混合模式抗體親和分離基質(zhì)和使用其的純化方法及靶分子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于將靶分子特異性地純化的親和分離基質(zhì)、特別是親和配體和 其它配體可同時(shí)或連續(xù)地在單一基質(zhì)上發(fā)揮作用的新型混合模式抗體親和分離基質(zhì)、使用 有該分離基質(zhì)的純化方法及靶分子。
【背景技術(shù)】
[0002] 親和配體具有與特定的分子特異性結(jié)合的功能，將該配體在水不溶性載體上固定 化而成的親和分離基質(zhì)可以用于從含有生物體成分或重組體的微生物及哺乳類培養(yǎng)細(xì)胞 中有效地分離純化有用物質(zhì)。作為實(shí)際工業(yè)上利用的抗體親和配體，例如可以舉出：由蛋白 A或蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它們重組表達(dá)而得到的功能性修飾體（類似物）構(gòu)成 的肽性或蛋白質(zhì)性配體、駱駝單鏈抗體（7夕久'--本鎖）或抗體的Fc受體等重組蛋白質(zhì) 性配體、及噻唑衍生物等化學(xué)合成性配體，用于抗體醫(yī)藥品等的純化。抗體醫(yī)藥品相對(duì)于化 學(xué)藥品顯示更低的毒性且顯示更高的特異性，因此，作為理想的醫(yī)藥品，其需求不斷增高。
[0003] 作為抗體醫(yī)藥品的主要成分的單克隆抗體主要使用哺乳類培養(yǎng)細(xì)胞等以重組蛋 白質(zhì)的形式在培養(yǎng)液中表達(dá)，通過(guò)多級(jí)層析或膜工序高純度純化后進(jìn)行制劑化。抗體醫(yī)藥 品為免疫球蛋白G及其類似物，一般而言除稱為抗體的分子以外，還包含將免疫球蛋白分 子的恒定區(qū)域即Fc區(qū)域和其它的功能性蛋白質(zhì)或肽融合而成的Fc融合蛋白質(zhì)（含F(xiàn)c分 子）。另外，這些抗體醫(yī)藥品還包含以微生物為宿主，在其培養(yǎng)上清液中分泌表達(dá)的醫(yī)藥品、 在菌體內(nèi)或菌體外壁和菌體細(xì)胞膜之間蓄積表達(dá)、純化、制劑化的醫(yī)藥品。
[0004] 該培養(yǎng)、純化、制劑化的工序中所形成或殘留的凝聚體（二聚體以上的多聚體）成 為副作用的主要原因，因此，降低其含量成為抗體醫(yī)藥品生產(chǎn)的重要課題。在此，所謂單體， 例如在抗體的情況下，將四聚體結(jié)構(gòu)的抗體定義為1個(gè)分子單位，所述四聚體結(jié)構(gòu)的抗體 具有下述構(gòu)成：由作為恒定區(qū)域的Fc區(qū)域和可變區(qū)域構(gòu)成的重鏈（H鏈）2分子以及由可變 區(qū)域構(gòu)成的氫鏈（L鏈）2分子構(gòu)成。該單位分子的多聚體形成凝聚體，成為抗體醫(yī)藥品的 副作用的主要原因。
[0005] 在培養(yǎng)、純化、制劑化的工序中通過(guò)使用復(fù)雜的管理方法及添加劑來(lái)嘗試對(duì)抑制 凝聚體的生成及其除去進(jìn)行控制。特別是在純化工序中，除抑制凝聚體的生成以外將其除 去也很重要。因此，在純化工序中，要求開發(fā)一種簡(jiǎn)便且有效的凝聚體除去技術(shù)。
[0006] 抗體醫(yī)藥品的純化工序中，利用特定單元操作的組合進(jìn)行的純化方法的模板化 (平臺(tái)化）不斷發(fā)展，在其初期純化工序（回收工序）中，廣泛利用將作為配體的蛋白A固 定化于水不溶性載體而成的抗體親和分離基質(zhì)（蛋白A載體）。一般而言使用在中性條件 下使抗體吸附于蛋白A載體，在酸性條件下使抗體溶出的方法，但在該溶出過(guò)程中暴露于 酸性條件下的抗體容易變性而形成凝聚體。一般而言，在蛋白A層析工序的后段，可通過(guò)離 子交換層析或疏水性相互作用層析等的組合除去凝聚體等雜質(zhì)（非專利文獻(xiàn)1、非專利文 獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)5)。
[0007] 然而，在蛋白A層析工序后凝聚體含量較多時(shí)，在后段的雜質(zhì)除去工序中導(dǎo)致目 標(biāo)單體（monomer)的收率降低，因此，除嘗試抑制蛋白A層析工序中的凝聚體形成以外，還 進(jìn)一步嘗試了除去該層析工序中的凝聚體。
[0008] 蛋白A層析工序通常進(jìn)行酸性溶出，但溶出pH越低，形成凝聚體的風(fēng)險(xiǎn)越高，因 此，對(duì)蛋白A配體進(jìn)行了施加蛋白質(zhì)工程學(xué)修飾的嘗試，使得需要pH3左右的較低pH溶出 的抗體也能夠在PH3. 5?4左右溶出（專利文獻(xiàn)1)。
[0009] 另外，在蛋白A層析工序的使用工序中，研宄了提高凝聚體的分離性的方法。即， 提出了一種溶出時(shí)的pH或離子強(qiáng)度的優(yōu)化、以及劃分溶出峰的前半部分和后半部分等的 方法。具體而言，是利用由于作為蛋白A載體的特性多聚體化而成的抗體分子以比未多聚 體化的抗體分子有更高的概率與蛋白A配體接觸，因此，解離常數(shù)稍微變低，且基于微調(diào)疏 水性的分離機(jī)制的方法（專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)4)。但是，這些方法難以進(jìn)行嚴(yán) 密的控制，此外，分離性能低，無(wú)法用作一般的分離方法。
[0010] 如上所述，抗體親和分離基質(zhì)雖然對(duì)抗體顯示較高的特異性且可達(dá)到高純度化， 但即使嚴(yán)密地設(shè)置使用方法，單體和凝聚體的分離性能也較低，因此，作為凝聚體的除去工 序存在限制。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn)
[0013] 專利文獻(xiàn)1 :日本專利第4391830號(hào)
[0014] 專利文獻(xiàn) 2 :W02008/085988
[0015] 專利文獻(xiàn)3 :日本特表2010-507583
[0016] 專利文獻(xiàn) 4 :W02010/019493
[0017] 專利文獻(xiàn) 5 :W02010/141039
[0018] 非專利文獻(xiàn)
[0019] 非專利文獻(xiàn) 1 :Hober S?等著，" J. Chromatogr. B"，2007 年，848 卷，40-47 頁(yè)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 2 :HLow D?等著，" J. Chromatogr. B"，2007 年，848 卷，48-63 頁(yè)
[0021] 非專利文獻(xiàn) 3 :Roque A.C. A?等著，" J. Chromatogr. A"，2007 年，1160 卷，44-55 頁(yè)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 發(fā)明所要解決的課題
[0023] 本發(fā)明的目的在于，提供一種新型分離材料和其分離方法，其中，在抗體或含F(xiàn)c 靶分子純化工序的第一層析工序中，可提高作為親和純化的主要目的的抗體自身的純度， 同時(shí)可提高單體的選擇分離特性，并且關(guān)于凝聚體除去，可降低對(duì)后段的雜質(zhì)除去工序的 負(fù)荷。
[0024] 用于解決課題的技術(shù)方案
[0025] 本發(fā)明人鑒于上述課題進(jìn)行了潛心研宄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在非水溶載體上將抗體 親和配體和陽(yáng)離子交換基（陽(yáng)離子交換配體）兩者固定化，各自的配體協(xié)同地作用，可得到 兼具對(duì)抗體等含F(xiàn)c靶分子的特異性吸附性能和優(yōu)異的凝聚體除去性能的分離基質(zhì)，完成 了本發(fā)明。
[0026] 即，本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)為在同一分離基質(zhì)中具有抗體親和配體 和陽(yáng)離子交換基的混合模式抗體親和分離基質(zhì)。
[0027] 另外，基于在靶分子的溶出pH條件下的陽(yáng)離子交換基的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量?jī)?yōu)選為基 于在中性條件下的抗體親和配體的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的2倍以下。
[0028] 進(jìn)而，優(yōu)選對(duì)具有抗體親和配體的分離基質(zhì)附加陽(yáng)離子交換基而成。
[0029] 另外，優(yōu)選對(duì)具有陽(yáng)離子交換基的分離基質(zhì)附加抗體親和配體而成。
[0030] 抗體親和配體優(yōu)選為選自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H、蛋白D、蛋白Arp、蛋白 FcyR、抗體結(jié)合性合成配體及它們的類似物中的至少1種，抗體親和配體優(yōu)選為選自蛋白 A、蛋白G、蛋白L及它們的類似物中的至少1種。
[0031] 另外，抗體親和配體優(yōu)選為選自蛋白A及它們的類似物中的至少1種。
[0032] 另外，陽(yáng)離子交換基優(yōu)選為含有選自羧基及硫酸基中的至少1種的配體。
[0033] 分離基質(zhì)的水不溶性載體基材優(yōu)選為選自碳水化合物及其衍生物、合成聚合物以 及玻璃中的至少1種，分離基質(zhì)的基材的結(jié)構(gòu)優(yōu)選為多孔性珠、整體柱或膜。
[0034] 進(jìn)而，本發(fā)明為一種靶分子的純化方法，其使用有所述混合模式抗體親和分離基 質(zhì)。
[0035] 靶分子的溶出pH優(yōu)選為6以下，靶分子的溶出pH進(jìn)一步優(yōu)選為2以上。
[0036] 靶分子優(yōu)選為免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含F(xiàn)c分子。
[0037] 另外，本發(fā)明為通過(guò)本發(fā)明的純化方法純化的靶分子。
[0038] 發(fā)明的效果
[0039] 根據(jù)本發(fā)明，在抗體等含F(xiàn)c靶分子純化工序的第一工序即親和層析工序中，可提 高作為親和純化的主要目標(biāo)的抗體自身的純度，同時(shí)可提高單體的選擇分離特性，并且可 降低對(duì)于后段的雜質(zhì)除去工序的負(fù)荷。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明的混合模式抗體親和分離基質(zhì)的特征在于，抗體親和配體和陽(yáng)離子交換基 一起通過(guò)共價(jià)鍵固定化于分離基質(zhì)（本說(shuō)明書中，也稱為水不溶性載體、載體）。
[0041 ] 本發(fā)明為在水不溶性載體中具有抗體親和配體和陽(yáng)離子交換基的混合模式抗體 親和分離基質(zhì)，因此，可使用預(yù)先將一方固定化的分離基質(zhì)來(lái)制備。即，可以在具有抗體親 和配體的分離基質(zhì)中導(dǎo)入陽(yáng)離子交換基，或在具有陽(yáng)離子交換基的分離基質(zhì)中將抗體親和 配體固定化?；蛘?，也可以在水不溶性載體中同時(shí)將兩配體固定化。
[0042] 以下，對(duì)本發(fā)明中的抗體親和配體、陽(yáng)離子交換基、水不溶性載體、抗體親和配體 及陽(yáng)離子交換基向載體上的結(jié)合（固定化）等詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。
[0043] 本發(fā)明中的所謂"抗體親和配體"是指，抗原和抗體的結(jié)合所代表的基于特異性的 分子間親和力從某種分子的集合中選擇性地收集（結(jié)合）靶（目標(biāo)）分子的物質(zhì)。
[0044] 可用于本發(fā)明的抗體親和配體只要具有可與作為靶分子的抗體或抗體的恒定區(qū) 域即含F(xiàn)c分子特異性結(jié)合的特征，就沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為肽性配體、蛋白質(zhì)性配體或化 學(xué)合成性配體（合成化合物）。從相對(duì)于靶分子的特異性的觀