專利名稱：細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，更具體而言，涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法和應(yīng)用該方法在細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
培養(yǎng)動物細(xì)胞，想要得到由該動物細(xì)胞產(chǎn)生的天然型蛋白質(zhì)的情況下，或者培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的動物細(xì)胞，以制備期望的蛋白質(zhì)等的情況下，除了鹽類、糖類、氨基酸類、以及維生素類等的基礎(chǔ)營養(yǎng)物之外，為了使該動物細(xì)胞增殖，通常將來源于哺乳動物的提取物、具體而言，在5～20％的范圍內(nèi)將胎牛血清等血清添加到培養(yǎng)基中。不過，所涉及的來源于哺乳動物的血清存在占培養(yǎng)基的成本的75～95％、且常因為品質(zhì)有批次間的差異不能獲得穩(wěn)定的增殖的缺點。此外，由于來自哺乳動物的血清不能用高壓滅菌器等設(shè)備滅菌，可能會被病毒或者支原體污染，盡管其中多數(shù)是無害的，但將成為附加于穩(wěn)定生產(chǎn)方面的重要的未知因素。此外，血清中含有500種以上的蛋白質(zhì)，由于這個原因，造成了從培養(yǎng)中的培養(yǎng)基分離、純化作為細(xì)胞產(chǎn)物的所期望的蛋白質(zhì)的復(fù)雜化。為了消除此類在穩(wěn)定生產(chǎn)上的問題，進行了使用胎球蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等的來源于血清的純化的蛋白質(zhì)以替代血清的方法。此外，從制備成本的觀點出發(fā)，也嘗試了使用從哺乳動物提取的培養(yǎng)基成分的方法。
不過，由于近年來對于來源于哺乳動物的成分，存在與瘋牛病(mad cow disease)、牛海綿狀腦癥(Bovine SpongiformEncephalopathyBSE)、傳染性海綿狀腦癥(TransmissibleSpongiform EncephalopathyTSE)、或者人海綿狀腦病(Creutzfeld-Jakob DiseaseCJD)等有關(guān)的擔(dān)心，所以從安全性的觀點出發(fā)，期望出現(xiàn)一種不含有這些來源于哺乳動物的成分的動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。
培養(yǎng)動物細(xì)胞的時候，如果不向使用的培養(yǎng)基中添加上述這樣的來源于哺乳動物的成分的話，將會發(fā)生下述問題在培養(yǎng)的早期細(xì)胞的生存率的顯著降低，培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)減少，因而不能進行長期培養(yǎng)或者大量培養(yǎng)。
為了解決上述問題，報道了向培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的方法(專利文獻1、2)。通過該方法，即使不用使用通常必須使用的胎牛血清，也可以高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
不過從制備成本的角度出發(fā)，優(yōu)選盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的情況，因此期待得到進一步的改良。
專利文獻1國際公開第99/63058號小冊子專利文獻2特開2003-334068號公報發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于，通過使用含有魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)，在細(xì)胞中高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
用于解決問題的方法本發(fā)明人等為了解決上述課題，進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)，能夠在細(xì)胞中以更高的產(chǎn)量產(chǎn)生期望的蛋白質(zhì)，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的內(nèi)容如下所示。
(1)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在用初始培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，并向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法中，向初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，用添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
(3)第(2)項中記載的培養(yǎng)方法，其中，使用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
(4)第(1)～(3)的任一項中記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
(5)第(4)項中記載的培養(yǎng)方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
(6)第(1)～(5)中任一項所記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是動物細(xì)胞。
(7)第(6)項中記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
(8)第(7)項中記載的培養(yǎng)方法，其中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
(9)制備方法，是使用初始培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，通過向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基以培養(yǎng)細(xì)胞的制造蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，在初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
(10)蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，用添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
(11)第(10)項中記載的制備方法，其中，用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
(12)第(9)～(11)中任一項記載的制備方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
(13)第(12)項記載的制備方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
(14)第(9)～(13)中任一項記載的制備方法，其中，細(xì)胞是動物細(xì)胞。
(15)第(14)項中記載的制備方法，其中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
(16)第(15)項中記載的制備方法，其中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
發(fā)明的效果在本發(fā)明中，通過不僅向在細(xì)胞的培養(yǎng)開始時的培養(yǎng)基中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物，還向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入魚肉的酶分解物或者魚肉提取物，能夠以更高的產(chǎn)量在細(xì)胞中生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)。
本說明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請、特愿2005-000747號的說明書以及/或者附圖所記載的內(nèi)容。


圖1是表示使用添加了5g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了30g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
圖2是表示用添加了15g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了75g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
圖3是表示用添加了5g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(初始培養(yǎng)基)以及添加了30g/L狐鰹水解物的不含來自哺乳動物成分的培養(yǎng)基(流加培養(yǎng)基)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體蛋白質(zhì)濃度(g/L)的圖。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施方式進行更詳細(xì)的說明。
在本發(fā)明中以初始培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，然后，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中至少一次加入流加培養(yǎng)基。此處，初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方添加有魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
此外，作為本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，使用添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，然后，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中至少1次加入魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
根據(jù)本發(fā)明，即使不在目前通常作為動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基中添加來源于哺乳動物細(xì)胞的成分，也能很好地進行細(xì)胞的培養(yǎng)。
通常，細(xì)胞培養(yǎng)的方法分類為分批法(batch culture)、連續(xù)法(continuous culture)、流加培養(yǎng)法(fed-batch culture)。本發(fā)明的方法中可以使用任何一種培養(yǎng)方法，但優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法或者連續(xù)法，特別優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法。
分批法是向培養(yǎng)基中加入少量的種培養(yǎng)液，在培養(yǎng)過程中添加新的培養(yǎng)基或者不排出培養(yǎng)液，使細(xì)胞增殖的培養(yǎng)方法。
連續(xù)法是在培養(yǎng)過程中連續(xù)地加入培養(yǎng)基，并且連續(xù)地使之排出的培養(yǎng)方法。需要說明的是，連續(xù)法也包含灌流培養(yǎng)。
流加培養(yǎng)法因為介于分批法和連續(xù)法之間，所以也稱為半分批法(semi-batch culture)，是在培養(yǎng)過程中連續(xù)地或者逐次地加入培養(yǎng)基，但不像連續(xù)法那樣地進行連續(xù)的培養(yǎng)液的排出的培養(yǎng)方法。流加培養(yǎng)的時候加入的培養(yǎng)基(以下稱為流加培養(yǎng)基)無需是和已經(jīng)在培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基(下面稱為初始培養(yǎng)基)相同的培養(yǎng)基，可以添加不同的培養(yǎng)基，也可以僅添加特定的成分。
本發(fā)明中初始培養(yǎng)基指的是通常在細(xì)胞培養(yǎng)的最初的階段所使用的培養(yǎng)基。不過在多次分開添加流加培養(yǎng)基成分的情況下，也可以將分別添加流加培養(yǎng)基之前的培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的方法中，采用流加培養(yǎng)法的情況下，可以在流加培養(yǎng)基或者初始培養(yǎng)基的任何一方中含有魚肉的酶分解物或者魚肉提取物，但優(yōu)選在流加培養(yǎng)基以及初始培養(yǎng)基二者中含有魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。此外，與初始培養(yǎng)基中的魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的濃度相比較，優(yōu)選流加培養(yǎng)基中的魚肉的酶分解物或者魚肉的提取物的濃度高。初始培養(yǎng)基中的魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的濃度通常在1～30g/L是適當(dāng)?shù)?，?yōu)選3～20g/L、更優(yōu)選5～15g/L。流加培養(yǎng)基中的魚肉的酶分解物或者魚肉的提取物的濃度通常在5～150g/L10～120g/L是適當(dāng)?shù)?，?yōu)選10～120g/L，進一步優(yōu)選20～90g/L，更優(yōu)選30～75g/L。培養(yǎng)之初的培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基的量之比沒有特別的限定，不過通常將培養(yǎng)之初的培養(yǎng)基的體積定為1的情況下，流加培養(yǎng)基為0.01～10，優(yōu)選0.1～1，進一步優(yōu)選0.2～0.3。流加培養(yǎng)基可以連續(xù)地進行添加，也可以逐次地添加。在逐次添加的情況下，對添加的次數(shù)沒有特別的限定，添加1次也可以，也可分成數(shù)次添加。
用于本發(fā)明的魚肉的實例紅肉魚的魚肉、如狐鰹、護衛(wèi)(frigate)鯖、金槍魚、鯖、太平洋竹刀魚、沙丁魚、馬(horse)錆、和鮭魚，和白肉魚的魚肉如、鱈魚、日本海刺鰭魚、右眼鮮魚、左眼鮮魚和海鯛科魚。優(yōu)選的實例是狐鰹、護衛(wèi)(frigate)錆、鱈魚、鯖魚、鮭魚和沙丁魚。
在本發(fā)明中使用的魚肉提取物可以通過例如、將上述魚肉切成適當(dāng)?shù)男K或者切碎成為糊狀，用熱水、例如90-95℃的熱水提取數(shù)十分鐘到數(shù)十小時得到可溶性成分。具體而言，可列舉狐鰹節(jié)制備時的狐鰹煮湯或者罐頭制備時的烹調(diào)污水(cook drain)等。
此外魚肉的酶分解物可以通過例如、將魚肉煮過后原封不動地、或者切碎成糊狀物、或者如上所述向得到的魚肉提取物中加入適量的水，根據(jù)需要加熱，使蛋白質(zhì)變性后，用蛋白質(zhì)分解酶處理，通過適當(dāng)?shù)碾x心分離或者過濾等操作除去油分或者不溶物而得到。可以將所說的魚肉提取物或者魚肉的酶分解物的pH調(diào)節(jié)到7-7.4左右使用。
作為蛋白質(zhì)分解酶，可以列舉蛋白酶和/或肽酶。本說明書中，蛋白酶這一用語指的是指以蛋白質(zhì)作為底物水解蛋白質(zhì)的酶，肽酶這一用語指的是將肽作為底物的肽鍵水解酶。即，可以通過蛋白酶對蛋白質(zhì)底物的活性為蛋白酶活性，對肽底物的活性為肽酶活性進行區(qū)分。蛋白酶這一用語用于通過對蛋白質(zhì)底物的蛋白酶活性催化肽鍵鏈之間的斷裂的情況，因此肽內(nèi)切酶在本說明書中作為蛋白酶的1種而使用。
具體而言，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等來源于植物的酶、以及來源于霉菌、細(xì)菌、酵母等的微生物的酶，可列舉出肽內(nèi)切酶、肽外切酶、氨肽酶、羧肽酶、二肽酶等酶等。這些酶可以單獨或者合并使用。合并使用的情況下，可以將其同時添加，也可以階段性地添加。
作為本發(fā)明中魚肉的酶分解物，優(yōu)選用上述的蛋白酶處理，然后用肽酶處理得到的魚肉的酶分解物。
酶處理根據(jù)所使用的酶的種類而不同，通常為pH2-12，優(yōu)選pH4-8，在30-90℃，優(yōu)選40-65℃的溫度下，進行30分鐘-72小時，優(yōu)選3-24小時。此時，酶的使用量為作為底物的蛋白質(zhì)的0.001-10W/W％、優(yōu)選0.1-1W/W％、進一步優(yōu)選0.2-0.6W/W％左右?？赏ㄟ^加熱等使上述得到的魚肉的酶分解物中的酶失活后，經(jīng)適當(dāng)?shù)剡M行離心分離或者過濾等操作，除去油分或者不溶物以制備酶分解物。
魚肉中包含魚的內(nèi)臟和真正的魚肉，內(nèi)臟和真正的魚肉的比例沒有特別的限定，可以使用任何比例，例如可以使用在特開2003-334068號中記載的比例。
作為在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基的其它的成分，可以適當(dāng)使用通常在細(xì)胞(優(yōu)選動物細(xì)胞)培養(yǎng)用培養(yǎng)基中使用的各成分，其中含有氨基酸、維生素類、脂類成分、能量源、滲透壓調(diào)節(jié)劑、鐵源、pH緩沖劑。除了上述成分以外，也可以添加例如微量金屬元素、表面活性劑、增殖輔助因子、核苷等。
具體而言，可例舉出含有下述物質(zhì)的培養(yǎng)基L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等、優(yōu)選L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等的氨基酸類，i-肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙酸酰胺、煙酸、對氨基苯甲酸、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等，優(yōu)選生物素、葉酸、硫辛酸、煙酸酰胺、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等的維生素類；氯化膽堿、酒石酸膽堿、亞油酸、油酸、膽固醇等、優(yōu)選氯化膽堿等的脂類物質(zhì)；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、優(yōu)選葡萄糖等能量源；氯化鈉、鹽化鉀、硝酸鉀等、優(yōu)選氯化鈉等的滲透壓調(diào)節(jié)劑；EDTA鐵、檸檬酸鈉鐵、氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸鐵、硫酸亞鐵、硝酸亞鐵等、優(yōu)選氯化亞鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等的鐵源類物質(zhì)；碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等、優(yōu)選碳酸氫鈉等pH緩沖劑。
除了上述成分以外，還可以添加例如硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞硅酸鈉等、優(yōu)選硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素；Tween80、普流尼克F68等的表面活性劑；以及重組胰島素、重組IGF、重組EGF、重組FGF、重組PDGF、重組TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視黃酸、鹽酸腐胺等、優(yōu)選亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF、鹽酸腐胺等的增殖輔助因子；脫氧腺嘌呤核苷、脫氧胞嘧啶核苷、脫氧鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷等核苷等。需要說明的是上述本發(fā)明的優(yōu)選例子中，還可以含有鏈霉素、青霉素G鉀以及慶大霉素等抗生素、酚紅等的pH指示劑。
培養(yǎng)基可以通過向市售的動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、例如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1∶1 Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle MediumNutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL301(JRH biosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培養(yǎng)基中添加魚肉提取物或者魚肉的酶分解物來制備。
本發(fā)明中對添加魚肉提取物或者魚肉酶分解物的培養(yǎng)基沒有特別的限定，可以使用任何培養(yǎng)基，不過優(yōu)選不含來源于哺乳動物的血清的無血清培養(yǎng)基，特別是優(yōu)選不含從哺乳類動物分離的來源于哺乳動物的成分的不含來源于哺乳動物的成分的培養(yǎng)基。
添加魚肉提取物或者魚肉的酶分解物的培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基或者不含來源于動物的成分培養(yǎng)基的情況下，通常對上述培養(yǎng)的細(xì)胞進行馴化，以使培養(yǎng)的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基或者不含來源于動物的成分培養(yǎng)基中也能繁殖發(fā)育。細(xì)胞的馴化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
另外，培養(yǎng)基中其它成分的含量的適當(dāng)?shù)姆秶?，氨基酸?.05-1500mg/L、維生素類為0.001-10mg/L、脂類物質(zhì)為0-200mg/L、能量源為1-20g/L、滲透壓調(diào)節(jié)劑為0.1-10000mg/L、鐵源為0.1-500mg/L、pH緩沖劑為1-10000mg/L、微量金屬元素為0.00001-200mg/L、表面活性劑為0-5000mg/L、增殖輔助因子為0.05-10000μg/L以及核苷為0.001-50mg/L，可以根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞的種類、期望的蛋白質(zhì)的種類等進行適當(dāng)確定。
培養(yǎng)基的pH根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞而不同，一般情況下pH為6.8～7.6，多數(shù)情況下pH為7.0～7.4是合適的。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法沒有特別的限定，可以在各種細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等)的培養(yǎng)中使用。例如，可以通過基因工程操作，培養(yǎng)重組了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的COS細(xì)胞或者CHO細(xì)胞、或者能夠產(chǎn)生抗體的小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等的以雜交瘤為代表的融合細(xì)胞。本發(fā)明的方法也可用于培養(yǎng)動物細(xì)胞，得到由該動物細(xì)胞產(chǎn)生的天然型蛋白質(zhì)的情況，除了上述細(xì)胞以外，還可以在BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等的培養(yǎng)中使用。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的動物細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的CHO細(xì)胞。期望的蛋白質(zhì)沒有特別限定，可以是由抗體(天然抗體、低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體等)、或生理活性蛋白質(zhì)(粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素、干擾素、IL-1或者IL-6等白細(xì)胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其中特別優(yōu)選抗體。
本發(fā)明的制備方法所生產(chǎn)的抗體不僅包含人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、猴子等來源于動物的單克隆抗體，還包含嵌合抗體、人源化抗體、雙特異抗體等人工改造的基因重組型抗體。此外，抗體的免疫球蛋白的類型沒有特別的限定，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任何一種類型，但作為藥物使用的情況下，優(yōu)選IgG以及IgM。此外，作為本發(fā)明的抗體，不僅包含完整抗體，而且還包含F(xiàn)v、Fab、F(ab)2等抗體片段、或者通過肽連接子結(jié)合抗體的可變區(qū)域的1價或2價以上的單鏈Fv(scFv、sc(Fv)2等)的低分子化抗體等。
培養(yǎng)條件根據(jù)使用的細(xì)胞的種類而不同，確定合適的條件即可。例如是CHO細(xì)胞時，通常可以在如下條件下進行培養(yǎng)氣體CO2濃度為0-40％、優(yōu)選在2-10％的氣體環(huán)境下，30-39℃、優(yōu)選37℃左右，培養(yǎng)1-14天時間。
另外，作為動物細(xì)胞培養(yǎng)用的各種的培養(yǎng)裝置可以使用例如發(fā)酵罐型罐培養(yǎng)裝置、氣升懸浮型培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)燒瓶型培養(yǎng)裝置、旋轉(zhuǎn)燒瓶型培養(yǎng)裝置、微載體型培養(yǎng)裝置、流動層型培養(yǎng)裝置、中空纖維型培養(yǎng)裝置、轉(zhuǎn)瓶型培養(yǎng)裝置、充填罐型培養(yǎng)裝置等進行培養(yǎng)。
采用本發(fā)明的方法，能夠通過培養(yǎng)細(xì)胞(優(yōu)選動物細(xì)胞)實現(xiàn)大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，可僅僅單獨對其進行培養(yǎng)，也可能存在必須進行特殊操作的情況，其操作或條件等可根據(jù)培養(yǎng)的動物細(xì)胞進行適當(dāng)?shù)臎Q定。例如通過基因工程操作，在含有編碼小鼠-人嵌合抗體的基因載體轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞中，在上述的條件下實施培養(yǎng)，能夠在1～14天、優(yōu)選7～10天左右，在培養(yǎng)基中得到期望的蛋白質(zhì)。這可以按照常規(guī)方法(例如參照例如，抗體工程導(dǎo)論，Chijin Sho Kan出版公司，第102-104頁；親合色譜原理與方法、Amersham PharmaciaBitech，第56-60頁)進行分離和純化，得到所需要的蛋白質(zhì)。
通過本發(fā)明，能夠高產(chǎn)量的制備重組抗體(天然抗體、抗體片段、低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異抗體等)、基因重組蛋白質(zhì)(粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素、干擾素、IL-1或者IL-6等的白細(xì)胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等。
實施例下面根據(jù)實施例以及參考例對本發(fā)明進行具體的說明。需要說明的是，這些實施例等只是用于說明本發(fā)明，并不限定本發(fā)明的范圍。
〔實施例1〕使用狐鰹水解物的流加培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成以及制備方法如下所述。
初始培養(yǎng)基向不含來源于哺乳動物成分的培養(yǎng)基中添加5g/L在參考例1中制備的狐鰹水解物，溶解后過濾滅菌。
流加培養(yǎng)基將初始培養(yǎng)基中使用的不含來源于哺乳動物成分的培養(yǎng)基成分調(diào)整到相對初始培養(yǎng)基為約2倍濃度，加入30g/L狐鰹水解物，溶解后過濾滅菌。
細(xì)胞是國際公開第2005/005636號小冊子記載的產(chǎn)生重組型抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM3人抗體(L612)的CHO細(xì)胞株。本抗體的分類是IgM。
向罐型細(xì)胞培養(yǎng)裝置中加入初始培養(yǎng)基，向其中加入上述CHO細(xì)胞株使之達到2×105個細(xì)胞/mL，在37℃、10％CO2的條件下開始培養(yǎng)。在流加培養(yǎng)中，從培養(yǎng)的第3天開始，以一定的流速進行流加培養(yǎng)基的流加操作，一直培養(yǎng)到第14天。在培養(yǎng)開始時以及第3、7、10、14天時取樣。針對各樣品的培養(yǎng)上清，測定通過分子排阻層析而得到的抗體蛋白質(zhì)濃度。如圖1所示，不進行流加的情況下的抗體蛋白質(zhì)濃度在培養(yǎng)到第10天時為0.6g/L左右。與此相對，如果流加含有狐鰹水解物的溶液，在培養(yǎng)到第10天時，能夠得到1.2g/L以上，在第14天時得到超過1.7g/L的很高的抗體蛋白質(zhì)濃度。
〔實施例2〕使用狐鰹水解物的流加培養(yǎng)培養(yǎng)基組成以及制備法如下所述。
初始培養(yǎng)基向不含來源于哺乳動物的成分的培養(yǎng)基中添加15g/L在參考例1中制備的狐鰹水解物，溶解后，過濾滅菌。
流加培養(yǎng)基將在初始培養(yǎng)基加入75g/L狐鰹水解物，使不含來自哺乳動物的成分培養(yǎng)基成分調(diào)整到相對初始培養(yǎng)基約4倍濃度，溶解后過濾滅菌。
細(xì)胞利用國際公開第92/19759號小冊子的實施例10記載的利用人延伸因子1α啟動子，按照特開平8-99902號公報的參考例2中記載的方法制備的產(chǎn)生人源化PM-1抗體(抗人IL-6受體抗體)的CHO細(xì)胞株。該抗體的分類是IgG1。
向罐型細(xì)胞培養(yǎng)裝置中加入初始培養(yǎng)基，在其中將上述的CHO細(xì)胞株分別按照下述條件進行培養(yǎng)進行流加的情況下使之為1×106個細(xì)胞/mL，不進行流加的情況下，使之為0.5×106個細(xì)胞/mL地加入，在37℃、10％CO2的條件下開始培養(yǎng)。在流加培養(yǎng)中，從培養(yǎng)第2天開始以一定流速進行流加培養(yǎng)基的流加操作，一直培養(yǎng)到第10天。在培養(yǎng)開始時以及第3、5、7、10天時取樣。對于各樣品的培養(yǎng)上清，測定使用蛋白質(zhì)A柱的親和層析得到的抗體蛋白質(zhì)濃度。如圖2所示，在不進行流加的情況下的抗體蛋白質(zhì)濃度在進行了7天的培養(yǎng)時，為0.5g/L左右。與此相對，如果流加含有狐鰹水解物的溶液，在進行了7天的培養(yǎng)時能夠得到1.1g/L以上、第10天時超過1.4g/L的高的抗體蛋白質(zhì)濃度。
〔實施例3〕使用狐鰹水解物的流加培養(yǎng)培養(yǎng)基組成以及制備法如下所述。
初始培養(yǎng)基向不含來源于哺乳動物的成分的培養(yǎng)基中添加5g/L在參考例1中制備的狐鰹水解物，溶解后過濾滅菌。使用不含狐鰹水解物的培養(yǎng)基作為比較對照。
流加培養(yǎng)基使不含來自哺乳動物的成分的培養(yǎng)基成分相對初始培養(yǎng)基為2倍濃度，加入30g/L狐鰹水解物，溶解后過濾滅菌。使用不含狐鰹水解物的培養(yǎng)基作為比較對照。
細(xì)胞用國際公開第2005/056604號小冊子中記載的方法制備的、產(chǎn)生MPL結(jié)合性單鏈(Fv)2(sc(Fv)2)的重組CHO細(xì)胞。
培養(yǎng)結(jié)果向罐型細(xì)胞培養(yǎng)裝置中加入初始培養(yǎng)基，在其中加入上述CHO細(xì)胞株使其達到3×105個細(xì)胞/mL，在37℃、10％CO2的條件下開始培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天開始將按照一定的流速進行流加培養(yǎng)基的流加操作，直至培養(yǎng)到第14天。培養(yǎng)過程中適當(dāng)取樣。對于各樣品的培養(yǎng)上清，使用與MPL的氨基酸序列中sc(Fv)2結(jié)合的部分，通過BIACORE法測定產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的濃度。
如圖3所示，在不含狐鰹水解物的流加培養(yǎng)中，蛋白質(zhì)濃度在培養(yǎng)到第14天時為450mg/L左右。與此相對，如果流加含有狐鰹水解物的溶液，能夠在培養(yǎng)到第14天時得到超過760mg/L的很高的蛋白質(zhì)濃度。
〔參考例1〕狐鰹的酶分解物的制備使用市售的狐鰹作為魚肉。向840kg切成碎肉狀的狐鰹中加入1200kg水，用3.2kg來源于植物的木瓜蛋白酶在pH6.0，65℃的條件下溫育1小時，進行酶分解。然后，以3.2kg來自霉菌的外肽酶再在上述條件下進行15小時的酶分解后，通過在95℃加熱使酶失活。之后離心分離，通過過濾除去不溶物、油分，濃縮制備魚肉(狐鰹)的酶分解物約150kg。
在本說明書中引用的全部出版物、專利以及專利申請直接作為參考引入到本說明書中。
產(chǎn)業(yè)上的可應(yīng)用性通過本發(fā)明可以在無需使用胎牛血清等昂貴且品質(zhì)差異大的蛋白質(zhì)的情況下，穩(wěn)定地培養(yǎng)細(xì)胞。此外，通過用本發(fā)明的方法培養(yǎng)細(xì)胞，能夠消除近年來令人困擾的諸如由異常朊病毒或者病毒等導(dǎo)致的污染的風(fēng)險等問題，提供高產(chǎn)量的生產(chǎn)安全的生物藥品的途徑。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在用初始培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，進一步向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法中，向初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
2.細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基中開始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
3.權(quán)利要求2記載的培養(yǎng)方法，其中，用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1～3中任一項記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4記載的培養(yǎng)方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
6.權(quán)利要求1～5中任一項所記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是動物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6記載的培養(yǎng)方法，其中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7記載的培養(yǎng)方法，其中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
9.制備方法，其是通過用初始培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)、向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次流加培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的制造蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，在初始培養(yǎng)基或者流加培養(yǎng)基的至少一方中添加魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
10.蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，在添加了魚肉的酶分解物或者魚肉提取物的培養(yǎng)基中開始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。
11.權(quán)利要求10記載的制備方法，其中，用流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。
12.權(quán)利要求9～11中任一項記載的制備方法，其中，細(xì)胞是導(dǎo)入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12記載的制備方法，其中，所期望的蛋白質(zhì)是抗體。
14.權(quán)利要求9～13中任一項記載的制備方法，其中，細(xì)胞是動物細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14記載的制備方法，其中，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15記載的制備方法，其中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用含有魚肉的酶分解物或魚肉提取物的培養(yǎng)基，使細(xì)胞高產(chǎn)量地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。還涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，用添加了魚肉的酶分解物或魚肉提取物的培養(yǎng)基開始細(xì)胞的培養(yǎng)，向正在進行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中再至少加入一次魚肉的酶分解物或者魚肉提取物。以及利用該培養(yǎng)方法，制備期望的蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12N5/10GK101061215SQ20058003954
公開日2007年10月24日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者后藤進, 岸下昇平, 田熊晉也, 平島親 申請人:中外制藥株式會社