惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及核苷酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及核苷酸序列，設(shè)計(jì)了惡性瘧原蟲特異的引物和探針，優(yōu)化了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系；針對(duì)惡性瘧原蟲的一對(duì)引物，結(jié)合普通PCR技術(shù)和分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了目的基因拷貝數(shù)與熒光檢測(cè)信號(hào)之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了惡性瘧原蟲的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。本試劑盒將納米磁微粒分離瘧原蟲核酸技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合，在標(biāo)本核酸提取方面具有操作方便、價(jià)廉、快捷、高效的特點(diǎn)，尤其在濾紙干血片核酸提取和提取微量全血核酸方面具有很大優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)大檢測(cè)范圍、最大程度降低漏檢率的目標(biāo)，本試劑盒的檢測(cè)限為25copies/μL。
【專利說明】惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及核苷酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，但不限于該領(lǐng)域，涉及檢測(cè)臨床樣品中惡性瘧原蟲，是一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及核苷酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]瘧疾是對(duì)人類健康危害最嚴(yán)重的傳染病之一，瘧疾病例中有86%發(fā)生在非洲地區(qū)，非洲以外地區(qū)的瘧疾病例80%集中在印度、蘇丹、緬甸、孟加拉、印度尼西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞和巴基斯坦等國。非洲以惡性瘧為主，間日瘧分布最廣，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶的國家和地區(qū)，以中美洲和東南亞為多見。[0003]我國自2000年以來瘧疾疫情出現(xiàn)回升，其中云南、海南兩省較為嚴(yán)重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性惡性瘧的威脅。隨著經(jīng)濟(jì)全球化和國際交往的增多，近年來勞務(wù)輸出人數(shù)逐年增加，輸入性瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢(shì)。輸入性病例大多源于非洲、緬甸等惡性瘧高發(fā)區(qū)勞務(wù)輸出的歸國人員，2008年我國瘧疾死亡病例全部為境外勞務(wù)回國人員，2009年有21個(gè)省(市、區(qū))有輸入性惡性瘧病例報(bào)告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。因此,關(guān)注瘧疾疫情,特別是境外輸入性惡性瘧疫情十分重要。
[0004]2009年全國報(bào)告惡性瘧1027例，占瘧疾總報(bào)告病例數(shù)的7.4%。其中，當(dāng)?shù)馗腥镜膼盒辕?30例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的12.7%，輸入性惡性瘧病例897例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的87.3%。2010年全年報(bào)告惡性瘧1258例，占瘧疾總報(bào)告病例數(shù)的16.0%，其中報(bào)告當(dāng)?shù)馗腥镜膼盒辕?7例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的7.7%，報(bào)告輸入性惡性瘧1161例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的92.3%，較上年上升29.4%。輸入性惡性瘧最主要的感染地為東南亞地區(qū)和非洲。東南亞有緬甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亞、馬來西亞等國家。非洲地區(qū)有尼日利亞、安哥拉、馬里、加納、幾內(nèi)亞、赤道幾內(nèi)亞、剛果、利比里亞、利比亞、馬拉維、多哥、喀麥隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亞等國家，其中東南亞的緬甸，非洲地區(qū)的尼日利亞、安哥拉、幾內(nèi)亞、赤道幾內(nèi)亞，是我國輸入性惡性瘧最多的國家。
[0005]惡性瘧來勢(shì)兇險(xiǎn)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，熱型不規(guī)則，起病方式各異，有的表現(xiàn)為呼吸道感染，有的表現(xiàn)為消化道感染，有的表現(xiàn)為急腹癥。并且惡性瘧可隨時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如腦型瘧、急性血管內(nèi)溶血(亦稱黑尿熱)等，容易引起誤診，若不及時(shí)救治，可出現(xiàn)意識(shí)障礙、昏迷、偏癱、腎功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可達(dá)22% -50%，甚至高達(dá)70%。因此，惡性瘧的早期診斷對(duì)于及早實(shí)施有效的治療方案，減少重癥病例及死亡病例、防范“二代”病例的發(fā)生十分重要。
[0006]發(fā)熱病人血檢是全世界公認(rèn)的和推行的發(fā)現(xiàn)傳染源唯一可靠可行的辦法，在瘧疾檢測(cè)中占有很重要的地位。鏡檢仍是診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，漏檢率高，還需要有相當(dāng)經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員才能做到正確診斷，尤其是在低原蟲血癥、混合感染，以及需要大樣本人群現(xiàn)場檢測(cè)時(shí)，臨床應(yīng)用受到許多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特異、快速、方便的惡性瘧診斷技術(shù)。[0007]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比具有特異性和敏感性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成了一條能夠與之特異性雜交的探針，探針結(jié)合位置位于上下游引物之間，當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5’ 一 3’外切酶活性，將探針5’端連接的熒光基團(tuán)從探針上解離下來，破壞了兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的突光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energytransfer, FRET),而發(fā)出熒光，解離下來的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此根據(jù)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算初始模板的數(shù)量。
[0009]惡性瘧原蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，包括兩大步驟，首先是從標(biāo)本中將惡性瘧原蟲核酸提取出來，然后再用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。瘧原蟲的裂殖子進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育增殖，被感染的紅細(xì)胞最終被脹破，裂殖子、瘧色素和其他代謝產(chǎn)物一起進(jìn)入血流，引起一次臨床發(fā)病。瘧原蟲檢測(cè)標(biāo)本,通常有兩種,全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本，后者由于便于現(xiàn)場采集、保存和運(yùn)輸，可以滿足現(xiàn)場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、特殊情況下(如在口岸現(xiàn)場)采樣或在邊遠(yuǎn)地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用。
[0010]傳統(tǒng)的瘧原蟲核酸分離方法，有水煮法、酚氯仿抽提法等。水煮法提取核酸有幾種方式，一種是先用生理鹽水或用雙蒸水洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用皂素溶液裂解，然后用TriS-HCl溶液高溫裂解。水煮法簡捷、經(jīng)濟(jì)，但是核酸得率低、純度低，不利于核酸的長期保存，并且核酸提取物中含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的血紅蛋白等物質(zhì)，影響瘧原蟲檢出率；商品化試劑盒提取核酸得率較高，在核酸擴(kuò)增時(shí)受到的影響因素較少，但是試劑盒價(jià)格昂貴，不適合現(xiàn)場大量使用和邊遠(yuǎn)窮困地區(qū)使用。
[0011]其它瘧原蟲核酸提取法有碘化鈉法、酚氯仿抽提法等，這些方法耗時(shí)長、使用有毒試劑，對(duì)人體有害，污染環(huán)境，不適用于常規(guī)檢測(cè)。
[0012]本發(fā)明的納米磁分離瘧原蟲核酸提取法，可用于提取微量全血和濾紙干血片標(biāo)本，利用經(jīng)修飾的納米磁微粒可以高效富集核酸特性，可獲得高純度的核酸模板，具有操作方便、快捷、高效，尤其在低水平瘧原蟲標(biāo)本核酸提取時(shí)此納米磁微粒高效捕獲核酸特性，可以大大提聞痕原蟲的檢出率。
[0013]納米磁微粒(MNP)是一種優(yōu)良的磁性分離介質(zhì)，具有比表面積大，磁響應(yīng)性強(qiáng)，可應(yīng)用于生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)的快速分離提取，尤其是其表面進(jìn)行化學(xué)修飾或高分子化合物包裹后，分離提取效率可大為提高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，成本也大為降低，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種快速高效、靈敏度高、特異性好、操作方便、價(jià)格低廉的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
[0015]本發(fā)明還提供一種與該特異性強(qiáng)、靈敏度高的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)的核苷酸序列。
[0016]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0017]一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照；
[0018]所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液；
[0019]所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； [0020]所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液；
[0021]所述結(jié)合液為無水乙醇；
[0022]所述洗液為70%乙醇；
[0023]所述洗脫液為ΤΕρΗ8.0 ；
[0024]所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ；
[0025]所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性瘧原蟲基因片段⑶的質(zhì)粒；
[0026]所述的陽性對(duì)照為惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0027]所述的陰性對(duì)照為正常人全血核酸提取液。
[0028]而且，瘧疾疑似病例全血標(biāo)本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或-20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標(biāo)本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用。
[0029]而且，所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下:
[0030]所述納米磁微粒MNP分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0031]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L，標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0032](2)加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0033]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0034]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0035]而且，所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0036]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0037](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0038]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0039]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0040]一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用核苷酸序列，其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
[0041]而且，所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
[0042]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0043]1、本試劑盒將納米磁分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本核酸技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，在標(biāo)本核酸提取方面具有操作方便、快捷、價(jià)廉、高效的特點(diǎn)，尤其在提取微量瘧原蟲核酸方面具有很大優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了最大程度降低漏檢率的目標(biāo)，本試劑盒的檢測(cè)限可以達(dá)到25copies/ μ L。
[0044]2、本發(fā)明首次采取了納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和全血濾紙干血片標(biāo)本瘧原蟲核酸的方法，可以最大程度地減少提取過程中瘧原蟲核酸的損失，快速高效地分離純化全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中的惡性瘧原蟲DNA，再通過自主設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行檢測(cè)，通過構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性瘧原蟲的定量檢測(cè)。
[0045]3、本發(fā)明選取惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針進(jìn)行靶序列擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為162bp。標(biāo)本模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，再利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量推算標(biāo)本中的惡性瘧原蟲DNA水平。實(shí)例檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可用于惡性瘧原蟲感染的診斷及其惡性瘧原蟲型別的鑒定。
[0046]4、本發(fā)明中瘧原蟲濾紙干血片標(biāo)本由于現(xiàn)場采集、保存和運(yùn)輸方便，可以滿足現(xiàn)場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、或在邊遠(yuǎn)地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用，但是，從濾紙干血片中提取瘧原蟲核酸的方法多采用傳統(tǒng)方法(水煮法、酚氯仿抽提法等)或者商品試劑盒法，前者核酸得率低、純度低，提取液中含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的抑制物，降低了瘧原蟲的檢出率，后者價(jià)格昂貴，不適合現(xiàn)場大量使用和邊遠(yuǎn)窮困地區(qū)使用。本發(fā)明提取瘧原蟲核酸，操作簡單、快捷，價(jià)廉，核酸純度高，經(jīng)表面修飾的納米磁微?？筛咝Р东@核酸，大大提高了瘧原蟲的檢出率。
[0047]5、本發(fā)明應(yīng)用納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本瘧原蟲核酸和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，解決了短時(shí)間內(nèi)快速高效提取瘧原蟲核酸并對(duì)其準(zhǔn)確定量檢測(cè)的方法學(xué)問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品靈敏度達(dá)到25c0pies/y I。惡性瘧原蟲完成一代紅內(nèi)期裂體增殖的時(shí)間不規(guī)則，一般為36-48小時(shí)。惡性瘧原蟲早期滋養(yǎng)體在血液中發(fā)育，逐漸隱匿在微血管等處，繼發(fā)成晚期滋養(yǎng)體和裂殖體，一般在外周血液中不易見到。惡性瘧原蟲在發(fā)作期易于檢測(cè)到陽性結(jié)果，在其它期陽性率較低。瘧疾初發(fā)時(shí)原蟲血癥較低，需在48-72小時(shí)內(nèi)反復(fù)涂血片鏡檢，必要時(shí)做骨髓涂片，以提高陽性率。由于瘧原蟲耐藥株的產(chǎn)生以及不規(guī)范治療等因素的影響，常會(huì)出現(xiàn)外周血瘧原蟲感染密度低或原蟲形態(tài)不典型的情況，一定程度上影響了血液鏡檢陽性率和蟲種的有效鑒定。2008年四川省瘧疾實(shí)驗(yàn)室診斷的占65.7%，其余為臨床診斷，而實(shí)驗(yàn)室診斷中有18.1%未進(jìn)行瘧原蟲分型。2009年全 國30個(gè)省(市、區(qū))共報(bào)告瘧疾病例數(shù)14140例，其中間日瘧占75.6%，惡性瘧占7.4 %，未分型瘧占17.0 %。2011年全國實(shí)驗(yàn)室未確診病例比例^ 18.3% (821/4479)，其中共7個(gè)省(市、區(qū))報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室未確診病例的比例高于25%。本發(fā)明提供的試劑盒可以敏感地檢測(cè)出惡性瘧原蟲感染初期病例或外周血惡性瘧原蟲密度低的感染者，可以為低水平惡性瘧原蟲的感染提供快速確診。
[0048]6、本試劑盒在開發(fā)過程中參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)得到了熒光定量PCR引物與探針，并應(yīng)用于惡性瘧原蟲檢測(cè)和定量分析，減少和避免了檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽性，提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)該探針對(duì)惡性瘧原蟲種特異性非常好，如果確定陽性，可以確診是惡性瘧，使治療更有針對(duì)性，根治更加徹底，防止復(fù)發(fā)；使用本試劑盒在入境歸國人員中檢測(cè)到極低水平的惡性瘧原蟲感染者，檢測(cè)靈敏度非常高。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0049]圖1顯示的是標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)在2.5 X 10L2.5 X IO8Copies/μ L時(shí)，Ct值范圍是11.91-36.45，質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值之間呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.43，截距為40.93，R2 = 0.999。 [0050]圖2顯示強(qiáng)、中、弱三個(gè)陽性標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線；三個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為，8.46 X IO5Copies/μ L、2.00X 103copies/y L,30copies/y L ;反應(yīng)曲線為典型的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，均能夠判定為陽性。
[0051]圖3顯示方法特異性曲線，從熒光擴(kuò)增曲線上可以看到，惡性瘧原蟲出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線，Ct值為25.30，而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線均沒有上升。
[0052]圖4顯示13份從非洲高疫區(qū)回國的入境人員標(biāo)本檢測(cè)曲線，其中1份標(biāo)本Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經(jīng)復(fù)測(cè)最終判斷為惡性瘧原蟲陽性。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054]本實(shí)施例使用的所有溶劑及試劑均為市售成品，引物及探針為委托基因公司合成，納米磁微粒由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局、國家納米科學(xué)中心聯(lián)合研制。
[0055]本發(fā)明除了采用納米磁微粒分離瘧原蟲DNA以外，還可以采用常規(guī)技術(shù)分離瘧原蟲DNA，然后根據(jù)本發(fā)明提供的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(Pl)來檢測(cè)惡性瘧原蟲，具體方法為本領(lǐng)域常規(guī)分離瘧原蟲DNA的方法，不再贅述。但是，在惡性瘧原蟲密度較低時(shí)，使用常規(guī)技術(shù)分離惡性瘧原蟲，漏檢率會(huì)增高。
[0056]本發(fā)明關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中惡性瘧原蟲的試劑盒，該試劑盒組成包括:(I)分別裝納米磁分離核酸體系、水(超純水)、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或離心管；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒。
[0057]本發(fā)明中涉及的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的核苷酸序列，包括實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(P1)，以及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列(S)，其具體序列如下:
[0058]Fl:5’ -TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTA-3’
[0059]Rl:5’ -GAACTCAATCATGACTACCCGTCTGT-3’
[0060]Pl:5’ -TCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGT-3’，
[0061]其中探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA，或其他配對(duì)的熒光標(biāo)記均可。
[0062]質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列⑶如下:
[0063]TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTC。
[0064]本發(fā)明提供的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，組成如下:
[0065]所述納米磁微粒(簡稱MNP)為表面修飾的納米磁性粒子，其制備過程為:首先利用熱分解法分解乙酰丙酮鐵(Ferric acetylacetonate),合成Fe3O4納米粒子,在堿性條件下水解四乙氧基硅烷(Tetraethylorthosilicate,TEOS),包裹Fe3O4納米粒子,形成表面為硅羥基的納米磁性微粒。
[0066]納米磁微粒具 體制備方法為:在三口燒瓶中將0.500g乙酰丙酮鐵溶解于20mL苯甲醇，室溫抽真空，再在氬氣保護(hù)下以平均6.50C /min升溫速率升至190°C，并在此溫度下反應(yīng)2h，得到黑色的膠體溶液。使用磁鐵收集產(chǎn)物，用正己烷和乙醇分別洗滌數(shù)次，在真空干燥箱內(nèi)抽真空，70°C干燥24h，即可制成四氧化三鐵納米磁微粒；將IOOmg四氧化三鐵納米磁微粒溶解在IOOmL乙醇水的混合溶液中，乙醇與水的體積比為4:1，再加入0.4mLTE0S、4mL氨水(濃度為25% )，TEOS經(jīng)水解、聚合，最后經(jīng)無水乙醇洗滌、抽濾、干燥即可制成表面為硅羥基修飾的納米磁微粒。納米磁微粒保存在無水乙醇中或者DEPC處理的水中，室溫保存或者2-8 °C冷藏保存均可。
[0067]所述裂解液為:5M異硫氰酸胍、50mMTris-HCl、20mMEDTA、l% TritonX-100，調(diào)節(jié)pH值至6.0。
[0068]所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液；
[0069]所述結(jié)合液為無水乙醇；
[0070]所述洗液為70%乙醇；
[0071 ] 所述洗脫液為TE (ρΗ8.0)；
[0072]所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液為PremixExTaq酶、上游引物(Fl)和下游引物(Rl)、熒光探針(Pl)、標(biāo)本DNA |吳板和水；
[0073]質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性痕原蟲基因片段⑶的質(zhì)粒，濃度為I X IO7Copies/μ L ;
[0074]所述的陽性對(duì)照為質(zhì)粒濃度為I X IO3Copies/ μ L的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0075]所述的陰性對(duì)照為正常人全血標(biāo)本核酸提取液。
[0076]具體操作方法如下:
[0077]1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建步驟如下:
[0078]分離提取惡性瘧原蟲DNA，普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片段⑶；
[0079]對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆、測(cè)序，確認(rèn)插入目的序列片段的準(zhǔn)確性；[0080]純化質(zhì)粒,測(cè)定并計(jì)算質(zhì)粒濃度；此次制備質(zhì)粒濃度為2.5 X IO8Copies/ μ L ；
[0081]對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，質(zhì)粒濃度為2.5X108、2.5X107、2.5X IO6,2.5Χ105、2.5Χ104、2.5Χ103、2.5Χ102 和 2.5X IO1Copies/μ L，Ct 值依次為 11.91,15.88、18.96,22.72,25.90,28.96,32.45,36.45，檢測(cè)靈敏度為 25copies/μ L。選定合適的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍(2.5 X IO1Copies/ μ L~2.5 X IO8Copies/ μ L)，以實(shí)時(shí)熒光PCR的Ct值為縱坐標(biāo)(y)，以惡性瘧原蟲核酸拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0082]上述的普通PCR反應(yīng)液為:10 X PCRbuffer (含Mg2+)、上游引物(Fl)、下游引物(Rl)、Taq酶、dNTPs、模板(惡性瘧原蟲DNA)和水。
[0083]普通PCR反應(yīng)步驟:在0.2mL離心管中，依次加入2.5 μ LlO X PCRbuffer (含Mg2+)，
0.5 μ LdNTPs (IOmM)，上游引物(FLlOyM)和下游引物(RLlOyM)各 I μ L，0.2 μ LTaq 酶(5~4 1^)、2 4 1^惡性瘧原蟲0嫩提取液，補(bǔ)水至25“1^反應(yīng)條件為:95°C lmin ；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0084]2、納米磁微粒(MNP)分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0085]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L,加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L,標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0086](2)加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0087]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0088]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0089]3、納米磁微粒(MNP)分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0090]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0091](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP(25 μ g/μ L),渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0092]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0093]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0094]4、實(shí)時(shí)熒光PCR:
[0095]在0.2mL 離心管中，依次加入 12.5 μ L2 X PremixExTaq, 0.5 μ L 上游引物(Fl，10μΜ)、0.5yL下游引物(R1，10 μ M)，0.3 μ L熒光探針(Ρ1，10 μ Μ)、2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液，補(bǔ)水至25 μ L0如采用ΑΒΙ7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，則使用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集模式，數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0096]循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s,40 個(gè)循環(huán)。
[0097]5、反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制:
[0098]根據(jù)使用不同的實(shí)時(shí)突光PCR儀設(shè)定好基線(baseline),設(shè)定的一般原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照反應(yīng)曲線的最高點(diǎn)，也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下2個(gè)條件:即陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線而陽性對(duì)照Ct〈35并有明顯擴(kuò)增曲線。否則，試驗(yàn)結(jié)果無效。
[0099]陰性結(jié)果:樣品無Ct值或Ct > 40，且無明顯擴(kuò)增曲線，報(bào)告為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性。
[0100]陽性結(jié)果:樣品Ct值≤35，并有明顯擴(kuò)增曲線，報(bào)告為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性。
[0101]可疑結(jié)果:樣品Ct值在35-40之間的標(biāo)本必須重做，若重做結(jié)果仍然有明顯擴(kuò)增曲線，則該標(biāo)本判斷為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，否則為陰性。
[0102]值得特別 說明的是，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的惡性瘧原蟲定量檢測(cè)，參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，利用DNAMAN6.0進(jìn)行序列比對(duì)，通過軟件PrimerExpress3.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)突光PCR引物與探針。構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的上、下游引物為實(shí)時(shí)熒光PCR上、下游引物，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品基因片段為162bp。借助這些質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實(shí)現(xiàn)惡性瘧原蟲的定量檢測(cè)。
[0103]具體檢測(cè)實(shí)例
[0104]實(shí)施例1:惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其使用
[0105]⑴制備包括下列組成成分的試劑盒:
[0106]納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、超純水、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0107]⑵標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存:
[0108]全血標(biāo)本:無菌操作采集疑似惡性瘧病人的全血標(biāo)本；全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指；抗凝劑可選用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉；一周內(nèi)進(jìn)行瘧原蟲檢測(cè)的可存放于2-8°C，長時(shí)間保存應(yīng)置于_20°C或_70°C以下；標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)符合生物安全要求，在冷藏(2-8°C )或冷凍(_20°C )的條件下運(yùn)送。
[0109]濾紙干血片標(biāo)本:取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙片上，室溫自然晾干后放入塑料袋密封，置于常溫(18-25°C )或冷藏或冷凍保存；標(biāo)本可在常溫、冷藏或者冷凍的條件下運(yùn)送。
[0110]⑶檢測(cè)步驟和結(jié)果分析:
[0111]全血標(biāo)本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性痕疑似病人全血標(biāo)本50 μ L,標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0112]陰性對(duì)照全血與病人全血標(biāo)本提取核酸步驟相同。
[0113]濾紙干血片標(biāo)本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:
[0114]將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL 離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；在上清液中加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ LjfMNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0115]實(shí)時(shí)熒光PCR:分別取2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液、或2 μ L陽性對(duì)照或陰性對(duì)照或系列梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，加入實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)總體積為25 μ L，其中上游引物(Fl)200nM，下游引物(Rl) 200nM，熒光探針(Pl) 120nM。采用ABI7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，使用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集模式，數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0116]循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s,40 個(gè)循環(huán)。
[0117]反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，并對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析。
[0118]由圖2可見強(qiáng)、中和弱三個(gè)陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，三個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為8.46X IO5Copies/μ L、2.0OX IO3Copies/ μ L,30copies/ μ L ;反應(yīng)曲線為典型的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，均能夠判定為陽性。
[0119]圖3顯示該檢測(cè)方法的特異性曲線。惡性瘧原蟲標(biāo)本檢測(cè)Ct值為25.30，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出標(biāo)本中惡性瘧原蟲含量，為3.60 X IO4Copies/μ L ;而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線均沒有上升。
[0120]圖4顯示采用本試劑盒，對(duì)非洲流行區(qū)回國的入境人員的惡性瘧原蟲感染狀況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出I例低水平惡性瘧原蟲感染者，Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經(jīng)復(fù)測(cè)驗(yàn)證最終判斷為惡性瘧原蟲陽性，惡性瘧原蟲水平為Hcopies/μ L。對(duì)此例感染者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)其4天前在非洲疫區(qū)醫(yī)院因瘧疾治愈而出院；此次入境時(shí)檢出其體內(nèi)存在低水平的惡性瘧原蟲，說明該患者還沒有完全治愈，還有惡性瘧復(fù)燃的危險(xiǎn)，建議其及早行瘧疾根治治療；病人隨后及時(shí)到?？漆t(yī)院就醫(yī)，經(jīng)抗惡性瘧治療康復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照； 所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液； 所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； 所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液； 所述結(jié)合液為無水乙醇； 所述洗液為70%乙醇； 所述洗脫液為TEpH8.0 ； 所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ； 所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性瘧原蟲基因片段(S)的質(zhì)粒； 所述的陽性對(duì)照為惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品； 所述的陰性對(duì)照為正 常人全血核酸提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:瘧疾疑似病例全血標(biāo)本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標(biāo)本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或-20C保存，供核酸提取用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下: 所述納米磁微粒MNP分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: (1)在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L，標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ； ⑵加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP，棄上清； ⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: ⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻,56。。IOmin ;8000rpm離心Imin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中； (2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；⑶ 加入300 μ L洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
5.一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用核苷酸序列，其特征在于:所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103937907SQ201410201466
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】劉翌, 王飛, 田茵, 孫寧, 楊靜, 孫福軍, 劉艷華, 薛強(qiáng), 高璟瑜, 張紹福, 鄒明強(qiáng), 鄧叢良, 葛廣路 申請(qǐng)人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局