專利名稱：用于檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系的核酸引物組、測定試劑盒及檢測乙型肝炎病毒的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明涉及用于檢測編碼對于抗藥性乙型肝炎病毒是特異性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸引物組、測定試劑盒及檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系的方法。背景領(lǐng)域作為治療HBV患者的方法，存在施用抑制HBV增殖的化學(xué)藥物例如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的方法。這樣的化學(xué)藥物通過結(jié)合dCTP在DNA復(fù)制過程中通常結(jié)合的位點(diǎn)(從而展示競爭性抑制逆轉(zhuǎn)錄酶在整合dCTP中的功能(work)的作用)和通過在復(fù)制過程中被整合入DNA㈠鏈(從而展示阻止DNA鏈延伸的作用)來抑制HBV增殖。然而，已知當(dāng)長時間施用例如拉米夫定時，可出現(xiàn)在某些氨基酸區(qū)域(例如，YMDD區(qū)域)具有突變的突變病毒，并且該突變病毒抗拉米夫定，從而引起病毒的量的再增加(“Kanzo”(Liver)，第47卷，No. 11，499-502 (2006))。因此，當(dāng)通過監(jiān)測顯示抗藥性株系出現(xiàn)時，需要采取緊急對策例如改變藥物等。通過使用PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒(在下文中稱為HBV)的DNA，然后通過序列分析閱讀編碼上述氨基酸突變的核苷酸序列來進(jìn)行抗藥性株系的檢測(Int. J. Med. Sci. 20052(1))。然而，期望有以更容易的方式檢測抗藥性株系的方法。本發(fā)明的公開內(nèi)容鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供能夠在短時間內(nèi)容易且便宜地檢測HBV的抗藥性株系的核酸引物組、測定試劑盒及檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系的方法。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供了檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系或非抗藥性(drug-nonresistant)株系的方法,包括使用引物組通過LAMP擴(kuò)增樣品溶液中的乙型肝炎病毒的核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，和將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有來源于乙型肝炎病毒的抗藥性株系的多核苷酸的探針和/或含有來源于乙型肝炎病毒的非抗藥性株系的多核苷酸的探針雜交，以檢測乙型肝炎病毒的抗藥性或非抗藥性株系，其中所述引物組包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，并且至少一個組選自引物組1，其中FIP引物由SEQ ID NO 3表示，BIP引物由SEQ ID NO :4表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO :27表示，以及B3引物由SEQ ID NO 28表示，和引物組2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示，BIP引物由SEQ ID NO :6表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 29表示，以及B3引物由SEQ ID NO 30表示，所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域；引物組3，其中FIP引物由SEQ ID NO :7表示，BIP引物由SEQ ID NO :8表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO 32表示，
引物組4，其中FIP引物由SEQ ID NO :9表示，BIP引物由SEQ ID N0:10表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO 32表示，弓丨物組11，其中FIP引物是由SEQID NO 7表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :121表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO :123表示，和弓丨物組12，其中FIP引物是由SEQID NO 9表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :122表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO :124表示，所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)204和236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域；引物組5，其中FIP引物是由SEQ ID NO :15表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :16表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 33表示，以及B3引物由SEQ ID NO :34表示， 引物組6，其中FIP引物是由SEQ ID NO :17表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :18表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 35表示，以及B3引物由SEQ ID NO :36表示，引物組7，其中FIP引物是由SEQ ID NO :19表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :20表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 37表示，以及B3引物由SEQ ID NO :38表示，和引物組8，其中FIP引物是由SEQ ID NO 21表示的多核苷酸，BIP弓丨物由SEQ IDNO 22表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 39表示，以及B3引物由SEQ ID NO 40表示，所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域；和引物組9，其中FIP引物是由SEQ ID NO :23表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :24表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 41表示，以及B3引物由SEQ ID NO :42表示，和弓丨物組10，其中FIP引物是由SEQID NO :25表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO 26表示，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 43表示，以及B3引物由SEQ ID NO 44表示，所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)181上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，可在短時間內(nèi)容易地、便宜地并且準(zhǔn)確地檢測到HBV的抗藥性株系或非抗藥性株系。附圖概述圖I是LAMP法的示意圖。圖2是顯示LAMP法的中間產(chǎn)物和內(nèi)部引物(inner primer) (FIP, BIP)的退火位
置的示意圖。圖3是顯示環(huán)引物(loop primer)的排布的示意圖。圖4是顯示LAMP法的中間產(chǎn)物和環(huán)引物(LFc，LBc)的退火位置的示意圖。圖5是顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測位置的示意圖。圖6是固定有探針的基質(zhì)的一個實(shí)施方案的平面示意圖。圖7是固定有探針的基質(zhì)的一個實(shí)施方案的平面示意圖。圖8顯示數(shù)據(jù)庫中注冊的HBV序列的登錄號。圖9顯示數(shù)據(jù)庫中注冊的HBV序列的登錄號。

圖10顯示HBV的標(biāo)準(zhǔn)序列。圖11顯示HBV的標(biāo)準(zhǔn)序列。
圖12顯示檢測祀序列(detection target sequence)的核酸引物序列和相對位點(diǎn)。 用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式HBV的抗藥性株系是一種突變株?？顾幮灾晗蹬c為非抗藥性株系的株系(野生型株系)相異在于HBV的聚合酶區(qū)域的氨基酸序列中的位點(diǎn)181、204或236上的氨基酸。這樣的突變源自HBV基因的突變，并且突變位點(diǎn)是因編碼氨基酸序列的核苷酸序列中存在突變而產(chǎn)生的。因此，HBV的抗藥性株系可通過鑒定基于所述區(qū)域的堿基突變的核苷酸多態(tài)性來檢測，從而可判斷來自受試者例如感染HBV的患者的HBV是抗藥性的還是非抗藥性的?；谶@樣的堿基突變(在下文中稱為核苷酸多態(tài)性)的核苷酸多態(tài)性一直以來主要通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來檢測。然而，在PCR方法中，預(yù)處理例如核酸提取是非常 麻煩的。此外，存在必需通過熱循環(huán)儀等進(jìn)行復(fù)雜的溫度控制以及需要2小時或更長的反應(yīng)時間的不便之處。存在的另外的問題因為PCR法的擴(kuò)增產(chǎn)物是雙鏈的，因此在檢測中互補(bǔ)鏈充當(dāng)了探針的競爭者，從而引起檢測靈敏度的減弱。由此得出，為了使擴(kuò)增產(chǎn)物成為單鏈，使用利用酶或磁珠分解或分離互補(bǔ)鏈的方法，但在任一種情況下，都存在問題例如非常麻煩的操作和更高的費(fèi)用。因此，在本發(fā)明中，使用LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification))代替PGR，將擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針雜交，檢測雜交，從而檢測核苷酸多態(tài)性。LAMP法是在等溫條件下在60至65°C下擴(kuò)增核酸的技術(shù)。LAMP法優(yōu)于PCR法在于可在短時間內(nèi)獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物。也已報導(dǎo)LAMP法幾乎不受樣品中的雜質(zhì)影響。通過使用LAMP法，可容易地擴(kuò)增靶核酸。例如，方法包括但不限于，可在測量中使用核酸探針來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。核酸探針可以是特異性檢測利用根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增引物擴(kuò)增的區(qū)域的任何探針。核酸探針是分別與野生型(即非抗性株系)的擴(kuò)增產(chǎn)物和突變型(即，抗性株系)的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)并且彼此之間具有更低的交叉反應(yīng)性的核酸探針，將各自的核酸探針用于與各自擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，然后檢測與各自核酸探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物。可分別檢測結(jié)合野生型核酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物和結(jié)合突變型核酸探針的擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷樣品中的HBV病毒是抗藥性的還是非抗藥性的。〈LAMP法的概述>在下文中，概述了 LAMP法。在本說明書中，接受核苷酸多態(tài)性的檢測的核酸稱為樣品核酸。利用根據(jù)本發(fā)明的LAMP引物擴(kuò)增的含有編碼HBV的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)181、204或236上的氨基酸的區(qū)域的核酸稱為靶核酸。通過LAMP法獲得的產(chǎn)物稱為擴(kuò)增產(chǎn)物。含有作為擴(kuò)增的受試者的HBV的溶液稱為樣品溶液。在LAMP法中，使F3、F2和Fl區(qū)域從靶核酸的5’ -末端側(cè)按該順序排列，并且使B3c、B2c和Blc區(qū)域從3’-末端側(cè)按該順序排列。如圖I中所示的4種引物用于擴(kuò)增靶核酸。Flc, F2c、F3c、BI、B2和B3區(qū)域分別指FI、F2、F3、Blc、B2c和B3c區(qū)域在互補(bǔ)鏈中的區(qū)域。在LAMP法中用于核苷酸擴(kuò)增的4種類型的引物是⑴在其3’-末端側(cè)具有與F2區(qū)域相同的序列并且在其5’ -末端側(cè)具有與Fl區(qū)域互補(bǔ)的序列的FIP引物；(2)由與F3區(qū)域相同的序列的組成的F3引物；(3)在其3’-末端側(cè)具有與B2c區(qū)域互補(bǔ)的序列并且在其5’-末端側(cè)具有與Blc區(qū)域相同的序列的BIP引物；和(4)由與B3c區(qū)域的互補(bǔ)序列組成的B3引物。通常，F(xiàn)IP引物和BIP引物稱為內(nèi)部引物，F(xiàn)3引物和B3引物稱為外部引物。
當(dāng)4種引物用于LAMP擴(kuò)增時，形成具有如圖2中所示的啞鈴結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物。FIP和BIP引物結(jié)合單鏈環(huán)中的F2c和B2c區(qū)域，以起始從弓丨物3 ’ -末端和從中間產(chǎn)物的3 ’ -末端開始的延伸反應(yīng)。關(guān)于詳細(xì)內(nèi)容，參考日本專利案3313358。在LAMP法中，(5)稱為環(huán)引物(loop primer)的引物可進(jìn)一步任意地用于減少擴(kuò)增時間。在該情況下，如圖3中所示，將LF區(qū)域置于范圍從F2區(qū)域至Fl區(qū)域的部分中，以及將LBc區(qū)域置于范圍從B2c區(qū)域至Blc區(qū)域的部分中。這些部分稱作環(huán)引物區(qū)域。然后，除了上述4種引物外還可使用由與LF區(qū)域互補(bǔ)的序列組成的環(huán)引物L(fēng)Fc和由與LBc區(qū)域相同的序列組成的環(huán)引物L(fēng)Bc。關(guān)于詳細(xì)內(nèi)容，參考W02002/0249028。環(huán)引物L(fēng)Fc和LBc可同時使用，或可只使用它們中的一個。該環(huán)引物，如圖4中所示，在與FIP和BIP引物退火的環(huán)不同的環(huán)上退火，從而提供了促進(jìn)擴(kuò)增的另外的合成起始點(diǎn)。當(dāng)將要檢測核苷酸多態(tài)性時，待檢測的多態(tài)位點(diǎn)位于圖5中所示的FP區(qū)域 (F-環(huán))或BPc區(qū)域(B-環(huán))中。備選地，不同的多態(tài)性可分別位于FP和BPc區(qū)域。如圖5中所述，范圍從F2區(qū)域至Fl區(qū)域的部分是將在擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生單鏈的部分。類似地，范圍從B2c區(qū)域至Blc區(qū)域的部分也是將在擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生單鏈的部分。當(dāng)待檢測的多態(tài)位點(diǎn)位于為單鏈的部分時，其利用核酸探針進(jìn)行的檢測由于與核酸探針高效率的反應(yīng)而得到促進(jìn)。此類引物的選擇將在后而進(jìn)行詳細(xì)描述?！碙AMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測；核酸探針>設(shè)計核酸探針以使其結(jié)合含有多態(tài)位點(diǎn)的FP或BPc區(qū)域。即，核酸探針具有與在FP或BPc區(qū)域中含有多態(tài)位點(diǎn)的區(qū)域的序列互補(bǔ)的序列。分別與FP和BPc區(qū)域互補(bǔ)的FPc和BP區(qū)域也存在于擴(kuò)增產(chǎn)物中，因此，這些FPc和BP區(qū)域也可用于檢測。在本說明書中，含有與野生型的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的核酸探針稱為野生型核酸探針或非抗藥性探針，而含有與突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的核酸探針稱為突變型核酸探針或抗藥性探針。核酸探針包括但不限于DNA、RNA、PNA、LNA、具有甲基膦酸主鏈的核酸和其他人造核酸。為了固定在基質(zhì)上，可用反應(yīng)性官能團(tuán)例如氨基、羧基、羥基、巰基或磺基修飾核酸探針的末端?？稍诠倌軋F(tuán)和多核苷酸之間導(dǎo)入間隔子。例如，可使用由烷烴或乙二醇主鏈組成的間隔子。核酸探針的長度是最短15個堿基至最長45個堿基。長度更優(yōu)選為15至40個堿基，更優(yōu)選18至35個堿基。<固定核酸探針的基質(zhì)>核酸探針可通過固定在基質(zhì)上來使用，但核酸探針的用途不限于此。固定核酸探針的基質(zhì)可以是稱為DNA芯片或本身已知的DNA微陣列的裝置。在一個實(shí)施方案中的固定探針的基質(zhì)的示意圖示于圖6中。探針被固定在基質(zhì)I上的固定區(qū)域2中?；|(zhì)I可以例如由硅基質(zhì)等制造，但基質(zhì)的材料不限于此。可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法固定探針。可將一種探針或多種探針固定在一個基質(zhì)I上，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)計探針的排列和數(shù)目，以及必要時進(jìn)行改變。當(dāng)如后所述通過熒光檢測探針時，可以使用例如本實(shí)施方案中的固定探針的基質(zhì)。另一個實(shí)施方案中的固定探針的基質(zhì)的不意圖不于圖7中。在該實(shí)施例中，基質(zhì)11具有電極12。探針被固定在電極12上。將電極12與襯墊13連接以回收(retrieving)電f目息。基質(zhì)11可以例如由娃基質(zhì)等制造，但基質(zhì)的材料不限于此。電極的制造和探針的固定可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來進(jìn)行。電極不受特別限制，但可由單一金屬或其合金例如金、金合金、銀、鉬、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵或鎢、碳例如石墨或玻璃碳或其氧化物或化合物制造。圖7中固定基質(zhì)具有10個電極，但排布在一個基質(zhì)上的電極的數(shù)目不限于此，其可任意改變。排布在其上的電極的模式不限于圖中所示的模式，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)計和改變。必要時基質(zhì)I可具有參比電極和反電極(counter electrode)。當(dāng)如后所述通過電化學(xué)檢測探針時，可使用例如本實(shí)施例中的固定探針的基質(zhì)。
<核酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物之間的雜交>在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行核酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物之間的雜交。適當(dāng)?shù)臈l件可視擴(kuò)增產(chǎn)物的類型和結(jié)構(gòu)、檢測序列中含有的堿基的類型以及核酸探針的類型而變化。在例如離子強(qiáng)度在0.01至5的范圍內(nèi)和pH在5至10的范圍內(nèi)的緩沖液中進(jìn)行雜交?？上蚍磻?yīng)溶液中加入為雜交促進(jìn)劑的硫酸葡聚糖、鮭精DNA、小牛胸腺DNA、EDTA和表面活性劑。例如在10至90°C的范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，并且可通過攪拌或振蕩來增加反應(yīng)的效率。關(guān)于反應(yīng)后的清洗，可使用離子強(qiáng)度在0. 01至5的范圍內(nèi)以及pH在5至10的范圍內(nèi)的緩沖液。<檢測方法>當(dāng)將固定在基質(zhì)上的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時，形成雙鏈核酸。可通過電化學(xué)或熒光檢測該雙鏈核酸。(a)電流檢測系統(tǒng)描述了通過電化學(xué)檢測雙鏈核酸的方法。在該方法中，使用特異性識別雙鏈核酸的雙鏈識別物質(zhì)。雙鏈識別物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于Hoechst 33258、吖啶橙、奎納克林(quinacrine)、柔紅霉素(daunomycin)、金屬插入劑(metallointercalator)、雙插入劑(bisintercalator)例如雙卩丫唳、三插入劑(trisintercalator)和多插入劑。此類物質(zhì)可用電化學(xué)活性金屬復(fù)合物例如二茂鐵或紫羅堿進(jìn)一步修飾。雙鏈識別物質(zhì)的濃度視其類型而變化，但通常在Ing/mL至lmg/mL的范圍內(nèi)變化。在該情況下，可使用具有0. 001至5的離子強(qiáng)度和pH在5至10的范圍內(nèi)的緩沖液。在雜交反應(yīng)過程中或之后，向反應(yīng)溶液中加入雙鏈識別物質(zhì)。當(dāng)雙鏈核酸已通過雜交形成時，雙鏈識別物質(zhì)與其結(jié)合。由此得出，通過應(yīng)用等于或高于引起雙鏈識別物質(zhì)的電化學(xué)反應(yīng)的電壓的電壓，可測量來源于雙鏈識別物質(zhì)的反應(yīng)電流值。在該情況下，可使用恒定速率電壓(constant-rate voltage)、脈沖電壓或恒壓。在測量中，可使用裝置例如恒電位器、數(shù)字萬用表和函數(shù)發(fā)生器來調(diào)控電流和電壓。例如，優(yōu)選可使用描述于日本專利申請KOKAI公開案10-146183的已知的電化學(xué)檢測方法。(b)熒光檢測法描述了熒光檢測雙鏈核酸的方法。之前用熒光活性物質(zhì)標(biāo)記引物。備選地，在檢測中使用熒光活性物質(zhì)標(biāo)記的第二探針。備選地，可使用多個標(biāo)記。熒光活性物質(zhì)包括但不限于熒光染料例如FITC、Cy3、Cy5和羅丹明。熒光物質(zhì)用例如熒光檢測器來檢測。將經(jīng)改造適用于標(biāo)記的類型的適當(dāng)?shù)臋z測器用于檢測已標(biāo)記的檢測序列或第二探針。<用于選擇核酸引物和核酸探針的指導(dǎo)方針>如圖5中所示，當(dāng)所述核苷酸多態(tài)位點(diǎn)位于Blc和B2c之間，即位于BPc區(qū)域中時，則BIP引物是具有與B2c區(qū)域互補(bǔ)的序列和具有與Blc區(qū)域相同的序列的引物。因此，可設(shè)計不同的引物來產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物，只要B2c區(qū)域和Blc區(qū)域位于這樣的位置，以使所述核苷酸多態(tài)位點(diǎn)夾在其間。類似地，當(dāng)所述核苷酸位點(diǎn)位于F2和Fl之間，即位于FP區(qū)域時，則FIP引物是具有與Fl區(qū)域互補(bǔ)的序列和具有與F2區(qū)域相同的序列的引物。因此，可設(shè)計不同的引物來產(chǎn)生目的擴(kuò)增引物，只要Fl區(qū)域和F2區(qū)域位于這樣的位置，以使所述核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)夾在其間。然而，本發(fā)明者顯示，LAMP法中擴(kuò)增的效率視引物的類型而變化。例如，在后面顯示的表1、2和3中舉例說明了 4種類型的引物。此類引物(FIP、BIP、F3和B3引物)用于擴(kuò)增。結(jié)果，使用任何引物的擴(kuò)增在短時間內(nèi)順利地完成。因此，此類引用是用于擴(kuò)增的良好引物。為了進(jìn)一步使用核酸探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)以高效率產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸探針之間的雜交。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物在雜交效率上是否優(yōu)良，也被考慮用于評估引物。優(yōu)選在長度為優(yōu)選450bp或更短，更優(yōu)選350bp或更短的區(qū)域(F2和B2之間的任何地方)中設(shè)計無核苷酸多態(tài)性夾在其間的另一對內(nèi)部引物。設(shè)計兩個內(nèi)部引物以使單鏈環(huán)的長度優(yōu)選為IOObp或更短，更優(yōu)選70bp或更短。對于引物的非特異性擴(kuò)增是在LAMP法中通常觀察到的現(xiàn)象。FIP引物包括Flc和F2區(qū)域，從而形成長鏈核酸。類似地，BIP引物包括Blc和B2區(qū)域，從而形成長鏈核酸。因此，F(xiàn)IP引物或BIP引物彼此之間發(fā)生纏繞，或FIP引物與BIP引物發(fā)生纏繞，從而增加以引物為模板的擴(kuò)增的可能性。在LAMP反應(yīng)中，F(xiàn)3引物、B3引物和任選地LFc引物和LBc引物存在于反應(yīng)液中，從而與PCR反應(yīng)相比較，在LAMP反應(yīng)中增加了非特異性反應(yīng)的可能性。當(dāng)產(chǎn)生這樣的非特異性反應(yīng)時，以樣品核酸為模板的期望的LAMP產(chǎn)物的量減少。〈核酸引物和核酸探針的設(shè)計〉基于上述內(nèi)容，以下列方式建立用于根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增的核酸引物的核苷酸序列和用于檢測LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸探針的核苷酸序列。第一，基于數(shù)據(jù)庫建立它們的標(biāo)準(zhǔn)序列。首先，從基因序列信息數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. rov. /Genbank/index, html)獲得關(guān)于HBV B型和C型的序列信息。用于建立標(biāo)準(zhǔn)序列的序列的登錄號示于圖8和9。通過HBV B型和C型的比對分析，選擇在核苷酸序列的各位點(diǎn)中以最高頻率發(fā)生的堿基作為標(biāo)準(zhǔn)序列。B型和C型的標(biāo)準(zhǔn)序列分別示于圖10和11中?；谠摌?biāo)準(zhǔn)序列，分別確定根據(jù)本發(fā)明的12種類型的引物組(引物組I至12)和核酸探針的核苷酸序列?！匆锏脑O(shè)計〉[FIP引物(I)和BIP引物⑶]首先，確定FIP引物和BIP引物。表I顯示了用于檢測HBV抗藥性株系的12種類型的核酸引物組中的FIP引物和BIP引物。
權(quán)利要求
1.用于LAMP擴(kuò)增以檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系和非抗藥性株系的核酸引物組，其包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物， 其中所述引物組選自 引物組2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸組成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸組成，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸組成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸組成， 所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域。
2.權(quán)利要求I的引物組，其還包括，由至少一個來自SEQID NO 45和SEQ ID NO 46中的序列表示的多核苷酸組成的引物，作為環(huán)引物。
3.檢測乙型肝炎病毒的抗藥性或非抗藥性株系的方法，其包括 使用引物組，通過LAMP擴(kuò)增樣品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，和 將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與含有來源于乙型肝炎病毒的抗藥性株系的多核苷酸的探針和/或含有來源于乙型肝炎病毒的非抗藥性株系的多核苷酸的探針雜交，以檢測乙型肝炎病毒的抗藥性或非抗藥性株系， 其中所述引物組包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，并且包括 引物組2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸組成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸組成，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸組成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸組成，且 所述引物組用于擴(kuò)增含有編碼乙型肝炎病毒的聚合酶區(qū)域中的位點(diǎn)181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列區(qū)域。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述探針包含于探針組中，所述探針組含有至少一個由多核苷酸和任選的分別與所述多核苷酸的端部連接的一個至兩個核苷酸片段和另外一個至5個核苷酸片段組成的探針，所述多核苷酸選自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :56表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :57表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 84表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 85表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :90表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO91表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述引物組含有 引物組2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸組成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸組成，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸組成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸組成，所述探針包含于探針組中，所述探針組含有至少一個由多核苷酸和任選的分別與所述多核苷酸的端部連接的一個至兩個核苷酸片段和另外一個至5個核苷酸片段組成的探針，所述多核苷酸選自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 56表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 57表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 84表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 85表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 90表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 91表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述引物組包含引物組2，其中FIP引物由SEQ ID N0:5表示的多核苷酸組成，BIP引物由SEQ ID NO 6表示的多核苷酸組成，F(xiàn)3引物由SEQ ID NO 29表示的多核苷酸組成，以及B3引物由SEQ ID NO 30表示的多核苷酸組成， 所述探針包含于探針組中，所述探針組含有來源于抗藥性株系的多核苷酸和/或包含來源于非抗藥性株系的多核苷酸的探針，所述探針組包含至少一個選自如下的探針 由SEQ ID NO 92多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO 93多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :94多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID N0:95多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO 96多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ IDNO 97多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO 98多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO 99多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :100多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :101多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :102多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :103多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQID NO :104多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ IDNO :105多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :106多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :107多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :108多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO:109多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :110多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :111多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :112多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :113多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :114多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :115多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQID NO :116多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :117多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :118多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :119多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :120多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO:178多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :179多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :180多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :181多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :182多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :183多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :184多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQID NO :185多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO : 186多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :187多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :188多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :189多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO:190多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :191多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :192多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :193多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :194多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，由SEQ ID NO :195多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針，和由SEQ ID NO :196多核苷酸或其互補(bǔ)鏈表示的探針。
7.用于檢測乙型肝炎病毒的抗藥性或非抗藥性株系的測定試劑盒，其包括 權(quán)利要求I的引物組，和 含有來源于乙型肝炎病毒的抗藥性株系的多核苷酸的探針和/或含有來源于乙型肝炎病毒的非抗藥性株系的多核苷酸的探針。
8.權(quán)利要求7的用于檢測乙型肝炎病毒的抗藥性的測定試劑盒，所述探針包含于探針組中，所述探針組含有至少一個由多核苷酸和任選的分別與所述多核苷酸的端部連接的一個至兩個核苷酸片段和另外一個至5個核苷酸片段組成的探針，所述多核苷酸選自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 56表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 57表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :84表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :85表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :90表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO:91表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈。
9.權(quán)利要求I的引物組，其中所述引物組用于檢測其基因型為C型的乙型肝炎病毒的抗藥性。
10.權(quán)利要求3的引物組，其中所述引物組用于檢測其基因型為C型的乙型肝炎病毒的抗藥性。
11.權(quán)利要求6的引物組，其中所述引物組用于檢測其基因型為C型的乙型肝炎病毒的抗藥性。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系的方法，其包括使用引物組通過LAMP擴(kuò)增樣品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有來源于抗藥性株系的多核苷酸的探針和/或含有來源于非抗藥性株系的多核苷酸的探針雜交，以檢測乙型肝炎病毒的抗藥性株系。
文檔編號C12Q1/70GK102796828SQ201210228970
公開日2012年11月28日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者高橋匡慶, 橋本美智惠, 伊藤桂子, 木津慶子, 三代俊治, 高橋和明, 宮崎和典, 橋本幸二, 源間信弘 申請人:株式會社東芝