水稻莖節(jié)腐爛病的pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻病的檢測(cè)方法，尤指一種檢測(cè)水稻莖節(jié)腐爛?。╮ice stem-node rot)的PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻莖節(jié)腐爛病是我們最近在湖南省水稻上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，此病一旦發(fā)生， 減產(chǎn)高達(dá)50%以上。2009年7月在湖南桃源縣茶庵鋪鎮(zhèn)中稻上發(fā)現(xiàn)一種特殊的枯心癥狀， 枯心苗莖節(jié)及其上部約1厘米范圍內(nèi)發(fā)黑腐爛，病田水稻病叢率達(dá)到了 50%以上，采用細(xì) 菌分離，但未分離到細(xì)菌性基腐病菌。2010年，湖南邵陽縣又出現(xiàn)同樣癥狀的水稻病株，此 次同樣未能分離到細(xì)菌性基腐病菌。2011年8月，鳳凰縣、湘鄉(xiāng)縣和平江縣發(fā)生了莖腐癥 狀。此后在花垣、瀏陽、武閃、宜章、通道、茶陵和江華等縣均報(bào)告此病發(fā)生，發(fā)病田一般發(fā)病 率達(dá)到50% -80%，嚴(yán)重的可達(dá)到80 %以上。感染該病的水稻病株呈現(xiàn)枯心、死孕穗或死 桿，葉鞘上有不規(guī)則形褐條痕跡癥狀，剝開葉鞘可見自莖節(jié)處及莖節(jié)以上約1厘米范圍內(nèi) 均變黑、腐爛，腐爛處易斷。癥狀明顯不同于細(xì)菌性基腐病，命名為水稻莖節(jié)腐爛?。╮ice stem-node rot)〇
[0003] 從鳳凰縣、湘鄉(xiāng)縣和平江縣的水稻莖節(jié)腐爛病病株共分離得到數(shù)個(gè)病原菌株，形 態(tài)相似。菌落外觀初期呈白色圓形毛絨狀，培養(yǎng)皿反面可觀察到淡橘色，由中心向邊緣逐漸 淡去呈白色。在光學(xué)顯微鏡下菌絲為有隔菌絲，具分枝，菌絲體上形成分生孢子梗生，輪生， 頂部著生單個(gè)分生孢，或形成瓶體狀分生孢子梗，頂部分生孢子成團(tuán)；分生孢子無色，無隔， 長橢圓形，大小為4. 1 μπιΧ8. 2 μ??。經(jīng)rDNA ITS4和ITS5引物對(duì)其中的HNFH0UHNXX01和 HNPJOl菌株（分別來自鳳凰縣、湘鄉(xiāng)縣和平江縣）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序后得到的rDNA-ITS 序列，BLAST結(jié)果表明三個(gè)菌株都與截孢帚枝霉S.attenuatum(CBS414.81)的堿基序列 100%相同。據(jù)此鑒定該HNFHOl、HNXXOl和HNPJOl為截孢帚枝霉（S. attenuatum)。
[0004] 研宄表明此水稻莖節(jié)腐爛病菌可經(jīng)種子傳帶，因此種子帶菌檢測(cè)就顯得格外重 要。對(duì)于水稻種子是否攜帶有病原真菌，以前主要通過對(duì)種子所攜帶的微生物進(jìn)行分離培 養(yǎng)，再根據(jù)培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。這種方法不僅分離培養(yǎng)時(shí)間長，同時(shí)也 由于雜菌污染影響分離效果，檢出效率不高。因此，有必要建立一種能準(zhǔn)確鑒定水稻莖節(jié)腐 爛病的快速分子檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能準(zhǔn)確鑒定 水稻莖節(jié)腐爛病的PCR檢測(cè)方法。該方法所使用的一對(duì)引物是水稻莖節(jié)腐爛病菌的轉(zhuǎn)錄間 隔區(qū)（internal transcribed spacer 1，ITS)特異的，本檢測(cè)方法所使用的這對(duì)引物有別 于其它檢測(cè)方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種水稻莖節(jié)腐爛病的 PCR檢測(cè)方法，該方法是以水稻莖節(jié)腐爛病菌特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電 泳鑒定；該特異性引物為：
[0007] 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3(SEQ ID No. 1);
[0008] 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3(SEQ ID No. 2);
[0009] 上述特異性引物的設(shè)計(jì)是基于水稻莖節(jié)腐爛病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列， PCR產(chǎn)物大小為295bp。
[0010] 對(duì)本發(fā)明方法詳細(xì)敘述如下：
[0011] -、引物設(shè)計(jì)：
[0012] 本發(fā)明人利用真核生物進(jìn)化過程中核酸序列的保守性，從NCBI搜索并下載水稻 莖節(jié)腐爛病菌（claSarodium attenuatum)菌系 CBS 414. 81 和 C277 和稻帚枝霉 S. oryzae 菌系CBE-5的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS)的核苷酸序列（序列登錄 號(hào)分別為AY 566997、AB705154和JN689380)以及本申請(qǐng)人從表現(xiàn)莖節(jié)腐爛病癥狀的水稻 病株分離得到的3個(gè)菌株HNFH01、HNXXOl和HNPJOl (【背景技術(shù)】中已述）的ITS序列（序 列登錄號(hào)分別為KJ777679、KJ777680和KJ777681)，運(yùn)用MEGA4. 0軟件對(duì)這些序列進(jìn)行比 對(duì)，從擴(kuò)展名為mas的文件中找出不同研宄者報(bào)告的以上核苷酸序列所共有而其它真菌序 列均與之不同的引物候選區(qū)，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物（由寶生物工程（大連）有限公司合成）：
[0013] 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3(SEQ ID No. 1);
[0014] 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3(SEQ ID No. 2);
[0015] 將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，結(jié)合參見圖1及圖2,結(jié)果表明，與正 向引物和反向引物的序列100%覆蓋且100%相同的全部是水稻莖節(jié)腐爛病菌的核苷酸序 列。
[0016] 二、DNA 的提?。?br>[0017] 采取下述方法分別提取水稻莖節(jié)腐爛病株以及帶水稻莖節(jié)腐爛病菌的種子DNA :
[0018] (1)將SDS分離緩沖液置于60°C水浴中預(yù)熱。
[0019] (2)稱取0.5g菌絲，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將菌絲研碎。（或加預(yù)熱 的SDS分離緩沖液，用石英砂研磨）
[0020] (3)將粉末裝入無菌I. 5mL的離心管中，加入600uL預(yù)熱的SDS分離緩沖液中，輕 輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。
[0021] (4)樣品于 65°C保溫 10min。
[0022] (5)加等體積的7. 5mol/L的NaCL，輕輕顛倒混勾。
[0023] (6)冰浴 8min，IOOOOrpm 離心 5min。
[0024] (7)取600uL上清液至EP管中，加等體積（600uL)的氯仿-異戊醇（24:1)，輕輕 顛倒混勻，IOOOOrpm離心10分鐘。
[0025] (8)將上層水相吸入另一干凈的離心管中，加入0. 1倍體積的NaAc和2體積的預(yù) 冷無水乙醇（或1倍體積的預(yù)冷異丙醇），輕輕混勻，-20°C冰箱放置lh，使核酸沉淀下來。
[0026] (9)收集 DNA : IOOOOrpm 離心 10min，去上清。
[0027] (10)70%酒精洗絳，洗滌2次。
[0028] (11)酒精揮發(fā)后，用0· 1倍TE或CldH2O溶解，-20 °C分裝保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 三、PCR 過程：
[0030] 采用上述引物對(duì)分別對(duì)水稻莖節(jié)腐爛病株以及帶水稻莖節(jié)腐爛病菌的種子的DNA 進(jìn)行PCR檢測(cè)。預(yù)期PCR產(chǎn)物為295bp。
[0031] PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，具體見下表1 :
[0032] 表I PCR反應(yīng)體系各主要成分及用量
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻莖節(jié)腐爛病的PCR檢測(cè)方法，其特征在于：該方法是以水稻莖節(jié)腐爛病菌 特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定；該特異性引物為： 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3 ; 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3。
2. 如權(quán)利要求1所述的水稻莖節(jié)腐爛病的PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述特異性引 物的設(shè)計(jì)是基于水稻莖節(jié)腐爛病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物大小為295bp。
【專利摘要】一種水稻莖節(jié)腐爛病的PCR檢測(cè)方法，是以水稻莖節(jié)腐爛病菌特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定；該特異性引物是基于水稻莖節(jié)腐爛病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列，是水稻莖節(jié)腐爛病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)特異的，本檢測(cè)方法所使用的這對(duì)引物有別于其它檢測(cè)方法，可以用于快速檢測(cè)出水稻莖節(jié)腐爛病。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104561337
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510031605
【發(fā)明人】高必達(dá), 王姝瑋
【申請(qǐng)人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日