一種β-淀粉酶的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種β-淀粉酶的檢測方法，包括β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法。本發(fā)明使用SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色的方法檢測β-淀粉酶的分子量，從而確定β-淀粉酶的存在，該方法簡單易操作。本發(fā)明使用硫代硫酸鈉滴定代替?zhèn)鹘y(tǒng)的淀粉-碘滴定，根據(jù)使用的硫代硫酸鈉的量計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)可溶性淀粉在β-淀粉酶催化作用下消耗的淀粉的量，以酶的催化速率來代表酶的活力單位。本發(fā)明的檢測方法滴定終點(diǎn)容易判斷，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高。本發(fā)明又以碘化鉀和碘酸鉀在酸性條件下生成碘的方式來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的直接使用碘溶液滴定的方式，避免了碘溶液易揮發(fā)造成的滴定終點(diǎn)判斷失誤的發(fā)生，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)本發(fā)明檢測β-淀粉酶活力的方法測定線性范圍廣，重復(fù)性好，適合工業(yè)和臨床應(yīng)用。
【專利說明】—種β-淀粉酶的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢驗(yàn)測定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言涉及β-淀粉酶的檢測方法，更具體而言，本發(fā)明涉及β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]淀粉酶是一種水解酶，是目前發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一類酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4_糖苷鍵的酶，根據(jù)作用的方式可分為α-淀粉酶與β-淀粉酶。
[0003]α -淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山崳菜)及微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。此酶以Ca2+為必需因子并作為穩(wěn)定因子，既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，無差別地切斷α-1，4_鏈。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應(yīng)的消失，最終產(chǎn)物在分解直鏈淀粉時(shí)以麥芽糖為主，另一方面在分解支鏈淀粉時(shí)，除麥芽糖外，還生成分支部分具有α-1，6_鍵的α-極限糊精。
[0004]β -淀粉酶與α -淀粉酶的不同點(diǎn)在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷α-1，4_葡聚糖鏈。主要見于高等植物中(大麥、小麥、甘薯、大豆等)，但也有報(bào)告在細(xì)菌、牛乳、霉菌中存在。對(duì)于像直鏈淀粉，如可溶性淀粉那樣沒有分支的底物能完全分解得到麥芽糖。作用于支鏈淀粉或葡聚糖的時(shí)候，切斷至α-1，6_鍵的前面反應(yīng)就停止了，因此生成分子量比較大的極限糊精。
[0005]SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色法是常見的蛋白質(zhì)分離方法。但是使用該方法來檢測β -淀粉酶的分子量，還未見報(bào)道。
[0006]現(xiàn)在已有的檢測β_淀粉酶活力的方法主要包括:黏度測定法、比濁法、糖化法、淀粉-碘比色法、酶速率法與染料釋放法等。其中，黏度測定法和比濁法由于影響因素較多，缺乏特異性和靈敏度，己被淘汰。糖化法雖然可以直接測定酶活性，但是操作復(fù)雜。目前應(yīng)用較為廣泛的是碘量法、酶速率法和染料釋放法。其中，淀粉-碘法因具有成本低、檢測不需要昂貴儀器、試劑穩(wěn)定、操作簡便、結(jié)果可靠，所以應(yīng)用范圍最廣。
[0007]淀粉-碘比色法測定β -淀粉酶的基本原理是:淀粉在β -淀粉酶的作用下生成部分糊精，淀粉與碘結(jié)合生成紫藍(lán)色的絡(luò)合物，而糊精與碘結(jié)合生成紅棕色絡(luò)合物，測定酶促反應(yīng)分解一定量淀粉的時(shí)間，以紅色糊精與碘反應(yīng)的顏色作為終點(diǎn)指示(所給定的淀粉都已轉(zhuǎn)化為糊精的時(shí)間)，用此方法的酶活力定義:60°C I小時(shí)內(nèi)將Ig淀粉轉(zhuǎn)化為糊精的酶量為一個(gè)酶活力單位:
[0008]酶活力單位=60/t*20*2%*Ν/0.5 = 48N/t (U/ml)
[0009]t為反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)所需要的時(shí)間；
[0010]N為酶的稀釋倍數(shù)
[0011]但是淀粉-碘比色法測定β -淀粉酶活力存在以下缺點(diǎn):紅棕色滴定終點(diǎn)的觀察因人而異，滴定終點(diǎn)不明顯，存在誤差較大，并且在碘滴定的過程中，由于碘液易升華揮發(fā)造成成分減少影響顯色反應(yīng)，致使檢測結(jié)果準(zhǔn)確性降低。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測β -淀粉酶分子量的方法。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確性高的檢測β -淀粉酶活力的方法。
[0014]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0015]檢測β -淀粉酶分子量的方法，包括:
[0016]步驟1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備取分子量測定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子量范圍30~66kD)適量，加蛋白上樣緩沖液[取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚藍(lán)溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻]制成每I μ I中含10μ g蛋白的溶液。臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0017]步驟2、待測樣品溶液的制備取待測樣品適量(按蛋白含量計(jì)算)，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0018]步驟3、電泳分離照SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，電泳分離蛋白。
[0019]步驟4、染色步驟3結(jié)束后，將電泳膠放到染色液中(含0.2% (W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250,45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加熱煮沸染色2分鐘。
[0020]步驟5、脫色步驟4結(jié)束后，將電泳膠放入脫色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加熱煮沸脫色10分鐘。
[0021]步驟6、計(jì)算分子量以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)，以遷移率為橫座標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測樣品的分子量。
[0022]檢測β -淀粉酶活力的方法，包括:
[0023]步驟1、在ΡΗ5.5的緩沖液中，待測樣品與可溶性淀粉混合得到混合液，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后使用lmol/L鹽酸終止反應(yīng)。
[0024]步驟2、加入麥芽糖酶與上述混合液反應(yīng)(足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麥芽糖完全分解成葡萄糖)，使用2.6mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)。
[0025]步驟3、碘化鉀與酸性碘酸鉀混合加入到步驟2所得的混合液中。
[0026]步驟4、在步驟3所得的混合液中加入氫氧化鈉暗處放置，再加入硫酸，用硫代硫酸鈉滴定。
[0027]步驟5、設(shè)置空白對(duì)照(在步驟I中不加待測樣品，只加入同體積的緩沖液)。每Iml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于9.008mg無水葡萄糖。按下式計(jì)算β _淀粉酶的活力。
[0028]每Ig 含淀粉酶活力單位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff))
[0029]式中
[0030]A為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ；
[0031]B為空白消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ；
[0032]F為硫代硫酸鈉滴定液的濃度換算值，mol/L ；
[0033]W為供試品取樣量，g ；
[0034]η為供試品稀釋倍數(shù)，200。
[0035]在上述條件下，每分鐘水解160 μ g淀粉(相當(dāng)于最終生成I μ mol葡萄糖)的酶量，為I個(gè)β -淀粉酶活力的單位。
[0036]待測樣品處理:取本品0.3g，精密稱定，置研缽中，加冷至5°C以下的磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀13.61g與磷酸氫二鈉35.80g，加水使溶解成1000ml，調(diào)節(jié)pH值至5.5)少量，研磨均勻，加上述磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成每Iml中含淀粉酶10-20單位的溶液。
[0037]優(yōu)選地，碘酸鉀與碘化鉀的摩爾比是1:4-1:6。
[0038]優(yōu)選地，酸性碘酸鉀濃度為5-8mmol/L (pH2.0)。
[0039]本發(fā)明檢測方法提供了一個(gè)適宜的酸性環(huán)境，待測樣品與可溶性淀粉在pH5.5的緩沖液中混合。PH5.5的緩沖液包括:磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液和磷酸鹽緩沖液。作為優(yōu)選，本發(fā)明檢測方法中PH5.5的緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
[0040]優(yōu)選地，可溶性淀粉為I %可溶性淀粉溶液。
[0041]1 %可溶性淀粉溶液處理:取經(jīng)105°C干燥2小時(shí)的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，攪勻后，邊攪拌邊添加lOmol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L鹽酸使溶液的pH值為5.5，加水稀釋至100ml。
[0042]本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下:(I)本發(fā)明首次將SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色的方法用于檢測β_淀粉酶的分子量，該實(shí)驗(yàn)方案具有創(chuàng)新性；(2)本發(fā)明以硫代硫酸鈉滴定代替?zhèn)鹘y(tǒng)的淀粉-碘滴定檢測β -淀粉酶活力，克服了淀粉-碘滴定法滴定終點(diǎn)顏色判斷困難的缺點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確；(3)本發(fā)明以碘化鉀和酸性碘化鉀作為顯色液，碘化鉀和碘酸鉀在酸性條件下生成碘，與未反應(yīng)的可溶性淀粉結(jié)合的形成藍(lán)色復(fù)合物，避免直接使用碘液易升華揮發(fā)造成成分減少變淡影響反應(yīng)顯色，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；(4)本發(fā)明提供了一種使用NaOH室溫溶解可溶性淀粉的方法。該方法比以加熱煮沸的方式來實(shí)現(xiàn)可溶性淀粉溶解的方法更省時(shí)，更安全；(5)利用本發(fā)明檢測β_淀粉酶活力的方法測定的β_淀粉酶活力值更接近使用HPLC測定的β_淀粉酶活力值，因此本發(fā)明的檢測方法具有很高的準(zhǔn)確性；(6)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，本發(fā)明β_淀粉酶活力的檢測方法可測定的線性范圍廣(高達(dá)1600U/g)，同時(shí)具有很好的重復(fù)性。使用硫代硫酸鈉滴定法檢測大麥芽中提取的β -淀粉酶活力還未見相關(guān)報(bào)道，因此本發(fā)明的檢測方法具有創(chuàng)新性。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限實(shí)施例表示的范圍。
[0044]實(shí)施例1SDS-PAGE檢測β -淀粉酶的分子量
[0045]標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備:取分子量測定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子量范圍30kD~66kD)適量，加蛋白上樣緩沖液[取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml,0.5% (W/V)溴酚藍(lán)溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻]制成每I μ I中含10 μ g蛋白的溶液。臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0046]待測樣品溶液的制備:取待測樣品適量(按蛋白含量計(jì)算)，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0047]電泳分離:照SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，電泳分離蛋白。[0048]染色:將電泳膠放到染色液中(含0.2% (W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加熱煮沸染色2分鐘。
[0049]脫色:將染色后的電泳膠放入脫色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加熱煮沸脫色10分鐘。
[0050]計(jì)算分子量:以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)，以遷移率為橫座標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測樣品的分子量。
[0051]結(jié)果分析:待測樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，染色后可檢測到高分子量的譜帶一條(數(shù)據(jù)未顯示)，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相比較，得出β_淀粉酶的分子量(表1)。由表可以看出，蛋白條帶的分子量是54.26kD，這與文獻(xiàn)報(bào)道的β -淀粉酶的分子量約60kD的結(jié)果是一致的。
[0052]表1 β -淀粉酶的分子量測定結(jié)果
[0053]
【權(quán)利要求】
1.β-淀粉酶的檢測方法，其特征在于，所述方法包括β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶分子量的檢測方法包括以下步驟: 步驟1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備取分子量測定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分子量范圍30kD-66kD，適量，加蛋白上樣緩沖液，所述上樣緩沖液配制方法為:取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚藍(lán)溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻制成每1μ I中含IOyg蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻； 步驟2、待測樣品溶液的制備取待測樣品適量，按蛋白含量計(jì)算，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻； 步驟3、電泳分離照SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，電泳分離蛋白； 步驟4、染色步驟3結(jié)束后，將電泳膠放到染色液中，所述染色液配方為:0.2% (W/V考馬斯亮藍(lán)G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸，然后加熱煮沸染色2分鐘；步驟5、脫 色步驟4結(jié)束后，將電泳膠放入脫色液中，所述脫色液配方為:7.5%乙酸和5%甲醇，然后加熱煮沸脫色10分鐘； 步驟6、計(jì)算分子量以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)，以遷移率為橫座標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得待測樣品的分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶活力的檢測方法包括以下步驟: 步驟1、在ρΗ5.5的緩沖液中，待測樣品與可溶性淀粉混合得到混合液，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后使用lmol/L鹽酸終止反應(yīng)并將混合液pH調(diào)到6.5 ； 步驟2、加入麥芽糖酶與上述混合液反應(yīng)，其中，加入的麥芽糖酶足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麥芽糖完全分解成葡萄糖，然后使用2.6mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)；步驟3、碘化鉀與酸性碘酸鉀混合加入到步驟2所述的混合液中； 步驟4、在步驟3所述的混合液中加入氫氧化鈉暗處放置，再加入硫酸，用硫代硫酸鈉滴定； 步驟5、設(shè)置空白對(duì)照:在步驟I中不加所述待測樣品，只加入同體積的所述緩沖液，每Iml濃度為0.05mol/L的碘滴定液相當(dāng)于9.008mg無水葡萄糖,按下式計(jì)算β -淀粉酶的活力: 每 Ig 含淀粉酶活力單位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff)) 式中 A為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ； B為空白消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ； F為硫代硫酸鈉滴定液的濃度換算值，mol/L ； W為供試品取樣量，g ； η為供試品稀釋倍數(shù)，200， 在上述條件下，每分鐘水解160 μ g可溶性淀粉，相當(dāng)于最終生成I μ mol葡萄糖的酶量，為I個(gè)β -淀粉酶活力的單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述pH5.5緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測樣品處理如下:取酶制劑0.3g，精密稱定，置研缽中，加冷至5°C以下的pH5.5的緩沖液中磷酸鹽緩沖液少量，所述磷酸鹽緩沖液的配制方法為:取磷酸二氫鉀13.61g與磷酸氫二鈉35.80g，加水使溶解成1000ml，調(diào)節(jié)pH值至5.5，然后研磨均勻，加上述磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成每Iml中含淀粉酶10-20單位的溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述可溶性淀粉為I%的可溶性淀粉溶液，處理如下:取經(jīng)105°C干燥2小時(shí)的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，攪勻后，邊攪拌邊添加lOmol/L NaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L鹽酸使溶液pH值為5.5，加水稀釋至100ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述碘酸鉀與所述碘化鉀的摩爾比是1:4-1:6。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述酸性碘酸鉀濃度為5mm0l/L-8mm0l/L，pH為2.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述麥芽糖酶加入量為150U-200U麥芽糖酶/g淀粉。
【文檔編號(hào)】C12Q1/40GK103789400SQ201410070480
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】王發(fā)善, 韓振遠(yuǎn), 褚弘斌, 陳玉忠 申請(qǐng)人:多多藥業(yè)有限公司