一種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種微流控芯片及其應(yīng)用，尤其涉及一種細(xì) 胞共培養(yǎng)微流控芯片及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤微環(huán)境對(duì)于腫瘤形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)是組織微環(huán) 境的一個(gè)共同特征，但目前神經(jīng)系統(tǒng)在腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展中的認(rèn)識(shí)仍較膚淺。已有報(bào)道，在動(dòng) 物模型中，在腫瘤內(nèi)及腫瘤周圍的高密度神經(jīng)生長(zhǎng)可以幫助癌癥的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。之前的研 宄也曾表明癌細(xì)胞有時(shí)候會(huì)沿著神經(jīng)迀移，但是對(duì)于其中具體的作用機(jī)制，科學(xué)家們尚不 十分了解。因此，建立腫瘤的神經(jīng)微環(huán)境的體外模型，不僅有利于闡明神經(jīng)在癌癥生長(zhǎng)和轉(zhuǎn) 移中的作用，而且有可能引導(dǎo)我們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療癌癥的新策略。
[0003] 細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)能有效地模擬體內(nèi)微環(huán)境，是目前細(xì)胞生物學(xué)的常用手段 之一。目前常用的細(xì)胞共培養(yǎng)裝置需要聯(lián)合使用昂貴的基質(zhì)膠（Matrix gel)以及 Transwell培養(yǎng)小室。目前最常見(jiàn)的神經(jīng)-癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系主要是將神經(jīng)元和癌 細(xì)胞分別接種于Matrigel?膠中，然后將這兩種細(xì)胞置于同一培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng) 和觀察(Ayala et al. , In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction!redefining perineural invasion in prostate cancer.The Prostate, 49 (3) : 213-23, 2001)。這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)裝置存在諸多缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，細(xì)胞分布 不均，難以精確的模擬體內(nèi)真實(shí)情況、操作難度大等。由于現(xiàn)有的共培養(yǎng)裝置存在的種種缺 陷，因此急需研發(fā)一種更加便捷、實(shí)用、直觀的細(xì)胞共培養(yǎng)裝置。
[0004] 近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展 現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。微流控芯片作為一種新型的研宄平臺(tái)，具有高密度、高通量、集成化、樣 品消耗量低、多重平行分析、便攜式、成本低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在生命科學(xué)研宄領(lǐng)域發(fā)揮著重要 的作用。比如圖案化細(xì)胞共培養(yǎng)，其采用將不同細(xì)胞選擇性地粘附在材料表面的不同區(qū) 域，來(lái)調(diào)控多種細(xì)胞之間的相互作用（Li et al.，A method for patterning multiple types of cells by using electrochemical desorption of self-assembled monolayers within microfluidic channels. Angew Chem Int Ed Engl. 46 (7) : 1094-6) 〇 特別是近年 來(lái)發(fā)展的區(qū)室化微流控芯片（microfluidic compartmentalized chip)，因其具有高度差 的區(qū)室化結(jié)構(gòu)，可以精確控制神經(jīng)突（樹(shù)突和軸突）的區(qū)域化定向生長(zhǎng)（Taylor et al.，A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods, 2 (8) : 599-605, 2005)，該技術(shù)為構(gòu)建神經(jīng)微環(huán)境提供可能，在神經(jīng)細(xì)胞生 物學(xué)中被廣泛采用。然而，利用類似的區(qū)室化微流控芯片同時(shí)完成神經(jīng)-癌細(xì)胞的植入共 培養(yǎng)及研宄其相互作用，并進(jìn)一步進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選研宄工作，在目前的應(yīng)用領(lǐng)域尚 處于空白階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片及其應(yīng)用，特別是一種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控 芯片及其應(yīng)用。通過(guò)該細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片可以構(gòu)建腫瘤的神經(jīng)微環(huán)境，為研宄腫瘤微 環(huán)境、神經(jīng)-癌癥相互作用的基本研宄以及抗腫瘤藥物的篩選提供了平臺(tái)。
[0006] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片，該微流控芯片包括培 養(yǎng)通道和微通道，所述培養(yǎng)通道通過(guò)微通道進(jìn)行連接，其中，所述培養(yǎng)通道的高度為 100-300 y m，所述微通道的高度< 5 y m。
[0008] 本發(fā)明采用含有兩層高度不同的嵌套微流控通道結(jié)構(gòu)，并對(duì)其中微通道的高度進(jìn) 行了特殊設(shè)計(jì)，使其高度控制在5 ym以內(nèi)。該高度設(shè)計(jì)保證了微通道只允許神經(jīng)突的生長(zhǎng) 和通過(guò)，有助于誘導(dǎo)神經(jīng)突的定向生長(zhǎng)，以便直觀地研宄在神經(jīng)微環(huán)境中神經(jīng)-癌細(xì)胞的 相互作用。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)采用將培養(yǎng)通道和微通道設(shè)置成上述特定的高度比，由于培養(yǎng)通道的 高度限制，中間的微通道只允許神經(jīng)突的生長(zhǎng)和通過(guò)，而神經(jīng)元胞體和癌細(xì)胞則被限制在 各自的培養(yǎng)通道中，從而形成區(qū)室化細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片。
[0010] 本發(fā)明中，所述培養(yǎng)通道的高度為100_300 ym，例如可以是100ym、110ym、 120 u m、130 u m、140 u m、150 u m、160 u m、170 u m、180 u m、190 u m、200 u m、220 u m、250 u m、 280 u m、300 u m，優(yōu)選為 150 u m。
[0011] 本發(fā)明中，所述微通道的高度< 5 um，例如可以是2 um、2. 2 um、2. 5 um、2. 8 um、 3 u m、3. 2 u m、3. 5 u m、3. 8 u m、4 u m、4. 2 u m、4. 5 u m、4. 8 u m、5 u m，1??? 5 u m。
[0012] 本發(fā)明中，所述培養(yǎng)通道的長(zhǎng)度為l_2cm，例如可以是lcm、l. lcm、l. 2cm、l. 3cm、 L 4cm、L 5cm、L 6cm、L 7cm、L 8cm、L 9cm、2cm〇
[0013] 本發(fā)明中，所述培養(yǎng)通道的寬度為l_3mm，例如可以是lmm、l. 2mm、l. 5mm、l. 8mm、 2mm、2. 2mm、2. 5mm、2. 8mm、3mm〇
[0014] 本發(fā)明中，所述微通道的長(zhǎng)度為300-500 um，例如可以是300 um、320 um、 350 u m、380 u m、400 u m、420 u m、450 u m、480 u m、500 u m。
[0015] 本發(fā)明中，所述微通道的寬度為3-5um，例如可以是3um、3. 2um、3. 5um、 3. 8 u m、4 u m、4. 2 u m、4. 5 u m、4. 8 u m、5 u m。
[0016] 本發(fā)明中，所述培養(yǎng)通道的間距為300-500 um，即為微通道的長(zhǎng)度，例如可以是 300 u m、320 u m、350 u m、380 u m、400 u m、420 u m、450 u m、480 u m、500 u m。
[0017] 本發(fā)明中，所述微通道的間距為10-20um，例如可以是10um、llum、12um、 13 u m、14 u m、15 u m、16 u m、17 u m、18 u m、19 u m、20 u m。
[0018] 本發(fā)明中，所述細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷（PDMS)材料。
[0019] 第二方面，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，所述方法采用如本發(fā)明第一 方面所述細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片。
[0020] 本發(fā)明中，所述細(xì)胞共培養(yǎng)的方法包括以下步驟：分別將神經(jīng)細(xì)胞和癌細(xì)胞通入 不同的培養(yǎng)通道，并誘導(dǎo)神經(jīng)突沿著微通道定向生長(zhǎng)，構(gòu)建神經(jīng)-癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
[0021] 優(yōu)選地，所述神經(jīng)細(xì)胞的密度為4\107-7父107(^11 8/1^，優(yōu)選為6\107(^118/111匕
[0022] 優(yōu)選地，所述癌細(xì)胞的密度為4X 106-7X 106cells/mL，優(yōu)選為6X 106cells/mL。
[0023] 優(yōu)選地，所述神經(jīng)細(xì)胞和癌細(xì)胞通入位于微通道兩側(cè)不同的培養(yǎng)通道。
[0024] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明中所述細(xì)胞共培養(yǎng)的方法包括以下步驟：
[0025] (1)制備神經(jīng)元的懸浮溶液，細(xì)胞密度為4X 107-7X 107cells/mL，恒溫培養(yǎng) 30-60min后，神經(jīng)元細(xì)胞貼壁在培養(yǎng)通道中，72-96h后，所述神經(jīng)元細(xì)胞被限制在培養(yǎng)通 道中，形成神經(jīng)元培養(yǎng)通道，并誘導(dǎo)神經(jīng)突沿著微通道定向生長(zhǎng)；
[0026] (2)制備癌細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為4X 106-7X 106cells/mL，恒溫培養(yǎng)6_8h 后，癌細(xì)胞貼壁在步驟（1)對(duì)面的培養(yǎng)通道中，所述癌細(xì)胞被限制在該培養(yǎng)通道中，形成癌 細(xì)胞培養(yǎng)通道；
[0027] (3)待神經(jīng)突生長(zhǎng)并達(dá)到對(duì)面的癌細(xì)胞培養(yǎng)通道時(shí)，揭去聚二甲基硅氧烷印章，在 開(kāi)放體系下觀察神經(jīng)-癌細(xì)胞的相互作用。
[0028] 本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)方法中，通過(guò)采用細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片，可以有效建立神 經(jīng)-癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，例如可以在微流控芯片兩側(cè)的培養(yǎng)通道中分別通入神經(jīng)元和癌細(xì) 胞，中間連接微通道，該微通道可以誘導(dǎo)神經(jīng)突的定向生長(zhǎng)，研宄在神經(jīng)纖維的引導(dǎo)下癌細(xì) 胞的迀移活動(dòng)，從而明確了神經(jīng)微環(huán)境中神經(jīng)-癌細(xì)胞的相互作用，為研宄腫瘤生長(zhǎng)和發(fā) 展提供了新思路。
[0029] 第三方面，本發(fā)明還提供了 一種藥物篩選的方法，該方法采用如本發(fā)明第一方面 所述細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片。
[0030] 有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0031] (1)本發(fā)明利用區(qū)室化微流控芯片技術(shù)來(lái)控制神經(jīng)突的定向生長(zhǎng)，模擬并構(gòu)建腫 瘤的神經(jīng)微環(huán)境，為研宄腫瘤微環(huán)境、神經(jīng)-癌癥相互作用的基本研宄提供了平臺(tái)，同時(shí)還 可以用于基于細(xì)胞和細(xì)胞之間作用的藥物檢測(cè)，用以篩選相關(guān)神經(jīng)藥物的抗腫瘤效果，為 發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的分析提供了新的途徑；
[0032] (2)本發(fā)明利用體外微流控芯片的研宄方法，便于觀察，設(shè)備簡(jiǎn)單，樣本和試劑用 量小，平行培養(yǎng)能力強(qiáng)，能更真實(shí)地反映人體腫瘤微環(huán)境中的神經(jīng)系統(tǒng)的作用，有利于觀察 細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，也有利于快速篩選新藥的療效和毒性，在細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤、藥 物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1是本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖2是基于微流控芯片的神經(jīng)元-癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型；
[0035] 其中，圖2-a表示微流控芯片中含有中間連接的微通道，圖2-b表示微流控芯片中 不含有中間連接的微通道；
[0036] 圖3表示癌細(xì)胞在有/無(wú)神經(jīng)突引導(dǎo)下的迀移情況；
[0037] 其中，圖3-a表示癌細(xì)胞在有神經(jīng)突引導(dǎo)下的迀移情況，圖3-b表示癌細(xì)胞在無(wú)神 經(jīng)突引導(dǎo)下的迀移情況，圖3-c表示癌細(xì)胞在有/無(wú)神經(jīng)突引導(dǎo)下的平均迀移距離比較；
[0038] 圖4表示癌細(xì)胞在有/無(wú)神經(jīng)損傷時(shí)的迀移情況；
[0039] 其中，圖4-a表示無(wú)神經(jīng)損傷時(shí)癌細(xì)胞的迀移情況，圖4-b表示用化學(xué)方法誘導(dǎo)神 經(jīng)纖維的損傷，癌細(xì)胞在24