所利用的第一層析和第二層析的代表例，可使 用例如蛋白A層析和陽離子層析的組合。
[0063] 在第一層析中，所使用的蛋白A層析的單體與凝聚體的分離性能低，分離的穩(wěn)定 性也不足，因此，通常選擇將作為靶分子的抗體或含F(xiàn)c分子的變性或凝聚抑制在最小限度 的同時可得到高回收率的溶出條件，而凝聚體等的除去由后段工藝來擔負。
[0064] 在選擇陽離子交換層析作為第二層析的情況下，一般而言以吸附洗脫模式進行凝 聚體或其它雜質(zhì)的除去，但需要將來自蛋白A載體的溶出液調(diào)整為適于陽離子交換層析吸 附的pH及離子強度，此外，凝聚體等的分離性能依賴于載樣量，在優(yōu)先分離的情況下，可以 對載樣量設(shè)置限制。因此，存在多種限制因素，而不能說可進行有效地進行凝聚體分離。
[0065] 另一方面，在使用本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)的情況下，通過具有兩種 配體的單體（monomer)與凝聚體的分離功能的協(xié)同作用，顯示出優(yōu)異的分離特性，此外，能 夠?qū)?個工序的層析操作縮短為1個工序，可以期待使用的緩沖液的種類及使用量、以及工 作時間的縮短。
[0066] 另外，本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)可通過在靶分子從抗體親和配體溶出 的狹窄的pH范圍（優(yōu)選為pH3?4,更優(yōu)選為pH3. 1?3. 9,進一步優(yōu)選為pH3. 2?3. 8) 內(nèi)，對離子強度（優(yōu)選為10?500mM，更優(yōu)選為15?400mM，進一步與優(yōu)選為20?350mM， 使用2種以上在上述范圍內(nèi)階段性增高鹽濃度的"逐步溶出"，或者使用在上述范圍內(nèi)梯度 性增高鹽濃度的"梯度溶出"）進行設(shè)定來得到單體含量高的溶出級分。特別是在單克隆 抗體的純化中，由于該溶出pH大幅偏離靶分子的等電點，因此，每個抗體的溶出離子強度 的幅度沒有較大的差異，可期待能夠在狹窄的范圍內(nèi)設(shè)定各種靶分子的使用條件。進而，在 使用修飾蛋白A配體作為抗體親和配體的情況下，除了可進一步狹窄地設(shè)定溶出pH范圍以 夕卜，還可以通過使用堿CIP (cleaning in place ;原位清洗）進行有效的清洗，因此，從構(gòu)建 穩(wěn)定的工藝的觀點考慮，優(yōu)選利用修飾蛋白A。
[0067] 通常用作混合模式分離基質(zhì)的、以由離子交換基和疏水基團構(gòu)成的合成化合物作 為配體的分離基質(zhì)，即使靶分子為單克隆抗體，由于疏水性及等電點的不同等，各靶分子的 使用條件的設(shè)定也不同，此外，特異性也較低，作為回收工序難以平臺化。
[0068] 另一方面，本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)在吸附時通過抗體親和配體可發(fā) 揮較高的特異性，此外，通過在抗體親和配體的溶出條件范圍內(nèi)設(shè)定離子強度，可容易地設(shè) 定其使用條件，從該方面考慮，比現(xiàn)有的混合模式分離基質(zhì)更優(yōu)異。
[0069] 更具體而言，關(guān)于本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)的使用方法，在中性附近 下吸附抗體等靶分子時，優(yōu)選添加一定濃度以上的陽離子交換基的抗衡離子來使用，在該 條件下，陽離子交換體的功能不發(fā)生作用，另外，即使發(fā)生作用，也可以通過更高離子強度 的清洗，來清洗除去源自其陽離子交換基的非特異性吸附物。另一方面，離子強度不阻礙抗 體親和配體的吸附，能夠以高特異性吸附目標物質(zhì)，此外，通過使用高離子強度的清洗液， 可有效地清洗除去非特異性地吸附于基材、連接基團、間隔基團、配體及靶分子的分子。
[0070] 通常，使重組單克隆抗體表達的培養(yǎng)上清液由于具有接近于人等的體液的離子強 度，因此，即使直接供于本發(fā)明的分離基質(zhì)也可維持較高的特異性，此外，還可通過更高離 子強度的清洗液進一步減少雜質(zhì)。
[0071] 另外，已知如下方法：在將抗體親和配體在分離基質(zhì)上固定化時，使用離子交換基 或疏水性官能團將該配體非共價鍵合于基材載體上且有效地聚集于基材載體上，以提高固 定化率（日本特開2011-256176)。對該方法而言，（1)從未伴有對凝聚體等的分離性能的改 善的方面考慮，本質(zhì)上與本發(fā)明不同，（2)從抗體親和配體聚集在基材載體上，未利用作為 本發(fā)明的另一配體的陽離子交換基的方面考慮，在制備原理上與本發(fā)明有明顯區(qū)別，（3)從 本發(fā)明的分離基質(zhì)具有對凝聚體的優(yōu)異的分離特性的方面考慮，在功能上也有明顯區(qū)別。
[0072] 本發(fā)明的分離基質(zhì)的特征在于，也可通過在固定化了抗體親和配體的抗體親和載 體上追加導(dǎo)入陽離子交換基來制備，且可與抗體親和配體的固定化相獨立地導(dǎo)入期望的離 子交換基。
[0073] 另外，一般已知在NHS活性化載體中導(dǎo)入抗體親和配體的方法，但通常在向經(jīng)NHS 活化的羧基導(dǎo)入蛋白質(zhì)性配體后，使羧基與胺等反應(yīng)而失活，因此，沒有有意地利用羧基的 功能的例子。因此，該一般方法與有意地導(dǎo)入陽離子交換基的本發(fā)明有明顯區(qū)別。在本發(fā) 明中，陽離子交換基的導(dǎo)入可以為抗體親和配體的導(dǎo)入的前后的任一種，關(guān)于配體的導(dǎo)入 方法，也并不限定于使用通過NHS等活化了的羧基。
[0074] 公開了一種將羧基有效地導(dǎo)入不溶性載體的方法及使用將導(dǎo)入的羧基活化了的 載體制備抗體親和分離基質(zhì)的方法（日本特開2010-133733、日本特開2010-133734)，但 NHS活化以后的方法與公知的使用NHS活化載體的親和配體固化方法沒有任何改變。本發(fā) 明為同時利用抗體親和配體和陽離子交換基來減少凝聚體等雜質(zhì)的新型的混合模式抗體 親和分離基質(zhì)及其使用方法，與以往使用NHS活化載體制備的抗體親和分離基質(zhì)有明顯區(qū) 別。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明制備的混合模式抗體親和分離基質(zhì)可通過抗體親和配體和陽離子交 換基的比率調(diào)節(jié)其功能。在抗體親和配體的結(jié)合容量比陽離子交換基的結(jié)合容量大的情況 下，存在酸性溶出時即使在低離子強度下抗體也可以從載體溶出的傾向，在抗體親和配體 的結(jié)合容量與陽離子交換基的結(jié)合容量為相同程度或較低的情況下，存在低離子強度時從 抗體親和配體溶出的抗體被較牢地保持在陽離子交換基上而抗體不易溶出的傾向，為了得 到更高的回收率，需要較高地設(shè)定溶出離子強度。在任一情況下均可通過調(diào)節(jié)離子強度來 控制回收率及其單體比率。
[0076] 基于抗體親和配體的抗體結(jié)合容量和基于陽離子交換基的抗體結(jié)合容量的比率 沒有特別限制，但在本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)中的靶分子（特別是抗體、更優(yōu) 選為人IgG或人源化單克隆抗體等IgG。）的溶出pH條件下，基于陽離子交換基的靶分子 (特別是抗體，更優(yōu)選為人IgG或人源化單克隆抗體等IgG)的動態(tài)結(jié)合容量優(yōu)選相對于抗 體吸附條件下（中性條件下）的基于抗體親和配體的靶分子（特別是抗體，更優(yōu)選為人IgG 或人源化單克隆抗體等IgG)的動態(tài)結(jié)合容量為2倍以下，更優(yōu)選為等量以下，特別優(yōu)選為 1/5以下。下限值例如可以為1/100以上，也可以為1/50以上。在基于陽離子交換基的抗 體結(jié)合量小的情況下，可較低地設(shè)定溶出離子強度，存在不需要利用后段的抗體純化工藝 進行脫鹽等處理的傾向，此外，溶出離子強度的設(shè)定幅度窄，工藝開發(fā)容易。
[0077] 利用本發(fā)明的混合模式親和分離基質(zhì)純化的靶分子為免疫球蛋白G及其類似物 (包含衍生物），一般而言除稱為抗體的分子以外，還包含將免疫球蛋白分子的恒定區(qū)域即 Fc區(qū)域與其它的功能性蛋白質(zhì)或肽融合而成的Fc融合蛋白質(zhì)（含F(xiàn)c分子）。這些可用作 抗體醫(yī)藥品的原料。
[0078] 以下，針對靶分子為免疫球蛋白G的情況對使用了本發(fā)明的混合模式抗體親和分 離基質(zhì)的純化方法的詳細說明進行例示，但本發(fā)明并不限定于此。
[0079] 使用有混合模式抗體親和分離基質(zhì)的靶分子（抗體）的純化大致由吸附工序、清 洗工序、離子強度調(diào)節(jié)工序、溶出工序這4個工序構(gòu)成，此外，還可以含有之后的再生工序 及/或CIP工序、再平衡化工序等用于再利用的工序。
[0080] 在吸附工序中，可使用一般的親和柱層析純化方法。即，在其一個例子中，將含有 免疫球蛋白G的蛋白質(zhì)溶液的pH調(diào)整為中性附近后，使該溶液通過填充有本發(fā)明的混合模 式抗體親和分離基質(zhì)的柱，經(jīng)由抗體親和配體將蛋白G特異性地吸附于分離基質(zhì)。例如在 將蛋白A作為抗體親和配體的情況下，其載樣pH優(yōu)選為6以上，更優(yōu)選為6.3以上且9以 下，進一步優(yōu)選為6. 5以上且8. 5以下。在由哺乳類培養(yǎng)細胞生產(chǎn)的免疫球蛋白G的純化 中，不需要特別調(diào)整離子強度，此外，也可預(yù)先提高離子強度而進一步抑制非特異吸附。
[0081 ] 在清洗工序中，使在抗體親和配體發(fā)揮作用的條件范圍內(nèi)的緩沖液適量通過來清 洗柱內(nèi)部。S卩，pH的優(yōu)選范圍也可以為與上述載樣時相同的范圍（中性附近的pH)，例如優(yōu) 選為6以上。此時，作為靶分子的免疫球蛋白G吸附于本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基 質(zhì)。此時，通過在中性附近的pH下將離子強度及組合物優(yōu)化，有時可有效地除去雜質(zhì)。在 載樣、清洗時，優(yōu)選陽離子交換基不發(fā)揮作用的條件，即，優(yōu)選利用中性附近的pH且具有一 定以上離子強度的清洗液，在該過程中，可清洗經(jīng)由該分離基質(zhì)及/或免疫球蛋白G而非特 異性地殘留于柱的雜質(zhì)。離子強度例如優(yōu)選為0. 2M以上，更優(yōu)選為0. 5M以上。
[0082] 在離子強度調(diào)節(jié)工序中，用中性附近且離子強度低的緩沖液置換柱，為在溶出時 基于陽離子交換基的離子強度依賴性溶出功能的發(fā)揮而準備。
[0083] 在溶出工序中，通過酸性pH、離子強度的組合，在從抗體親和配體溶出時，陽離子 交換分離模式發(fā)揮作用，在兩種配體的協(xié)同作用下，可將單體含量高的級分回收于低離子 強度溶出級分中。溶出液的pH可應(yīng)用免疫球蛋白G從抗體親和配體溶出的pH。該pH由于 以抗體親