2005; Petersen " s丄1996; Zhang s丄1992)，但一?；ǚ壑荒軝z測一次，不能重復(fù)使用；花粉數(shù)量小，最多的一例只有60粒(Aziz^a丄2005)?？梢姡?dāng)前有關(guān)單個(gè)花粉分子檢測技術(shù)還無法實(shí)現(xiàn)對單個(gè) 花粉進(jìn)行分子遺傳分析。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，單花粉分離裂解后，即可直接進(jìn)行WGA擴(kuò)增，利用Phi29DNA聚合酶(Phi29DNA polymerase)的高保真全基因組DNA復(fù)制活性擴(kuò)增產(chǎn)生大量的全基因組DNA，為植物 單倍體細(xì)胞遺傳分析提供大量DNA模板。該方法能應(yīng)用于大批量單花粉收集并制備足 量全基因組DNA，為分析植物單倍體性細(xì)胞遺傳規(guī)律和通過單倍體染色體制圖創(chuàng)造首 要條件。本發(fā)明的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法，其特征在于由以下步驟組成1、 滴1-2滴染色液在載玻片上備用；將供試作物的花藥浸入染色液中，在顯微 鏡下用鑷子分離，取單個(gè)完整、干凈、未開裂的花藥，然后用鑷子挑破花粉囊壁，釋 放出花粉粒；染色后，將染色液排凈，用30mM滅菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花 粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整個(gè)操作過程在無菌環(huán)境中進(jìn)行；所述染色液組成成分 為0.7 raM苯胺磷酸氫二銨藍(lán)和30 mM蔗糖的水溶液；所述花粉粒的直徑》0. Olmm; 所述鑷子為顯微解剖鑷子DUMONT No. 11254-20。2、 分裝0.5W裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并離心，使裂解液沉于管 底；應(yīng)用鑷子直接在顯微鏡下分離著色的單個(gè)花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底 的裂解液中。所述裂解液的組成成分為終濃度0. 1M的NaOH與2%的Tween-20的水溶 液的混合液。裂解液的制備方法為各吸取欲配制終體積十分之一的1.0 M NaOH儲 備水溶液和終體積十分之一的20% Tween-20儲備水溶液混合，加入終體積十分之八 的滅菌雙蒸水混勻即為裂解液。3、 分裝5W礦物油于含裂解液和單個(gè)花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并 短暫離心；所述的短暫離心以8000轉(zhuǎn)/分離心，時(shí)間一般不超過10秒。4、 在PCR儀上裂解后用與裂解液等體積的TE緩沖溶液中和，成為裂解混合液； 所述TE緩沖溶液的組成成分為0. 1 M Tris-HCl和2 mM EDTA的水溶液的混合液。5、 每管中的裂解混合液分別全部作為一次反應(yīng)的模板直接進(jìn)行全基因組擴(kuò)增， 獲得單花粉全基因組擴(kuò)增庫。具體按照試劑盒Genomiphi DNA Amplification Kit(Amersham Biosciences Corp. 928 East Arques Avenue, Sunnyvale CA 94085 USA) 的說明書中提供的方法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增①向每管含單花粉的裂解混合液中加入 Sample buffer 9 41， 95°C保溫3 min，迅速放置冰上(0°C);②加入mix reactionbuffer 9 W;③加入Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase) 1W(冰上操作)，30°C保溫18 hrs: 65'C保溫10 min滅活，低溫保存，即得到單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，所得DNA量可供上百甚至更多次分析之用。染色液(0.7 mM苯胺磷酸氫二銨藍(lán)和30 raM蔗糖的水溶液)中的苯胺磷酸氫二銨藍(lán)主要是為了活細(xì)胞染色，30 mM蔗糖的水溶液主要是保持花粉粒滲透壓，避免破裂；原料純度要求分析純或以上；裂解液主要是為了溶解細(xì)胞，釋放基因組DNA;原料純度要求分析純或以上； 礦物油主要是為了減少裂解液蒸發(fā)，保持裂解液體積和各成分濃度；原料純度要求分析純或以上；TE緩沖溶液是為了中和裂解液，保持ra值原料純度要求分析純或以上； 試劑盒中各成分主要是為了全基因組復(fù)制擴(kuò)增。本發(fā)明的有益效果是，可以快速分離和裂解單個(gè)花粉，釋放出基因組DNA，直接 作為模板利用全基因組擴(kuò)增試劑盒將單個(gè)花粉的DNA復(fù)制擴(kuò)增出大量全基因組，經(jīng)稀 釋后可直接作為PCR分析的模板，沒有常規(guī)麗A提取純化方法的煩瑣過程，該方法操 作簡單、方便、快速，不影響檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)為1) 效率高到目前為止，由于顯微操縱器本身煩瑣的操作過程限制，單個(gè)試驗(yàn) 受試的花粉粒個(gè)數(shù)最多沒有超過60，分離單花粉粒效率很低；而應(yīng)用本發(fā)明的方法， 一個(gè)經(jīng)過培訓(xùn)的人每天可以進(jìn)行288個(gè)即3個(gè)96孔PCK板的單花粉的分離和WGA反 應(yīng)。而且，制一板花粉粒載玻片可供多次直接取樣使用，省去其它方法如花粉發(fā)芽培 養(yǎng)和保存等步驟;再者，花粉裂解液可直接作為WGA反應(yīng)模板使用，不用沉淀分離DNA， 進(jìn)一步提高了效率。2) 通用性強(qiáng)本發(fā)明方法可應(yīng)用于多種植物的單花粉WGA反應(yīng)，包括花粉直徑 很小的番茄。3) 操作簡便易行不需要昂貴的儀器，樣品制備簡單，不需要復(fù)雜DNA抽提和 預(yù)擴(kuò)增；操作過程簡便易行，沒有復(fù)雜和要求苛刻的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟。4) 穩(wěn)定性強(qiáng)根據(jù)花粉活性染色鑒定方法保證入選花粉粒均含有DNA模板；花 粉粒分離收集手段可靠；花粉粒裂解釋放DNA效果比發(fā)芽等其它方法更好。5) 實(shí)用性和可操作性強(qiáng)按照本發(fā)明方法， 一般的實(shí)驗(yàn)室都具備開展相關(guān)研究 的條件； 一個(gè)經(jīng)過培訓(xùn)的普通人員均可進(jìn)行試驗(yàn)操作。


圖1為本發(fā)明應(yīng)用顯微解剖鑷子在顯微鏡下分離單個(gè)花粉，以及花粉粒和鑷子尖端直徑尺寸的比較。圖中(A)甘蔗；(B)玉米；(C)青豆；(D)五節(jié)芒；(E)高粱；(F)番茄。測量尺采用OLYMPUS Objective Micrometer OB Ml/100 ， 圖中一格代表O.Olmm。圖2為本發(fā)明分離的六個(gè)物種單花粉粒用5S rDNA-ITS (ribosomal intergenic spacer)序列引物(Cox et al. 1992)進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物電泳檢查圖。泳道定義 La: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Catalog甜N2050);圖中泳道1、 3、 7、 11、 15、 19，負(fù)對 照(H20);泳道2，正對照(L03-378總DNA);泳道4至6，玉米；泳道8至10，高 粱；泳道12至14，五節(jié)芒；泳道16至18,青豆；泳道20至22，番茄。圖3為利用本發(fā)明中單花粉裂解液作模板制備的單花粉全基因組擴(kuò)增庫(以 HoCP02-618的單花粉粒為樣本)。泳道定義La: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Catalog #BN2050); 泳道l: 2pl 10 ng/ial入DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)，左圖泳道2-10: 2^1單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn) 物；右圖泳道2-10: 2jal稀釋100倍的單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4為本發(fā)明全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物用5S rDNA-ITS (ribosomal intergenic spacer) 序列引物(Cox et al. 1992)進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物電泳檢査圖。泳道定義La為DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(Catalog甜N2050);泳道1:滅菌雙蒸水作為PCR模板檢測結(jié)果；泳道2:未滅菌單蒸餾水作為PCR模板檢測結(jié)果；泳道3:暴露于空氣中雙蒸水作為PCR 模板檢測結(jié)果；泳道4: A DNA作為PCR模板檢測結(jié)果；泳道5:陽性對照(品種 HoCP02-618葉片DNA PCR檢測)；泳道6-10:單花粉WGA擴(kuò)增產(chǎn)物PCR檢測；泳道11: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Catalog #BN2050)具體實(shí)施方式
為充分公開本發(fā)明的單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法， 以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法，依序包括如下步驟1)、在生物安全柜中，滴l-2滴染色液在載玻片上；如圖1所示，在顯微鏡下用鑷子分離供試作物的完整、干凈、未開裂的花藥，將花藥浸入染色液中，用鑷子挑破花粉囊壁，釋放出花粉粒，染色20-40分鐘，用鑷子將染色液排凈，用滅菌的30mM蔗 糖的水溶液清洗留下的花粉粒，讓花粉粒完全干燥；所述供試作物如甘蔗、玉米、青 豆、五節(jié)芒、高梁、番茄……。2) 、分別吸取800 W滅菌雙蒸水，100 W 1M NaOH和100 W 20%Tween-20，置 于1. Oml離心管中，以8000轉(zhuǎn)/分離心1 min即制成裂解液；用8道取液器分裝0. 裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并離心使裂解液沉于管底；3) 、在顯微鏡下用鑷子挑選著色的單花粉粒并分別把著色的單花粉粒放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；4) 、用8道取液器分裝礦物油于含裂解液和單個(gè)花粉粒的96孔PCR板的PCR 管中，密封并短暫離心，即以8000轉(zhuǎn)/分離心，時(shí)間一般不超過10秒；5) 、在PCR儀上95。C保持17分30秒，取出迅速放冰上(在冰上進(jìn)行以下步驟)； 用8道取液器分裝0. 5W TE緩沖溶液加入含裂解液和單個(gè)花粉粒的96孔PCR板的PCR 管中，短暫離心；6) 、每管中的裂解混合液分別全部作為一次反應(yīng)模板直接按照試劑盒Genomiphi DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences Corp. 928 East Arques Avenue, Su皿yvale CA 94085 USA)的說明書中提供的方法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增①向每管含 單花粉的裂解混合液中加入Sample buffer 9 W,95°C保溫3 min，迅速放置冰上(0 °C);②加入mix reaction buffer 9 Pi;③加入Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase) l!4(冰上操作)，30°C保溫18hrs; 65。C保溫10 min滅活，置冰上； 得單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，即單花粉全基因組擴(kuò)增庫，如圖3所示，所得DNA量可 供上百甚至更多次分析之用；7) 、取1 W，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳測濃度；根據(jù)測定結(jié)果，調(diào)節(jié)全基因組擴(kuò) 增產(chǎn)物濃度至100ng/W到lPg/W，作為PCR反應(yīng)的模板；8) 、 PCR反應(yīng)成分混合液(20 W的反應(yīng)體系含2. 0 W IOXPCR反應(yīng)緩沖液，終 濃度3. 0 mM MgCl2， 0. 2 mM的dATP、 dTTP、 GTP和dCTP, 0. 25 的引物，0. 1% (W/V) 的BSA和1單位的Taq DNA聚合酶，以及的模板DNA (步驟7單花粉全基因組擴(kuò) 增產(chǎn)物)，用無菌雙蒸水調(diào)整終體積為20 W;所述引物序列為PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA]， PI I: [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA];實(shí)施 例中所列舉的六種作物，均使用同一種通用的引物，該引物為植物保守性序列，具有 植物通用性；使用同一引物也可顯示本發(fā)明通用性強(qiáng)；9) 、短暫離心，置于PCR儀上，PCR反應(yīng)參數(shù)為95。C保持5分鐘，循環(huán)參數(shù)為 93 。C 55秒，60 。C 10秒，72 。C 40秒，40個(gè)循環(huán)，最后72 。C延伸10分鐘。獲得PCR 產(chǎn)物，保持于4t:溫度下；10) 、步驟9)的PCR產(chǎn)物用電泳分離并在成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描拍照。步驟l)所用的鑷子的尖端直徑《0.01畫。步驟1)所述操作是在63倍的顯微鏡下進(jìn)行。所述的花粉染色20-40分鐘，是將 載玻片放入帶蓋的培養(yǎng)皿中于溫度為23-3(TC下培養(yǎng)；花粉粒用滅菌蔗糖液重復(fù)清洗的同時(shí)調(diào)整視野內(nèi)密度，花粉粒之間的距離以便于鑷子挑取為宜。上述"將載玻片放入帶蓋的培養(yǎng)皿中"在本發(fā)明中是在優(yōu)選溫度為28。C下培養(yǎng) 20-40分鐘。步驟1)所用的染色液是由0. 7 mM苯胺磷酸氫二銨藍(lán)和30 mM蔗糖配成的水溶液。步驟2)所述的1M NaOH和20% Tween-20儲備液的制備方法為用滅菌雙蒸水配 制1.0 M NaOH水溶液儲備液和20% Tween-20水溶液儲備液，4。C保存；由二者配制 的裂解液于使用前新鮮配制。所述的裂解液體積可依反應(yīng)個(gè)數(shù)多少增減，但裂解液中 NaOH的終濃度為0. 1M, Tween-20終濃度為2%。所述的步驟2)中使用的取液器可采用12道或8道取液器，96孔PCR板用錫箔 膠帶密封并離心使裂解液沉于管底；步驟2)和步驟4)中所述的短暫離心是自指在離心力為3000 g左右離心1分鐘；歩驟5)中所述的PCR板一般選用96孔PCR板，是放在PCR儀中且PCR儀的優(yōu)選 溫度控制為95°C，保持時(shí)間優(yōu)選為17分30秒；步驟6)所力口入的Sample buffer 、 mix reaction buffer禾口 Phi29 DNA polymerase 酶均系試劑盒(Ge畫iphi DNA Amplification Kit 25-6600-01)中的試劑成分；步驟8)所加入的PCR反應(yīng)成分混合液一般由1 XPCR反應(yīng)緩沖液，適宜量dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP, MgCl2，引物，模板DNA， Taq DNA聚合酶和H20組成；本發(fā)明所 使用的引物均為Cox等1992根據(jù)5S rDNA-ITS序列設(shè)計(jì)的引物，具體為PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA]， PII: [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992)。步驟9)短暫離心，置于PCR儀上，在優(yōu)選溫度為95t保持時(shí)間3-8分鐘進(jìn)行預(yù) 變性。步驟10)獲得的PCR產(chǎn)物用含0. 5 pg/ml溴化乙啶的1. 5%瓊脂糖進(jìn)行電泳分離 并在成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描拍照。本發(fā)明具有的特點(diǎn)為本發(fā)明應(yīng)用顯微解剖鑷子(DUMONT No. 11254-20， FineScience Tools USA, Inc., Foster City, CA， USA)在顯微鏡下分離單個(gè)花粉，在堿和表面活性劑溶液(終濃度0. 1M的Na0H，終濃度2%的Tween-20水溶液)中裂解后用TE緩沖溶液(O. 1 M Tris-HCl和2 mM EDTA水溶液)中和。裂解混合液直接作為模板在試劑盒Genomiphi DNA Amplification Kit方法中工作，得到單花粉全基因組，為分析植物單倍體遺傳規(guī)律和通過單倍體染色體制圖創(chuàng)造了首要條件。應(yīng)用這種方法， 一個(gè)經(jīng)過培訓(xùn)的人每天可以制備288個(gè)單花粉WGA反應(yīng)模板。該方法在六種可以 采集到花粉的植物即甘蔗、玉米、青豆、五節(jié)芒、高粱、番茄上驗(yàn)證成功，以甘蔗單 花粉為材料建立了單花粉全基因組快速擴(kuò)增制備技術(shù)，效果良好，該發(fā)明方法也可以 用于其它花粉的采集及PCR檢測。該方法大批量收集并制備單花粉WGA的能力為植物 遺傳分析和染色體制圖提供了 一種新途徑。單花粉分離的分子證明為證明上述方法對不同植物單花粉分離的可靠性，以生 物進(jìn)化中保守性強(qiáng)的5S核糖體間區(qū)序列5S rDNA-ITS(ribosomal intergenic spacer) 設(shè)計(jì)引物(Cox et al. 1992)，以0.5 pl裂解混合液(含一?；ǚ?加熱裂解后用 0.5 pl TE緩沖溶液中和溶液為PCR模板，設(shè)置對照，進(jìn)行PCR反應(yīng)檢查，引物序列 為 PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA] ， PII :[(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992); PCR反應(yīng)成分及終濃度分 別為50 mM KC1， 10 mM Tris. HC1 (pH 8. 3)， 3. 0 mM MgCl2，各0. 2 mM的dATP， dTTP, dGTP, and dCTP， 0.25 (^！的引物，0.1% (W/V) BSA禾Q 1單位的Taq酶。PCR儀上 95。C保持5分鐘，循環(huán)參數(shù)為93°C 55秒，60 °C 10秒，72。C40秒，40個(gè)循環(huán)，最 后72T延伸10分鐘。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢査，證明按照上述方法可以實(shí)現(xiàn)不同作 物單花粉的可靠分離，詳見說明書附圖2。單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的分子證明由于微量的任何DNA污染均可能作為上述 方法中Phi29 DNA polymerase酶的模板進(jìn)行擴(kuò)增。為證明上述方法的可靠性，以生 物進(jìn)化中保守性強(qiáng)的5S核糖體間區(qū)序列5S rDNA-ITS(ribosomal intergenic spacer) 設(shè)計(jì)引物(Cox et al. 1992)，以單花粉全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)置環(huán)境對照， 進(jìn)行PCR反應(yīng)檢査，引物序列為PI : [TGGGAAGTCCT (C/T) GTGTTGCA] ， PII : [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992); PCR反應(yīng)成分及終濃度分 別為50 mM KCl， 10 mM Tris. HC1 (pH 8. 3) ， 3. 0 mM MgC12，各0. 2 mM的dATP， dTTP， dGTP， and dCTP， 0.25 的引物，0.1% (W/V) BSA和1單位的Taq酶。95°C保持 5分鐘，循環(huán)參數(shù)為93。C 55秒，60°C 10秒，72°C 40秒，40個(gè)循環(huán)，最后72 °C延 伸10分鐘。經(jīng)電泳檢查，證明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是單花粉DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，上述方法可 以防止污染，詳見說明書附圖4。
權(quán)利要求
1、一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)滴1-2滴染色液在載玻片上備用；將供試作物的花藥浸入染色液中，在顯微鏡下用鑷子分離，取單個(gè)完整、干凈、未開裂的花藥，然后用鑷子挑破花粉囊壁，釋放出花粉粒；染色后，將染色液排凈，用30mM滅菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整個(gè)操作過程在無菌環(huán)境中進(jìn)行；所述染色液組成成分為0.7mM苯胺磷酸氫二銨藍(lán)和30mM蔗糖的水溶液；(2)分裝0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并離心，使裂解液沉于管底；應(yīng)用鑷子直接在顯微鏡下分離著色的單個(gè)花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；(3)分裝5μl礦物油于含裂解液和單個(gè)花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并短暫離心；所述裂解液的組成成分為終濃度0.1M的NaOH與2％的Tween-20水溶液的混合液；(4)在PCR儀上裂解后用與裂解液等體積的TE緩沖溶液中和，成為裂解混合液；(5)每管中的裂解混合液分別全部作為一次反應(yīng)的模板直接進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于所述花粉粒的直徑X).Olmm。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于裂解液于使用前新鮮配制。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制 備方法，其特征在于裂解液的配制方法為各吸取欲配制終體積十分之一 的1. 0 M NaOH儲備水溶液和終體積十分之一的20% Tween-20儲備水溶液 混合，加入終體積十分之八的滅菌雙蒸水，混勻。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于所述鑷子為顯微解剖鑷子DUMONT No. 11254-20。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法，其特征在于分離花粉是在63倍的顯微鏡下進(jìn)行。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制 備方法，其特征在于所述鑷子的尖端直徑《0.01mm。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于所述分裝O. 裂解液，其分裝方法為采用8道取液器 分裝0. 裂解液于96孔PCR板的PCR管中。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于所述分裝5 W礦物油，其分裝方法為采用8道取液器 分裝礦物油于含有裂解液和單花粉粒的96孔PCR板的PCR管中。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方 法，其特征在于分裝0.5W裂解液于96孔PCR板的PCR管中，然后用錫 箔膠帶密封96孔PCR板，并離心使裂解液沉于管底。
全文摘要
植物單花粉全基因組擴(kuò)增庫的快速制備方法，具體涉及植物單花粉的分離、快速裂解和全基因組復(fù)制擴(kuò)增。本發(fā)明的技術(shù)方案是在載玻片上將花粉染色、干燥，制備花粉粒玻片；應(yīng)用一種顯微解剖鑷子在顯微鏡下分離單個(gè)花粉，放入PCR管中，在堿和表面活性劑溶液中裂解后用TE緩沖溶液中和。裂解混合液直接作為模板在試劑盒Genomiphi DNA Amplification Kit方法中工作，將單個(gè)花粉的DNA復(fù)制擴(kuò)增出大量全基因組，該方法能應(yīng)用于大批量單花粉收集并制備全基因組，為植物單倍體遺傳規(guī)律分析和通過單倍體染色體制圖提供了一種新的途徑。
文檔編號C12P19/00GK101328491SQ20081007143
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者華 張, 徐景升, 潘永保, 王恒波, 蔡瀾峰, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 陳由強(qiáng), 高三基 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)