用于通過連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法
【專利說明】用于通過連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法
[0001] 本發(fā)明是申請(qǐng)日為2005年3月4日、申請(qǐng)?zhí)枮?00580007175. 4、題為"用于通過 連續(xù)灌注和交互切向流來培養(yǎng)細(xì)胞的方法"的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明涉及對(duì)細(xì)胞的灌注培養(yǎng)（perfusionculturing)。
[0003] 本發(fā)明公開了一種方法，用于通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞， 所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，其中，細(xì)胞培養(yǎng)基被加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，其中， 細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，導(dǎo)致液體流出物的細(xì)胞密度較細(xì)胞培養(yǎng) 物要低，而過濾器模塊內(nèi)的流是交互切向流。
[0004] 我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明對(duì)動(dòng)物（特別是哺乳動(dòng)物）細(xì)胞或酵母細(xì)胞進(jìn)行灌 注培養(yǎng)，可以獲得極其高的存活細(xì)胞密度，而細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)一步展示出極其高的細(xì)胞存活 率（viability)。此外，還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的灌注方法使得培養(yǎng)物內(nèi)細(xì)胞聚集更少，甚至能獲得 單個(gè)的細(xì)胞的懸浮液，而沒有可見的聚集物。這是令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槭褂玫图羟袟l件， 例如，在灌注細(xì)胞培養(yǎng)中，典型地，不會(huì)使細(xì)胞不聚集。灌注細(xì)胞培養(yǎng)期間的細(xì)胞聚集是不 利的，因?yàn)槔缂?xì)胞聚集物中細(xì)胞代謝情況不均一使得過程控制會(huì)更難。如果細(xì)胞形成了 5個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的聚集物，以及當(dāng)聚集物總的來說包含細(xì)胞總量中5%或更多的時(shí)候，這 就尤其麻煩。
[0005] 在US6, 544, 424中描述了一種灌注方法。雖然，該文獻(xiàn)提到，該方法可以被用于 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌注培養(yǎng)，但是其既沒有公開也沒有暗示本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的高細(xì)胞密度。此 夕卜，US6, 544, 424B1中公開，該灌注過程可以減少中空纖維膜表面上障礙物的粘附和生 長(zhǎng)，但是其既沒有公開也沒有暗示細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞本身會(huì)更少地聚集。
[0006] Voisieretal. (Biotechnol.Bioeng. 82(2003)，751-765)對(duì)懸浮哺乳細(xì)胞高密 度灌注培養(yǎng)中的多種細(xì)胞駐留技術(shù)進(jìn)行了綜述。其中提到的細(xì)胞駐留系統(tǒng)中沒有一種能夠 提供本發(fā)明的極其高的存活細(xì)胞密度以及極其高的細(xì)胞存活率。
[0007] 細(xì)胞灌注培養(yǎng)在本領(lǐng)域中有其傳統(tǒng)含義，即，這意味著，在培養(yǎng)期間，通過分離設(shè) 備來保留細(xì)胞，其中存在較之分離前具有更低的細(xì)胞密度的液體流出物，并且存在細(xì)胞培 養(yǎng)基流入物。在本發(fā)明的方法中，該分離設(shè)備是包含中空纖維的過濾器模塊。
[0008] 灌注培養(yǎng)包括但不限于，連續(xù)流和半連續(xù)流，例如，逐步流（st印-Wiseflow)或交 錯(cuò)流（staggeredflow) 〇
[0009] 術(shù)語"中空纖維"指管狀的膜。該管的內(nèi)徑優(yōu)選在0. 3至6. 0mm之間，更優(yōu)選地， 在0? 5至3. 0mm之間，最優(yōu)選地，在0? 5至2. 0mm之間。優(yōu)選地，膜的網(wǎng)孔大小被選擇為：網(wǎng) 孔中孔的大小接近細(xì)胞直徑，確保細(xì)胞能駐留下來，而細(xì)胞殘骸能通過過濾器。優(yōu)選地，網(wǎng) 孔大小為3-30ym。
[0010] 包含中空纖維的過濾器模塊可通過商業(yè)途徑獲得，例如，從GeneralElectric(以 前的Amersham)獲得。
[0011] "過濾器模塊內(nèi)的交互切向流"指：在與中空纖維的膜表面相同的方向上（即，與 之相切的方向）存在一道流，所述的流來回流動(dòng)，在與所述過濾器表面基本垂直的方向上 存在另一道流。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得切向流。例如，在US6, 544, 424 中描述過，可以用一個(gè)泵使細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)，用另一個(gè)泵 移出細(xì)胞密度較過濾器分離之前更低的液體，由此獲得交互切向流。
[0012] 在本發(fā)明的方法中，適用于培養(yǎng)細(xì)胞的任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基原則上都可使 用。選擇細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)條件的方針都是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，并且在例如Freshney， R.I.Cultureofanimalcells(amanualofbasictechniques)，4thedition2000， wiley-Liss的第 8 章和第 9 章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&Tissue culturelaboratoryProcedures1993,Johnwiley&Sons中提供過。
[0013] 通常，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基包含鹽、氨基酸、維生素、脂類、去垢劑、 緩沖液、生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、微量元素和碳水化合物。鹽的例子包括鎂鹽，例如 MgCl2 ? 6H20、MgS0#MgS04 ? 7H20 ;鐵鹽，例如FeS04 ? 7H20 ;鉀鹽，例如KH2P04、KC1 ;鈉鹽，例 如NaH2P04、Na2HP04和鈣鹽，例如CaCl2 ? 2H20。氨基酸的例子是全部20種已知的蛋白質(zhì)源 氨基酸，例如，組氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸。維生素的例子包括：抗壞血酸、 生物素、膽堿C1、肌醇、D-泛酸、核黃素。脂類的例子包括：脂肪酸，例如亞油酸和油酸；大豆 蛋白胨和乙醇胺。去垢劑的例子包括Tween80和PluronicF68。緩沖液的例子是HEPES。 生長(zhǎng)因子/激素/細(xì)胞因子包括IGF、氫化可的松和（重組）胰島素。微量元素的例子是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括Zn、Mg和Se。碳水化合物的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和 丙酮酸鹽/酯。
[0014] 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度（osmolarity)原則上并不 重要，其取決于所選用細(xì)胞的種類。優(yōu)選地，PH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度被選擇 為：其對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)率來說是最優(yōu)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何找到對(duì)灌注培養(yǎng) 來說最優(yōu)的pH、溫度、溶解氧濃度和滲透壓摩爾濃度。通常，最優(yōu)pH介于6. 6和7. 6之間， 最優(yōu)溫度介于30至39°C之間，最優(yōu)滲透壓摩爾濃度介于260至400m0sm/kg之間。
[0015] 可有利地用本發(fā)明方法處理的細(xì)胞可以是從本發(fā)明的方法獲得好處（即培養(yǎng)至 極其高的存活細(xì)胞密度以及極其高的細(xì)胞存活率）的任何種類的細(xì)胞。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的方法，極其高的存活細(xì)胞密度是每mL至少80xl06個(gè)細(xì)胞的密度，優(yōu) 選地，每mL至少lOOxlO6個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選地，每mL至少110x10 6個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選地，每mL至 少120xl06個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選地，每mL至少130x10 6個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選地，每mL至少140x10 6個(gè) 細(xì)胞。典型地，細(xì)胞密度的合適上限可以是每mL大約500xl06個(gè)細(xì)胞。
[0017] 令人驚奇地，本發(fā)明的極其高的細(xì)胞密度還伴隨著極其高的細(xì)胞存活率。極其高 的細(xì)胞存活率是至少為90 %的存活率，優(yōu)選為至少95 %，更優(yōu)選為至少97 %，最優(yōu)選為至 少 99%。
[0018] 應(yīng)當(dāng)理解，非常高的存活細(xì)胞密度和非常高的細(xì)胞存活率是在灌注培養(yǎng)進(jìn)行一段 時(shí)間之后達(dá)到的，通常是當(dāng)細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，典型的是灌注培養(yǎng) 初始化之后12至25天。
[0019] 本發(fā)明的方法適合用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞，尤其適合用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。
[0020] 本發(fā)明的方法還尤其適合用于對(duì)培養(yǎng)期間（尤其是灌注培養(yǎng)期間）容易形成或固 有地會(huì)形成聚集物的細(xì)胞（所謂的聚集細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)。令人驚奇地，本發(fā)明的方法不僅 能減少過濾器膜上的聚集物分布，還能減少灌注培養(yǎng)期間細(xì)胞的聚集，甚至是減少固有地 趨向于形成聚集物的細(xì)胞的聚集。根據(jù)本發(fā)明對(duì)聚集細(xì)胞的培養(yǎng)能使得培養(yǎng)物中至少5個(gè) 細(xì)胞的聚集物僅包含細(xì)胞總數(shù)的至多5%，優(yōu)選地，至多4%，更優(yōu)選地，至多3%，進(jìn)一步更 優(yōu)選地，細(xì)胞總數(shù)的至多2%。尤其優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明對(duì)聚集細(xì)胞的培養(yǎng)使得培養(yǎng)物是真 正的單個(gè)的細(xì)胞的懸浮液。
[0021] 聚集細(xì)胞是形成至少5個(gè)細(xì)胞的聚集物的細(xì)胞，所述聚集物占到細(xì)胞總數(shù)的至少 5%。優(yōu)選地，聚集物由至少6個(gè)，更優(yōu)選至少7個(gè)，進(jìn)一步更優(yōu)選至少8個(gè)，進(jìn)一步更優(yōu)選 至少9個(gè)，進(jìn)一步更優(yōu)選至少10個(gè)細(xì)胞組成。優(yōu)選地，聚集物總的來說包含細(xì)胞總數(shù)的至 少7 %，更優(yōu)選至少10 %，最優(yōu)選15 %。
[0022] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括：CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞、雜交瘤、BHK(幼倉(cāng)鼠腎）細(xì) 胞、骨髓瘤細(xì)胞、人類細(xì)胞（例如ffiK-293細(xì)胞、人成淋巴細(xì)胞、PER.C6?細(xì)胞）、小鼠細(xì)胞