一種快速高通量的瘧原蟲檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速高通量的瘧原蟲檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是最嚴(yán)重的全球性公共健康問題之一，世界上超過一半的人口生活在瘧疾 流行區(qū)。近年來我國輸入性瘧疾呈逐年上升趨勢，感染人類的瘧原蟲有4種：惡性瘧原 蟲（Plasmodium falciparum, P. f)、間日痕原蟲（Plasmodium vivax, P. V)、三日痕原蟲 (Plasmodium malariae，P.m)和卵形痕原蟲（Plasmodium ovale, Ρ·ο)。因此，有效的檢測 瘧原蟲是醫(yī)學(xué)診斷和瘧疾防治必不可少的手段。目前我國仍采用顯微鏡檢法作為診斷瘧疾 的"金標(biāo)準(zhǔn)"，顯微鏡檢法受鏡檢人員的主觀判斷及責(zé)任心影響，極容易漏診，延誤治療。為 提升對瘧疾病例的實(shí)驗(yàn)室復(fù)核和確診能力，近年來以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)發(fā) 展迅速。污染風(fēng)險(xiǎn)低、靈敏度及特異性高的Real-time PCR需要昂貴的儀器及試劑，難以在 基層疾控部門推廣。
[0003] 以PCR技術(shù)為代表的分子生物學(xué)手段是現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于瘧原蟲快速檢測的技術(shù)。 而由PCR技術(shù)發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以及基因芯片技術(shù)等是目前在瘧原蟲檢測中使 用最廣泛的分子生物學(xué)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一種新的PCR方法，是在常規(guī)PCR反應(yīng) 的基礎(chǔ)上增加了能與擴(kuò)增模板特異性結(jié)合的探針，與傳統(tǒng)PCR相比，該方法無需對PCR產(chǎn)物 進(jìn)行再處理，完全是在封閉狀態(tài)下完成檢測的全過程，具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)，但是由 于對設(shè)備要求較高，對工作人員的操作技術(shù)難度大，所以不適合快速，準(zhǔn)確的檢測。
[0004] 基因芯片是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的全新的微量分析技術(shù)，它采用微加工和微 電子技術(shù)將大量的人工設(shè)計(jì)好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體 上而得到的一種信息檢測芯片?；蛐酒梢酝瑫r(shí)固定大量的探針分子，理論上可以在一 次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學(xué)指 標(biāo)，這為平行檢測多個(gè)菌種或同菌種內(nèi)多個(gè)菌株提供了一條便捷的途徑；同時(shí)檢測的靈敏 度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發(fā)展前景。
[0005] 基因芯片技術(shù)利用待檢測樣品的基因組序列設(shè)計(jì)針對各種微生物的特異探針，將 該探針（寡核苷酸）點(diǎn)樣于芯片表面，同時(shí)在探針兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR引物，在引物合成過程中對 其5'端進(jìn)行熒光標(biāo)記或在PCR過程中加入熒光標(biāo)記的dNTP，這樣利用PCR擴(kuò)增的方法即可 得到標(biāo)記有熒光染料的待檢測靶標(biāo)，然后用含有待檢測樣品特異探針的微陣列芯片與標(biāo)記 的靶標(biāo)雜交，熒光標(biāo)記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反應(yīng)，使得芯片上的 點(diǎn)呈現(xiàn)出熒光信號，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某 些特定瘧原蟲。
[0006] 當(dāng)前用于瘧原蟲檢測的基因芯片檢測已經(jīng)有些應(yīng)用于研宄，但是這些基因芯片的 探針點(diǎn)樣多采用手工模式，操作復(fù)雜，并且增加了很多假陽性的機(jī)會(huì)。
[0007] 本發(fā)明整合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和微陣列這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，把 PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應(yīng)室在同一張芯片上。PCR反 應(yīng)結(jié)束后可以直接加入雜交液進(jìn)行雜交，操作簡單，節(jié)省時(shí)間，另外靈敏度可以達(dá)到幾十個(gè) Copy的DNA分子。
[0008] 本發(fā)明的檢測方法可運(yùn)用于三種瘧原蟲快速靈敏的檢測，作為血清學(xué)試驗(yàn)及鏡檢 法的可靠補(bǔ)充，提高檢測的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，可大大地降低檢測的周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速高通量的瘧原蟲檢測方法，本發(fā)明能 對惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲基因進(jìn)行快速靈敏的檢測，通過本發(fā)明可大幅度提高進(jìn)出口 口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測方法 可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止疫情的發(fā)生和國外瘧疾的傳入。
[0010] 本發(fā)明針對惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲特有基因，設(shè)計(jì)引物，在引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè) 計(jì)能夠區(qū)別其他瘧原蟲及親緣關(guān)系較近的物種的特異性探針，通過探針特異性驗(yàn)證、探針 靈敏度實(shí)驗(yàn)、方法特異性實(shí)驗(yàn)等證明該方法可以特異檢測惡性瘧原蟲，與常規(guī)PCR方法比 較，檢測靈敏度明顯高于常規(guī)方法多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測最低檢出限，不僅可以滿足日 常疫情安全檢測的要求，甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。
[0011] 本發(fā)明所提供的快速高通量瘧原蟲檢測方法，包括如下步驟：
[0012] (1)血液樣本DNA液提??；
[0013] (2) PCR 擴(kuò)增：
[0014] a. PCR反應(yīng)體系包括：PCR反應(yīng)緩沖液，待測樣本基因特異性正、反向引物，PCR Grade H2O, PCR Control, DNA 提取液；
[0015] b.將PCR反應(yīng)液加入已含有待測基因特異性探針的芯片反應(yīng)室內(nèi)內(nèi)，將芯片放入 機(jī)器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；特異性探針是根據(jù)特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他物種；特 異性探針點(diǎn)入芯片上；
[0016] (3)雜交：PCR擴(kuò)增完后，將雜交反應(yīng)液加入芯片，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜 交艙內(nèi)雜交反應(yīng)；
[0017] (4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；
[0018] (5)結(jié)果判讀；
[0019] 所述的待測樣本基因?yàn)閻盒辕?、間日瘧、三日瘧各自特有基因。所述的特有基因 分別是惡性瘧的mdr、crt、18SrRNA基因，間日瘧的SSUrRNA、csp、18SrRNA基因，三日瘧的 18SrRNA 基因。
[0020] 所述的特異性正反引物和探針分別是：
[0021] 惡性瘧原蟲
[0022] mdr 基因
[0023] PfI-F:GTGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA (SEQ ID NO 1)
[0024] Pfl-R:CGTACCAATTCCTGAACTCACTTGTTC (SEQ ID NO 2)
[0025] Probe:GAACAAAAAGAGTACCGCTGAA (SEQ ID NO 3)
[0026] crt 基因
[0027] Pf2-F:GGTGGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG (SEQ ID NO 4)
[0028] Pf2-R:CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC (SEQ ID NO 5)
[0029] Probe ：GTATTATTTATTTAAGTGTATGTGT (SEQ ID NO 6)
[0030] 18SrRNA 基因
[0031] Lm2-F ：ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTAC (SEQ ID NO 7)
[0032] Lm2-R ：GCTGTAGTATTCAAACACAATGAAC (SEQ ID NO 8)
[0033] Probe ：CATAACAGACGGGTAGTCAT (SEQ ID NO 9)
[0034] 間日瘧原蟲
[0035] SSUrRNA 基因
[0036] PvI-F:AGTTCGTGAATATGATTTGTC (SEQ ID NO 10)
[0037] Pvl-R:CTGCGCTTCTGTACTTGGC (SEQ ID NO 11)
[0038] Probe:GGGGATTGCAATTATACTTCGTGTCG (SEQ ID NO 12)
[0039] csp 基因
[0040] Vp2-F:GGTGAGAACCCAGATGACGAGG (SEQ ID NO 13)
[0041] Vp2-R:TGGACTCCATGCAGTGTAACCTGT (SEQ ID NO 14)
[0042] Probe ：GGTGATGGAGCAGCTGTACAG (SEQ ID NO 15)
[0043] 18SrRNA 基因
[0044] Lm2-F ：GCAACGCTTCTAGCTTAATCCAC (SEQ ID NO 16)
[0045] Lm2-R ：CAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCC (SEQ ID NO 17)
[0046] Probe ：ACTTTGTGCGCATTTTGCTA (SEQ ID NO 18)
[0047] 三日瘧原蟲
[0048] 18SrRNA 基因
[0049] Pml-F:GTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGT (SEQ ID NO 19)
[0050] Pml-R:GCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCA (SEQ ID NO 20)
[0051] Probe:ATGAGTGTTTCTTTTAGATAGC (SEQ ID NO 21)
[0052] 和
[0053] Pm2-F:ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC (SEQ ID NO 22)
[0054] Pm2-R:AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA (SEQ ID NO 23)
[0055] Probe ：GTATAATTTTTTATGCATGGGAAT (SEQ ID NO 24)
[0056] 步驟（I)中所述的DNA提取可使用血液樣本基因組DNA提取試劑盒提取DNA ;取 50uL全血樣本，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA ;
[0057] 步驟（2)中所述的 PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12. 5ul, PrimerD 2. 5ul，PCR Grade H2O 4uI，PCR Control lul, Sample 5ul ；
[0058] 步驟⑵所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性15min ;95°C變性15s，60°C退 火40s，72°C延伸30s，45個(gè)循環(huán)，72°C延伸Imin。
[0059] 步驟（3)所述的雜交反應(yīng)條件是：注入的雜交液為14. 5ul，反應(yīng)時(shí)間為30min。雜 交后的芯片用洗液3000rpm 2min沖洗，直接用熒光掃描儀檢測。
[0060] 步驟（2)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（3)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0061] 本發(fā)明與現(xiàn)有檢測方法相比，將DNA雜交檢測的擴(kuò)增過程和雜交檢測過程濃縮到 一張芯片上檢測，大大縮減了檢測的時(shí)間和復(fù)雜性，檢測設(shè)備簡單易于攜帶。檢測系統(tǒng)可以 定量檢測低達(dá)幾十copy DNA的瘧原蟲，大大提高了當(dāng)前的檢測能力。而從樣品采集到檢測 總時(shí)間完全可以在3小時(shí)內(nèi)完成，有益于快速準(zhǔn)確高通量的檢測瘧原蟲。
【附圖說明】
[0062] 圖1-3分別是實(shí)施例1惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲鏡檢陽性結(jié)果；
[0063] 圖4-6分別是實(shí)施例1惡性瘧、間日瘧、三日瘧原蟲芯片檢測特異性。
【具體實(shí)施方式】
[0064] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這