鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列、引物和試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒別金針菇的技術領域，具體涉及鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列、引物和試劑盒及方法。鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，基本上包含SEQ ID NO.1或其一部分，或突變率不大于5％的SEQ ID NO.1或其一部分。本發(fā)明提供一種快速鑒別芬娜金針菇的特征氨基酸序列、引物、試劑盒以及方法，特異性高，方法簡單，對芬娜金針菇的商業(yè)化及利用具有重要意義。CCTCC NO: M 201617920160407
【專利說明】
鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列、引物和試劑盒及方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及鑒別金針菇的技術領域，具體涉及鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序 列、引物和試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 金針燕(Flammulina velutipes)是目前人工廣泛栽培的食用菌之一，也是一種經(jīng) 濟價值很高的食藥用真菌。金針菇含有多種營養(yǎng)成分，其中人體生長所需的8種氨基酸含量 較高，尤以賴氨酸和精氨酸含量特別豐富，能促進兒童的健康成長和智力發(fā)育，因此常被稱 為"增智菇"。金針菇含有樸菇素，具有顯著的抗癌功能，經(jīng)常食用金針菇還可以預防高血 壓，治療肝炎及腸胃潰瘍等疾病。
[0003] DNA是生物遺傳信息的載體，每個生物物種乃至個體具有獨特的特征性核苷酸序 列，且具有一定的穩(wěn)定性，基本不會受環(huán)境或培養(yǎng)等條件的影響而改變，是該生物物種或個 體區(qū)別于其它生物物種或個體的重要標志，因而是用來鑒定物種或個體的可靠依據(jù)。
[0004] 隨著分子生物學技術的快速發(fā)展以及計算機輔助分析技術的誕生，真菌的快速檢 測已成為可能。目前常用的檢測方法主要有隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、限制性片段長度多態(tài) 性分析(RFLP)、rDNA序列分析和聚合酶鏈式反應(PCR)檢測等。
[0005] 現(xiàn)有技術中沒有芬娜金針菇的鑒別方法、特征核苷酸序列、引物以及試劑盒，因 此，存在難以特異性并且訊速地檢測芬娜金針菇的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，所述特征核苷酸 序列基本上包含SEQ ID NO. 1或其一部分，或突變率不大于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。
[0007] 進一步地，鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，所述芬娜金針菇為芬娜金針菇 Flammulina fennae，保藏編號為CCTCC Μ 2016179。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，所述引物篩選自 上述第一方面提供的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，
[0009] 進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，所述引物選自SEQ ID Ν0.2、 SEQ ID N0.4中的一個，及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一個，優(yōu)選為SEQ ID N0.2、及SEQ ID Ν0·5〇
[0010] 進一步地，鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，所述芬娜金針菇為芬娜金針菇 Flammulina fennae，保藏編號為CCTCC Μ 2016179。
[0011] 第三方面，本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的試劑盒，包含上述第二方面提供的 鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物。
[0012] 進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的試劑盒，還包括聚合酶鏈式反應試劑、和/或基 因組提取試劑、和/或說明書。
[0013] 進一步地，一種鑒別芬娜金針燕的試劑盒，還包括DNA Marker、和/或凝膠電泳試 劑。
[0014] 進一步地，鑒別芬娜金針菇的試劑盒，所述芬娜金針菇為芬娜金針菇Flammulina fennae，保藏編號為CCTCC Μ 2016179。
[0015] 第四方面，本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的方法，方法包括:對樣品的基因組進 行PCR擴增，得到約350bp-550bp條帶的樣品為芬娜金針菇，優(yōu)選約420-520bp條帶的樣品為 芬娜金針菇，進一步優(yōu)選約460-500bp條帶的樣品為芬娜金針菇，或更優(yōu)選為上述第一方面 提供的特征核苷酸序列的樣品為芬娜金針菇。
[0016] 進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的方法，方法包括:采用上述本發(fā)明的第二方面提 供的的特征核苷酸引物對樣品的基因組進行PCR擴增，得到約350bp-550bp條帶的樣品為芬 娜金針菇，優(yōu)選約420-520bp條帶的樣品為芬娜金針菇，進一步優(yōu)選約460-500bp條帶的樣 品為芬娜金針菇，或更優(yōu)選為上述第一方面提供的特征核苷酸序列的樣品為芬娜金針菇。
[0017] 更進一步地，在一個優(yōu)選的實施例中，一種鑒別芬娜金針菇的方法，所述PCR擴增 條件包括:所述PCR擴增條件包括：94 °C 5min; (94°C 30s，56 °C (每個循環(huán)降1°C ) 30s，72 °C 4〇8)6個循環(huán)；（941€3〇8,5〇1€3〇8,721€4〇8)32個循環(huán) ；721€511^11。
[0018] 更進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的方法，基因組為基因組總DNA。
[0019] 更進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的方法，基因組包括基因組總DNA的提取來源不 限，優(yōu)選提取自菌絲體或子實體中。
[0020] 進一步地，鑒別芬娜金針菇的方法，所述芬娜金針菇為芬娜金針菇Flammulina fennae，保藏編號為CCTCC Μ 2016179。
[0021 ]芬娜金針燕(Flammulina fennae)與普通金針燕相比，具有栽培性狀佳、有效成分 高、菌柄底部不粘連，不形成褐變、菇質(zhì)脆嫩鮮美等優(yōu)點，具有較好的開發(fā)利用前景，所以快 速且準確地鑒別芬娜金針菇子實體及菌絲體是其商業(yè)化生產(chǎn)的重要技術保障，對其開發(fā)利 用具有重要的意義。
[0022] 本發(fā)明提供一種快速鑒別芬娜金針菇的特征氨基酸序列、引物、試劑盒以及方法， 特異性高，方法簡單，對芬娜金針菇的商業(yè)化及利用具有重要意義。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實施例2中獲得的芬娜金針菇的特征核苷酸序列。
[0024] 圖2為本發(fā)明實施例3中鑒別方法得到的擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0026]芬娜金針菇及其栽培方法
[0027] 芬娜金針燕（Flammul ina f ennae)，屬擔子菌門（Basidiomycota)，傘菌目 (Agaricaies)，口蘑科(Trichofomataceae)，小火焰菌屬(Flammulina) 〇
[0028] 在本發(fā)明優(yōu)選的一些實施例中，包括芬娜金針菇的特征核苷酸序列、特征核苷酸 引物、試劑盒以及鑒別方法的實施例中，提供一種芬娜金針菇新菌種，分離自蒙古烏素圖國 家森林公園的腐木上，經(jīng)形態(tài)學及分子生物學鑒定為芬娜金針燕Flammulina fennae新菌 種，通過進行組織分離得到原始菌株，命名為芬娜金針燕Flammulina fennae HMGIM- M140658,已于2016年4月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，湖北省武漢市洪 山區(qū)八一路，武漢大學），保藏號為:CCTCC Μ 2016179。
[0029] 對本發(fā)明的芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179的子實體DNA基因組進行提取， PCR擴增進行鑒定，發(fā)現(xiàn)與芬娜金針燕(Flammulina fennae)相似性高達95%以上，經(jīng)過形 態(tài)學鑒定，鑒定結果為芬娜金針燕(？]^1111]1111；[1^€6111^6)的新菌種。
[0030] 本發(fā)明的芬娜金針菇CCTCC Μ 2016179的外觀形態(tài)學特征為：菌蓋直徑1-1.8cm， 凸鏡形至平展形，肉質(zhì)，中央淺褐色，近邊緣白色，甚粘，光滑無毛，邊緣內(nèi)卷。菌肉白帶黃 色，薄。菌褶白帶黃色，蓋緣處每厘米13-14片，不等長，直生，褶緣平滑至波狀。菌柄中生，圓 柱形，長2-5cm，近柄頂粗l-2mm，空心，白色，被粉末狀顆粒或纖毛，具假根。孢子橢圓形，6_ 8.5*3.5-4.5μηι，光滑，無色至微黃色，非淀粉質(zhì)。擔子棒形，26-34*6.2-6.6μηι，4個孢子。未 見典型的囊狀體。菌褶菌髓平等。菌蓋外皮層為粘皮層，有鎖狀聯(lián)合。
[0031] 對芬娜金針菇進行栽培的方法，通常包括:可選地包括組織分離菌種后制作母種， 制作原種，制作生產(chǎn)種，栽培培養(yǎng)，得到成熟的子實體。
[0032] 上述栽培方法步驟在菌種栽培方法中是廣泛應用的方法，為本領域技術人員所熟 知。
[0033]本發(fā)明進一步對芬娜金針菇CCTCC Μ 2016179的栽培方法進行優(yōu)化，得到一種產(chǎn) 量較高，整齊度較好，生物轉化率較高的栽培方法。
[0034]在一個優(yōu)選的實施例中，芬娜金針菇CCTCC Μ 2016179的栽培方法包括：
[0035] (1)將芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179子實體接種至分離培養(yǎng)基25°C±1°C暗 培養(yǎng)至菌絲基本長滿培養(yǎng)基得到組織分離的菌種，將組織分離的菌種接種至母種培養(yǎng)基25 °C ± 1°C暗培養(yǎng)至菌絲基本長滿斜面得到母種；
[0036]其中，分離母種培養(yǎng)基例如可以為:按照質(zhì)量百分比計包括馬鈴薯18-20%、葡萄 糖1.5-2%、瓊脂1.8-2%、磷酸二氫鉀0.15-0.3%、硫酸鎂0.05-0.15%、維生素 B1微量，其 余為水；
[0037]其中，母種培養(yǎng)基例如可以為：按照質(zhì)量百分比計包括馬鈴薯18-20%、葡萄糖 1.5-2 %、瓊脂1.8-2 %、磷酸二氫鉀0.15-0.3 %、硫酸鎂0.05-0.15 %、維生素 B1微量，其余 為水；
[0038] (2)將母種埋入至原種料中25°C ±1°C暗培養(yǎng)至菌絲基本覆滿料得到原種；
[0039]其中，原種料例如可以為：按照質(zhì)量百分比計包括38-42%棉籽殼、35-40%木肩、 18-20 %麩皮、1-2 %碳酸鈣；
[0040] (3)將原種埋入生產(chǎn)料中25°C ±1°C暗培養(yǎng)至菌絲基本覆滿料得到生產(chǎn)種；
[00411其中，生產(chǎn)種料例如可以為：按照質(zhì)量百分比包括38-42%棉籽殼、35-40%木肩、 18-20 %麩皮、1-2 %碳酸鈣；
[0042] (4)將生產(chǎn)種接種至栽培料袋中，栽培培養(yǎng)至子實體成熟；
[0043]其中，栽培料例如可以為:按質(zhì)量百分比計包括48-52%棉籽殼、28-32%木肩、16-20%麩皮、1-2%糖、1-2%碳酸鈣。
[0044]其中，栽培培養(yǎng)例如包括:將生產(chǎn)種接種至栽培料袋，在25°C ± 1°C、相對濕度60-70 %避光培養(yǎng)，待菌絲長滿栽培料后，25 ± 1°C、相對濕度95 %避光培養(yǎng)3-4天，在避光培養(yǎng) 過程中，在菌面出現(xiàn)水滴后，優(yōu)選更換新風，包括每天2次，每次1小時，避光培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)溫 度5-6°C、相對濕度85-90%條件下，每天光照2小時，維持3-4天后，控制溫度16-20°C、相對 濕度85-90 %、二氧化碳濃度小于5 %，培養(yǎng)至子實體成熟，可以對子實體進行采摘，在培養(yǎng) 至子實體成熟過程中，其中一種方法可以觀察菌蓋開始平展，則可能說明子實體已趨于成 熟，此時就可以開始采收，得到芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179的子實體。
[0045] 上述栽培方法的總體生物轉化率約在70%以上，進一步地，約在80%以上。
[0046]本發(fā)明示例性地給出了的芬娜金針菇CCTCC Μ 2016179,以及優(yōu)選的芬娜金針菇 的栽培方法，該栽培方法可以用于栽培芬娜金針菇CCTCC Μ 2016179,也可以用于栽培芬娜 金針菇的其它菌種，應該理解，其它優(yōu)化的栽培方法，或者本領域公知的栽培方法，只要能 栽培得到芬娜金針菇，同樣適用于選擇用來本發(fā)明中芬娜金針菇的獲得。
[0047] 基因組提取
[0048] 芬娜金針菇的基因組進行提取的方法，采用通常的真菌基因組提取方法即可，提 取得到的基因組總DNA用于PCR擴增的模板，較高質(zhì)量的基因組總DNA可以使得PCR擴增變得 更加有效率和容易完成，目前，常見的真菌基因組的提取方法主要包括例如:酶解法、研磨 法、凍融法、微波法、十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法）、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法、試劑 盒方法等。這些方法通常都可以提出較高質(zhì)量的基因組DNA，能夠滿足后續(xù)的如PCR反應的 基因操作需求，在本發(fā)明中用于芬娜金針菇的分子鑒別或者用于芬娜金針菇的特征核苷酸 序列的得到。
[0049] 芬娜金針菇的基因組提取的原料，在本發(fā)明中，例如:菌絲體，或者例如:子實體。 目前，真菌基因組提取的試劑盒已經(jīng)非常普通，效果也非常突出，在本發(fā)明的實施例中亦有 選用。當然，本發(fā)明的基因組提取并不需要限定某種特定的方法，只要能得到滿足后續(xù)基因 操作需求的基因組DNA。
[0050] 在本發(fā)明提供的一些優(yōu)選實施例中，將芬娜金針菇接種于普通roA培養(yǎng)基上，25°C 暗培養(yǎng)7-10天，收集菌絲體，研磨成粉后采用真菌基因組抽提試劑盒，進行基因組總DNA的 提取。
[0051 ] 引物
[0052]本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，所述引物篩選自任一芬娜金 針菇的特征核苷酸序列或其部分，例如篩選自包含SEQ ID NO. 1或其一部分，或突變率不大 于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。
[0053] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，篩選自任一芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其 部分的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物包括SEQ ID NO.2、SEQ ID N0.4中的一個，及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一個。
[0054] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，篩選自任一芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其 部分的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物為SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5,經(jīng)實驗證實，其 用于鑒別的特異性好。
[0055] ITS序列
[0056]本發(fā)明提供一種鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，所述特征核苷酸序列基本上 包含SEQ ID NO. 1(如圖1所示)或其一部分，或突變率不大于5%或突變率不大于1%或突變 率不大于0.5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。應該理解，本發(fā)明所提供的鑒別芬娜金針菇的 特征核苷酸序列，還包括所提供序列的互補序列，或互補序列的一部分。
[0057] 本發(fā)明提供的上述特征核苷酸序列為芬娜金針菇的內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS)的DNA。
[0058] 真菌的ITS序列是核糖體DNA上的一個非編碼區(qū)域，受外界環(huán)境因素的影響較小， 進化速度快，因而可以提供較為豐富的信息位點。利用真菌ITS序列在屬、種水平上的差異， 設計特異性引物，進行真菌物種的鑒定、檢測。
[0059] 術語"核苷酸序列"可與"核酸"或"多核苷酸"交換使用，指的是核苷酸的雜聚物或 這些核苷酸組成的序列。這些術語同樣可以指DNA或者RNA，可以是單鏈或雙鏈，并且可以相 對于cDNA而言代表正義鏈或負義鏈。
[0060] 在本發(fā)明的核苷酸序列中，堿基包括，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鳥 嘌呤，可以預期，若多核苷酸可以是RNA，那么本發(fā)明中所提供的序列中的T(胸腺嘧啶）以U (尿嘧啶)來代替。
[0061] 本發(fā)明中芬娜金針菇特征核苷酸序列的獲得，可以采用例如以芬娜金針菇基因組 為模板，以通用引物對ITS1(SEQ ID N0.6):5'-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3'和ITS4(SEQ ID NO. 7): 5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '為引物，進行PCR擴增得到。PCR擴增的體系以及擴增 的具體條件可以進行優(yōu)化，包括在示范性實施例中所提供。特別是PCR擴增條件的篩選對于 特征核苷酸序列的得到具有重要的影響，提供一種優(yōu)選篩選得到的ITS序列的PCR擴增條 件，包括 ：941€5111丨11;94°(：1111丨11，55-581€3〇8-458,72°(：1111丨11，共30個循環(huán) ；721€8111丨11。該擴增 條件中的循環(huán)數(shù)會影響得到的ITS的量，也許可以根據(jù)實際情況進行少量的增加或者減少 循環(huán)。PCR擴增得到的樣品經(jīng)測序后得到特征核苷酸序列。測序的方法是本領域的通用方 法，本發(fā)明中并不限定。應該理解和知曉，PCR擴增和測序的過程中，核苷酸序列中的堿基有 千分之的到萬分之的突變或替換的概率，因此，經(jīng)測序得到芬娜金針菇特征核苷酸序列應 該允許和原本的芬娜金針菇的基因組中該段核苷酸序列存在一定的突變率，例如不大于 5%，例如不大于1%，例如不大于0.5%，但這并不會影響該特征核苷酸序列在鑒別方法、鑒 另IJ引物和鑒別試劑盒等中的使用。
[0062] 引物設計
[0063] 引物的設計從本發(fā)明提供的上述芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其部分進行設 計，每一個引物，大約30bp以內(nèi)，或大約25bp以內(nèi)，或大約20bp以內(nèi)，通過多序列比對，在 Genbank中與親緣關系相近的物種，例如柳生金針菇，例如白色金針菇，例如黃色金針菇等 的ITS的DNA序列進行比較，確定芬娜金針菇的ITS的特征核苷酸序列的特異位點，得到合適 的引物。
[0064] 在引物設計時，還可以利用現(xiàn)有的一些引物設計軟件，例如Primer-BLAST，進行引 物的設計，設計得到的引物還可以進一步在Genbank中進行引物特異性驗證，進一步篩選出 特異性好的引物。
[0065]在本發(fā)明提供一些優(yōu)選的實施例中，一種設計篩選芬娜金針菇引物的方法包括， 將測序得到的芬娜金針菇ITS序列在Genbank中與近緣種的ITS序列進行比較分析，確定芬 娜金針^ITS序列的特異位點，利用Primer-Blast軟件設計引物，并且在Genbank中進行引 物特異性驗證，篩選得到可用于鑒別芬娜金針菇的特異性引物。
[0066]本發(fā)明的鑒別芬娜金針菇的引物例如篩選自包含SEQ ID NO. 1或其一部分，或突 變率不大于5%或突變率不大于1%或突變率不大于0.5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。 [0067]在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，篩選自任一芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其 部分的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4中的一個，及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一個。
[0068] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，篩選自任一芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其 部分的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物為SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5,經(jīng)實驗證實，其 特異性好。
[0069] 試劑盒
[0070] 本發(fā)明中所述的"試劑盒"為了開展本發(fā)明的方法的試劑盒，更加具體而言，是鑒 別芬娜金針菇的試劑組合。"試劑盒"可以更加方便地使用，也可以商業(yè)化。
[0071] 更加具體而言，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包含鑒別芬娜金針菇的引物，例如上述的選 自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4中的一個，及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一個組成的引物 對，或者更具體地例如SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5的特異性引物對。
[0072] 本發(fā)明的試劑盒，除包括上述鑒別芬娜金針菇的引物以外，其他任意在鑒別芬娜 金針菇的過程中需要的任意試劑或者輔助材料都可以包括在試劑盒中。
[0073] 在一些鑒別芬娜金針菇的優(yōu)選試劑盒中，還可以包括聚合酶鏈式反應試劑，或者 還可以進一步包括基因組提取試劑，或者還可以包括DNA Marker，或者還可以包括凝膠電 泳試劑，或者還可以包括任意的操作說明書，或者上述這些試劑的任意組合。
[0074] 鑒別方法(PCR)
[0075] 本發(fā)明提供的鑒別芬娜金針菇的方法，采用PCR擴增方法進行鑒別，進行特異性條 帶擴增，確認有無擴增產(chǎn)物，得到擴增產(chǎn)物或特異性擴增產(chǎn)物的樣品為芬娜金針菇，進行特 異性條帶擴增時，采用特異引物對，例如本發(fā)明提供的特征核苷酸引物。
[0076] -種鑒別芬娜金針菇的方法，包括:采用上述本發(fā)明提供的特征核苷酸引物對樣 品的基因組進行PCR擴增，得到約350-550bp條帶的樣品為芬娜金針菇，優(yōu)選約420-520bp條 帶的樣品為芬娜金針燕，進一步優(yōu)選約460-500bp條帶的樣品為芬娜金針燕，例如約480bp 左右條帶的樣品為芬娜金針菇，或優(yōu)選為芬娜金針菇的特征核苷酸序列或其部分的樣品為 芬娜金針菇。
[0077] 鑒別方法對于擴增產(chǎn)物的確認，可以采用測序，或者電泳例如瓊脂糖凝膠電泳的 方法，也可以采用其他常規(guī)的擴增產(chǎn)物的確認方法，只要能滿足確認該擴增產(chǎn)物的大小即 可。
[0078]在一些優(yōu)選的實施例中，一種鑒別芬娜金針菇的方法，每50μ1 PCR擴增的體系包 括:DNA模板lng_500ng、每個引物0· 1-1 Opmol、DNA聚合酶Taq polymerase 5units/yl、dNTP (dATP，dGTP，dTTP 和 dCTP) 2mM/每 dNTP，水等。
[0079] 在一個優(yōu)選的實施例中，一種鑒別芬娜金針菇的方法，以特征引物1( SEQ ID N0.2)和特征引物4(SEQIDN0.5)作為引物，50μlPCR擴增的體系為:DNA模板(50ng/ul)2μ 1，單個引物（l〇ymol/L)2yl，2XTaq PCR Master mix(天根生化科技(北京)有限公司或生 工生物工程(上海)股份有限公司等)25μ1，雙蒸水19μ1。
[0080] 鑒別芬娜金針菇的方法，除了引物的特異性對于鑒別的特異性具有重要的影響 外，鑒別的PCR擴增條件也對鑒別的特異性具有重要影響，本發(fā)明對PCR擴增條件進行大量 篩選，得到一個特異性好的PCR擴增優(yōu)選條件如下。
[0081] 更進一步地，一種鑒別芬娜金針菇的方法，所述PCR擴增條件包括:所述PCR擴增條 件包括：941€5111丨11;(941€3〇8,56°(：(每個循環(huán)降1°(：)3〇8,72 1€4〇8)6個循環(huán)；（941€3〇8,5〇1€ 3〇8,721€4〇8)32個循環(huán)；721€511^11。
[0082] 在一個優(yōu)選的實施例中，鑒別芬娜金針菇的方法包括：以芬娜金針菇基因組為模 板，以特征引物l(SEQIDN0.2)和特征引物4(SEQIDN0.5)作為引物，反應體系溶液為50μ 1總體積：芬娜金針菇基因組0財（50叫/111)2111，每個引物（1(^111〇1/1^)2以1，2\了 &9?〇? Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司或生工生物工程(上海)股份有限公司等)25μ1， ddH20 19μ1。將反應體系溶液第一步驟94°C變性5min后；第二步驟是：溶液在94°C變性30 秒，56 °C退火30s，72 °C延長40秒，在第二步驟條件下循環(huán)6次，并且每循環(huán)一次第二步驟下 的退火溫度降低1°C，再第三步驟是:溶液在94°C變性30秒，50°C退火30s，72°C延長40秒，在 第三步驟條件下循環(huán)32次;最后進一步72°C延長5min，確保延長結束，將得到的擴增產(chǎn)物進 行回收后測序或者進行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約460-500bp的擴增產(chǎn)物的樣品就鑒別 為芬娜金針菇。
[0083] 本發(fā)明的鑒別方法，或鑒別試劑盒，可以用于鑒別芬娜金針菇、其部分、其菌絲體、 其子實體，或其后代的這些都可以使用本發(fā)明的方法進行鑒別。
[0084] 實施例
[0085]實施例1:芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179的栽培方法及得到的子實體及菌絲 體
[0086] 一、栽培方法如下：
[0087] 1、培養(yǎng)基制作：
[0088] (1)分離培養(yǎng)基為：按照質(zhì)量百分比計馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、蛋白胨 0.5%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、維生素 Β1微量，其余為水；
[0089] (2)母種培養(yǎng)基為:按照質(zhì)量百分比計馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫 鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、維生素 Β1微量，其余為水；
[0090] (3)原種料為:按照質(zhì)量百分比計40 %棉籽殼、38 %木肩、20 %麩皮、2 %碳酸鈣；
[0091 ]原種料袋的制備過程為:稱取棉籽殼，經(jīng)水泡濕過夜，按比例混入木肩、麩皮、碳酸 鈣，裝入13cm*25cm耐高溫的透明聚丙稀菌種袋中，折合每袋裝干料250-300g，裝好料后在 袋口套上塑料環(huán)，扣上配套的蓋子，在0.147MPa大氣壓、128 °C高溫高壓濕熱滅菌90min，冷 卻備用，得到可以直接使用的原種料袋；
[0092] (4)生產(chǎn)種料為:按質(zhì)量百分比計40%棉籽殼、38%木肩、20%麩皮、2%碳酸鈣；
[0093]生產(chǎn)種料袋的制作過程基本與原種料袋相同，但所用菌種袋為15cm*30cm耐高溫 的透明聚丙稀菌種袋。折合每袋裝干料350-400g;
[0094] (5)栽培料為：按質(zhì)量百分比計50 %棉籽殼、30 %木肩、18 %麩皮、1 %糖、1 %碳酸 鈣；
[0095] 栽培料袋的制作過程基本與原種料袋相同，但配方中在混入木肩、麩皮、碳酸鈣時 按比例一并混入糖，所用菌種袋采用15cm*30cm耐高溫的透明聚丙烯菌種袋，折合每袋裝干 料300-350g;
[0096] 2、組織分離菌種：將芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179子實體接種至分離培養(yǎng) 基25°C ± 1°C暗培養(yǎng)至菌絲基本長滿培養(yǎng)基得到組織分離的菌種；
[0097] 3、將組織分離的菌種接種至母種培養(yǎng)基，25°C 土 1°C暗培養(yǎng)至菌絲基本長滿斜面 得到母種，母種長滿的時間約需要10天至15天；
[0098] 4、將母種接種至原種料袋中，確保母種埋入原種料中，25°C ± 1°C暗培養(yǎng)至菌絲基 本吃滿料得到原種，該過程約需要30天左右；
[0099] 5、將原種接種至生產(chǎn)料袋中，確保原種埋入生產(chǎn)料中，25°C±1°C暗培養(yǎng)至菌絲基 本吃滿料得到生產(chǎn)種，該過程約需要30天左右；
[0100] 6、將生產(chǎn)種接種至栽培料袋中，在25°C ± 1°C、相對濕度60-70 %避光培養(yǎng)，待菌絲 長滿栽培料后(該過程約需要30天左右），打開栽培袋蓋子，將栽培袋豎排放置，袋與袋之間 適當留有空隙，25 ± 1°C、相對濕度95%避光培養(yǎng)，待菌面出現(xiàn)水滴后，每天更換新風2次，每 次1小時，3-4天后，調(diào)節(jié)溫度5-6°C、相對濕度85-90%條件下，每天光照共2小時，分早、中、 晚分別進行，維持3-4天后，控制溫度18°C、相對濕度85-90%、二氧化碳濃度小于5 %，培養(yǎng)， 約經(jīng)1-2天原基即可長出，待幼菇長至3-4cm后，將袋口豎起，直至菌柄長至12cm以上，菌蓋 開始平展，說明子實體已趨成熟，即可采收，從長出幼菇到子實體成熟約需5-7天。
[0101] 實施例2:芬娜金針菇的特征核苷酸序列以及特征核苷酸引物的獲得
[0102] 1、芬娜金針菇基因組DNA模板的提取
[0103]芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179接種于普通PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，瓊脂20g，水1000ml)上，25°C暗培養(yǎng)7-10天，收集菌絲體，研磨成粉后采用Ezup柱式真 菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)進行總DNA提取，獲得芬娜金針菇的基因組總DNA。
[0104] 2、芬娜金針菇的rDNA ITS序列擴增及測序
[0105] 以芬娜金針菇基因組總D N A為模板，以通用引物對I T S 1 : 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ' 和 ITS4:5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' 為引物，反應體系為 50μ1 總體積：2XTaq PCR Master mix(生工生物工程（上海）股份有限公司）25yl，DNA模板 (50ng/ul) lul，ddH20 20μ1，每個引物（10ymol/L)2μ1 JCR反應條件為：94°C5min; 94°C lmin，55°C45s
[0106] PCR擴增得到，ITS-PCR產(chǎn)物，將ITS-PCR產(chǎn)物進行條帶回收，測序，獲得序列長 764bp，如SEQ ID N0.1 或圖 1 所示。
[0107] 3、基于ITS序列的特異性引物對的設計及獲得
[0108] 將獲得的芬娜金針菇的ITS序列（SEQ ID N0.1序列）與GenBank數(shù)據(jù)庫中芬娜金針 菇及其近緣種的ITS序列進行比較分析，確定芬娜金針菇ITS序列上的特異位點，利用NCBI 中Primer-BLAST(引物設計和特異性檢驗工具)設計引物并同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行引 物特異性驗證，最終篩選出芬娜金針菇特異性引物共四個，如表1所示。
[0109] 表1:篩選得到的芬娜金針菇特異性引物
[0111]將得到的引物對在芬娜金針菇和近緣種的幾種金針菇上進行PCR擴增驗證，其中， 特征引物1、特征引物2作為上游引物，特征引物3、特征引物4作為下游引物，兩兩組合，確認 獲得的4個引物組成的引物對可以實現(xiàn)芬娜金針菇的特異性鑒別。
[0112]實施例3:芬娜金針菇的鑒別方法 [0113](一)實驗樣品：
[0114] 實驗樣品分別為市場上購買或野外采集到的金針菇菌種，共12個菌種，包括:樣品 1金針菇E141398;樣品2柳生金針菇E141531;樣品3柳生金針菇W141696;樣品4柳生金針菇 W141699;樣品5金針菇S140014;樣品6芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179;樣品7柳生金針 菇Ε141870;樣品8柳生金針菇Ν140864;樣品9金針菇Ν140982;樣品10柳生金針菇 (Flammulina rossica)N140925;樣品 11柳生金針燕附40951;樣品 12金針^(Flammulina velutipes)S140271。
[0115] (二)鑒別方法：
[0116] 1、基因組DNA模板的提取
[0117]分別收集各樣品的菌絲體，研磨成粉后采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒 (上海生工)進行總DNA提取，獲得各樣品的基因組總DNA。
[0118] 2、特異性條帶的擴增
[0119] 以各樣品的基因組DNA作為模版，以特征引物1(SEQ ID N0.2)和特征引物4(SEQ IDN0.5)作為引物，反應體系分別為50μl總體積:2XTaqPCRMastermix(天根生化科技 (北京)有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司）25yl，DNA模板(50ng/ul)lul，ddH 20 20μ 1，引物(1 Ομπιο 1 /L) 2μ 1 X 2。PCR反應條件：
[0121] 將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，其結果如圖2所示。
[0122] 圖2按照樣品1-12的順序分別編號為1-12泳道，13泳道為DNA Marker D，編號為Μ， 從下往上長度分別代表l〇〇bp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[0123] 由圖2可以看出，采用特征引物1(SEQ ID NO.2)和特征引物4(SEQ ID NO.5)時，只 有第6泳道(樣品6)能夠擴增出大小為接近500bp的特異性片段，而其他樣品均沒有擴增到 任何片段，表明樣品6為芬娜金針菇新菌種CCTCC Μ 2016179,結論準確，特異性高。
[0124] 所以本發(fā)明中采用特征引物1(SEQ ID Ν0.2)和特征引物4(SEQ ID Ν0.5)進行芬 娜金針菇的鑒別具有極高的特異性，因此可以用于芬娜金針菇菌絲體、子實體及其相關制 品的快速鑒定。
[0125] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實施例，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其 構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，其特征在于，所述特征核苷酸序列基本上包含 SEQ ID NO. 1或其一部分，或突變率不大于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。2. 鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，其特征在于，所述引物篩選自權利要求1所述的 特征核苷酸序列。3. 根據(jù)權利要求2所述的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸引物，其特征在于，所述引物選 自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4中的一個，及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一個，優(yōu)選為SEQ ID NO.2、及SEQ ID NO.5。4. 鑒別芬娜金針菇的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含所述權利要求2或3的引物。5. 根據(jù)權利要求4所述的鑒別芬娜金針菇的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括聚 合酶鏈式反應試劑、和/或基因組提取試劑、和/或說明書、和/或DNA Marker、和/或凝膠電 泳試劑。6. 鑒別芬娜金針菇的方法，其特征在于，所述方法包括:對樣品的基因組進行PCR擴增， 得到約350bp-550bp條帶的樣品為芬娜金針菇，優(yōu)選約420-520bp條帶的樣品為芬娜金針 菇，進一步優(yōu)選約460-500bp條帶的樣品為芬娜金針菇，或更優(yōu)選為權利要求1所述的特征 核苷酸序列的樣品為芬娜金針菇。7. 根據(jù)權利要求6所述的鑒別芬娜金針菇的方法，其特征在于，所述方法包括:采用權 利要求2-4中任一權利要求所述的特征核苷酸引物對樣品的基因組進行PCR擴增，得到約 350bp-550bp條帶的樣品為芬娜金針菇，優(yōu)選為約420bp-520bp條帶的樣品為芬娜金針菇， 進一步優(yōu)選約460-500bp條帶的樣品為芬娜金針菇，或更優(yōu)選為權利要求1所述的特征核苷 酸序列的樣品為芬娜金針菇。8. 根據(jù)權利要求7所述的鑒別芬娜金針菇的方法，其特征在于，所述PCR擴增條件包括： 941€5111丨11 ;(941€3〇8,56°(：(每個循環(huán)降1°(：)3〇8,721€4〇8)6個循環(huán) ；（941€3〇8,5〇1€3〇8,72 °〇4〇8)32個循環(huán) ；721€511^11。9. 根據(jù)權利要求6-8中任一權利要求所述的鑒別芬娜金針菇的方法，其特征在于，所述 基因組為基因組總DNA;和/或所述基因組中DNA提取自菌絲體。10. 根據(jù)權利要求1所述的鑒別芬娜金針菇的特征核苷酸序列，其特征在于，所述芬娜 金針燕為芬娜金針燕Flammulina fennae，保藏編號為CCTCC M 2016179。
【文檔編號】C12N15/11GK105886647SQ201610373090
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】胡惠萍, 譚武平, 黃龍花, 劉遠超, 黃志勇, 吳麗霞
【申請人】廣東省微生物研究所, 廣東粵微食用菌技術有限公司