專利名稱：一種病毒誘導蛋白Mig1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說是一種病毒誘導蛋白Migl及其應用。
背景技術：
近年來，隨著海水魚類養(yǎng)殖業(yè)集約式和工廠化快速發(fā)展，病害問題日益嚴重。病毒是養(yǎng)殖魚類病害的主要病原，其中虹彩病毒等 能感染多種魚類，造成危害嚴重的傳染性疫病。研究表明，病毒感染魚類后可誘發(fā)一系列機體免疫應答反應，包括產(chǎn)生各種天然免疫和獲得性免疫因子，如干擾素、Mx, viperin、各種干擾素刺激基因產(chǎn)物等，這些因子在不同程度上可協(xié)助機體抑制病毒的復制、粘附、釋放等過程，從而抵抗病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種病毒誘導蛋白Migl及其應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種病毒誘導蛋白Migl，病毒誘導蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。病毒誘導蛋白Migl的制備方法，I)質粒pMigl的構建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后與EcoRV酶切的質粒PID2用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒 pMigl ;所述 Fl 為 5’-GATATCGCCACCATGCAGAITTCAGGAAGA-3’，Rl 為 5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。病毒誘導蛋白Migl的應用，所述病毒誘導蛋白Migl用于制備抗病毒藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的病毒誘導蛋白Migl轉染細胞后能夠明顯提高細胞的抗病毒能力。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法I.質粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: ALaboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母轉化按Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS — PAGE)按照Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press2001o
3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。實施例I本發(fā)明的病毒誘導蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。序列表SEQID No. I 為:MQISGRVQSCCVALVFALTTASAVKQLKSIHDLKKINFGQTVPKHSLVLLHWFANVVNIDNNNIVRLTFNPNS⑶YGSHHYGNYEGLLDPPPPGQQYYTLGNLNQGSSELPDHVVHSQGEYAGRNLDRIILRVRNHNTGRQRLQRVYQVYITQHYAASENHGTMYDLHNTYCITTDLLRQIQEFSVGTDQQPLSALRDDFQSNADDFQLRHIKLSWGELACLALFLFIVIEDKYCPKRASKGPQRSVRNNIETDYAIDNKYHPKRASTEPQRSVRNNIQSHYVVEIPEHLLYSDDGIHLQVTTGTNGKARIIWNGVPQHRLENGAMVVLFRNNKDNEASSTYKYISNKESGSFDTSVPLNDGLQARLHKVRIKYCFWKVVGEEICRGPEFKNPQTATNIGNYGAKLQLFVKDGKACARLFVQKSFTEWRSEFVNSWVGFYTSSDKATNEYSffffQ
WQWAIKFKPNTDVKDFFYDVYDFHSELAIAPGVQARFMLSNKDVRATTISSWR(a)序列特征 長度507 類型氨基酸序列籲鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(C)假設否(d)反義否( e )最初來源半滑舌鰨結構特點該蛋白預期含有一個信號肽(氨基酸I 一 23)。實施例2病毒誘導蛋白Migl的細胞轉染I)質粒pMigl的構建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為94° C 60s預變性模板DNA,然后 94° C 40s, 50° C 60s, 72° C 60s, 5 個循環(huán)后改為 94° C 40s, 65° C60s, 72° C 60s，30個循環(huán)后再在72° C延伸反應7 — lOmin。PCR產(chǎn)物用天根的相應試劑盒純化。將表達載體PID2 (pID2構建過程參見Hu YH, Sun LA bivalent Vibrioharveyi DNA vaccine induces strong protection in Japanese flounder(Paralichthysolivaceus) · Vaccine 2011; 29:4328 — 33)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收6kb片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pMigl，由序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’ ;R1 為 5’ -GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。2)pMigl轉染頭腎白細胞制備半滑舌鰨頭腎白細胞(具體方法參見Sun J, Li Y, Sun L. Cynoglossussemilaevis thioredoxin: a reductase and an antioxidant with immunostimulatoryproperty. Cell Stress Chaperon.2012;17:445-55。將 I — 2 μ g 上述步驟 I)制備的 pMigl 或 pID2 (對照)用Lipofect (購于“天根生化科技(北京)有限公司”)轉染頭腎白細胞(具體方法參見HuY, Deng T,Sun L. The Rabl GTPase of Sciaenops ocellatus modulates intracellularbac terial infection. Fish Shellfish Immunol. 2011; 31:1005-12.)，獲得含有 pMigl的轉染子和含有PID2的對照轉染子。實施例3病毒誘導蛋白Migl的抗毒病作用將上述實施例2步驟2)的pMigl轉染子和對照轉染子置于含有L 一 15培養(yǎng)基(購于Thermo Scientific HyClone,北京)的96 —孔平板(每孔IO5個細胞),每孔加入IO6個虹彩病毒，25°C保溫4h。細胞用PBS洗3次。用絕對定量PCR方法(該方法具體參見=ZhangM, Xiao ZH, Hu YH, Sun L. Characterization of a megalocytivirus from cultured ·rockbream, Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege), in China. Aquae Res. 2012;43:556 -64)計算胞內(nèi)感染的病毒數(shù)。該實驗重復3次。結果表明，pMigl轉染子中的病毒平均數(shù)比對照轉染子中的病毒平均數(shù)低4. 5倍(顯著差異P〈0. 01)，說明病毒誘導蛋白Migl能夠顯著保護細胞抵抗病毒的侵染。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl, O. 02 % KCl, O. 358 %Na2HPO4. 12H20, O. 024% NaH2PO4,余量為水。
權利要求
1.一種病毒誘導蛋白Migl，其特征在于病毒誘導蛋白Migl為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.—種權利要求I所述病毒誘導蛋白Migl的制備方法，其特征在于 I)質粒pMigl的構建 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后與EcoRV酶切的質粒PID2用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質SpMigl ;所述 Fl 為 5’-GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’，Rl 為 5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。
3.—種權利要求I所述病毒誘導蛋白Migl的應用，其特征在于所述病毒誘導蛋白Migl用于制備抗病毒藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說是一種半滑舌鰨病毒誘導蛋白Mig1及其應用。病毒誘導蛋白Mig1為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。應用方法以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增Mig1基因，PCR產(chǎn)物連接表達載體后得質粒pMig1，將其轉染頭腎白細胞，得含有pMig1的轉染子。所述pMig1轉染子具有顯著增強的抗病毒能力。
文檔編號C12N15/70GK102875660SQ20121033540
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權日2012年9月11日
發(fā)明者孫黎, 汪瑋 申請人:中國科學院海洋研究所