一種可被4’磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列及其用于固定蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的 序列及其用于固定蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 固定化蛋白（酶）呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù) 及可控、工藝簡(jiǎn)便等一系列優(yōu)點(diǎn)，而且因?yàn)榫哂泄?jié)省資源與能源、減少或防治污染的生態(tài)環(huán) 境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求，在生物醫(yī)藥、食品、生物分析及生物學(xué)的基礎(chǔ)研宄領(lǐng) 域具有廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的蛋白（酶）固定方法包括包埋法、交聯(lián)法、吸附法及共價(jià)結(jié)合法 來(lái)實(shí)現(xiàn)酶的固定化。包埋法制備工藝簡(jiǎn)便且條件較為溫和、可獲得較高的蛋白（酶）活力 回收。交聯(lián)法利用游離蛋白（酶）的氨基酸殘基與雙官能團(tuán)或多功能團(tuán)交聯(lián)劑反應(yīng)而被固 定化，可獲得單位濃度較高的固定化蛋白（酶）。吸附法包括物理吸附和離子結(jié)合法，工藝 簡(jiǎn)便及條件溫和是其顯著特點(diǎn)。目前上述的各種酶固定化方法存在各自的不足，包埋法中 高分子凝膠或半透膜的分子尺寸選擇性不利于大分子底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散，交聯(lián)法因?yàn)檩^激 烈的共價(jià)反應(yīng)而使蛋白（酶）活力損失較大，吸附法中固定的蛋白（酶）易受反應(yīng)介質(zhì)PH、 離子強(qiáng)度等的影響而從載體上脫落。共價(jià)結(jié)合法因蛋白（酶）分子與載體之間的共價(jià)結(jié)合 而呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，是目前研宄最為活躍的一類蛋白（酶）固定化方法，然 而非定向的共價(jià)固定由于蛋白（酶）在固體介質(zhì)表面的不均勻分布，常導(dǎo)致蛋白（酶）活性 損失較大。目前已開發(fā)的蛋白（酶）定向固定化方法，如利用蛋白（酶）與相應(yīng)抗體的特 異性作用、蛋白（酶）與相應(yīng)配基的特異性相互作用等，操作流程復(fù)雜，效率較低，這些不足 限制了固定化蛋白（酶）的廣泛應(yīng)用，成為急待解決的主要問(wèn)題。目前現(xiàn)有的蛋白質(zhì)（酶） 固定化技術(shù)操作流程復(fù)雜，缺乏特異性。開發(fā)簡(jiǎn)便、溫和、適用的固定化方法等是目前固定 化蛋白（酶）研宄的重要方向，也是目前研宄熱點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種可被4' -磷酸泛 酰巰基乙胺修飾的序列。
[0004] 本發(fā)明的另一目的提供基于上述的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定 蛋白質(zhì)的方法。
[0005] 本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)：一種可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾 的序列，優(yōu)選為如核苷酸序列SEQIDNO: 1所示的大腸桿菌酰基載體蛋白（ACP)基因序列 或如核苷酸序列SEQIDNO: 2所示的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽基因中的一 種。
[0006] 上述的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，所編碼的具有生物活性的短肽， 其氨基酸序列為SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。
[0007] -種重組表達(dá)載體，包含上述的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，用于將 目的蛋白與其融合表達(dá)。
[0008] 上述的重組表達(dá)載體的具體制備步驟為：將可被4' _磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序 列與目的基因重組融合構(gòu)建到表達(dá)載體獲得；所述的表達(dá)載體優(yōu)選為表達(dá)載體PET系列載 體。
[0009] 一種包含上述重組表達(dá)載體的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)；具體為：將上述重組表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)至0D600為0. 5?0. 7,加入終濃度 為0. 5mM的異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，于30°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)10h;5000g， lOmin，4°C離心收集菌體，獲得表達(dá)融合目標(biāo)蛋白的大腸桿菌。
[0010] -種基于上述的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定蛋白質(zhì)的方法，由上 述的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得包含目標(biāo)蛋白的融合蛋白，經(jīng)酶AcpS或Sfp催化進(jìn)行 4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾，然后進(jìn)行固定化，實(shí)現(xiàn)固定目標(biāo)蛋白。
[0011] 所述的固定化為在固定化緩沖液中按lmg:0. 2ml的比例將重組蛋白與SulfoLink couplingresin(ThermoScientific)混合，30°C溫浴lh，實(shí)現(xiàn)蛋白固化。
[0012] 所述的固定化緩沖液為 50mmolTrisHCl，5mmolEDTA-Na，pH8. 5。
[0013] 本發(fā)明提供的蛋白（酶）固定化技術(shù)應(yīng)用可被4'-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的蛋白 質(zhì)（短肽）作為融合標(biāo)簽，與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，利用4'-磷酸泛酰巰基乙胺的巰基（-SH) 與固體介質(zhì)上的活性基團(tuán)特異性反應(yīng)，形成牢固的共價(jià)鍵，將目標(biāo)蛋白穩(wěn)定地固定到固體 介質(zhì)上，且目標(biāo)蛋白在固體介質(zhì)表面分布均勻，活性高；同時(shí)進(jìn)行固定化反應(yīng)時(shí)條件溫和， 不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，整個(gè)固定化反應(yīng)可在1小時(shí)內(nèi)完成，效率極尚。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0015] 本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增得到一個(gè)大腸桿菌?；d體蛋白（ACP)基因及合成一個(gè)可被 4'_磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽基因，分別將其與目標(biāo)蛋白（酶）基因融合，建立在大腸 桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得融合的目標(biāo)蛋白（酶），經(jīng)相應(yīng)的酶催化進(jìn)行4' -磷酸泛酰巰基 乙胺修飾，然后進(jìn)行固定化，該固定化方法反應(yīng)條件溫和，操作非常簡(jiǎn)便，固定化效率高，固 定的目標(biāo)蛋白（酶）穩(wěn)定并保持非常高的活性，具有極大的市場(chǎng)價(jià)值與應(yīng)用前景。
[0016] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)（酶）固定化技術(shù)應(yīng)用可被4'-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的蛋 白（短肽）作為融合標(biāo)簽，與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，不僅可以降低目標(biāo)蛋白在表達(dá)過(guò)程中的包 涵體形成，還可以利用4' -磷酸泛酰巰基乙胺上的巰基（-SH)與固體介質(zhì)上的活性基團(tuán)特 異性反應(yīng)，形成牢固的共價(jià)鍵，將目標(biāo)蛋白（酶）穩(wěn)定地固定到固體介質(zhì)上。本專利提供的 技術(shù)可將目標(biāo)蛋白（酶）定向固定，目標(biāo)蛋白（酶）在固體介質(zhì)表面分布均勻，活性高；同 時(shí)進(jìn)行固定化反應(yīng)時(shí)條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)（酶）變性，整個(gè)固定化反應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完 成。該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于固定化蛋白（酶）、生物分析、食品、蛋白質(zhì)分析等領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為大腸桿菌?；d體蛋白（ACP)經(jīng)4'-磷酸泛酰巰基乙胺修飾后介導(dǎo)的綠色 熒光蛋白（GFP)的固定效果圖。A:GFP蛋白的直接固定化（對(duì)照）；B:ACP經(jīng)4' -磷酸泛 酰疏基乙胺修飾后介導(dǎo)的GFP固定化。
[0018] 圖2為4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（GFP)固定效果 圖。A:GFP蛋白的直接固定化（對(duì)照）；B:4'_磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽介導(dǎo)的GFP固 定化。
[0019] 圖3為ACP經(jīng)4'-磷酸泛酰巰基乙胺修飾后介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（GFP)固定化的 時(shí)間梯度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 實(shí)施例1 一個(gè)大腸桿菌酰基載體蛋白（ACP)基因的克隆。
[0022] (1)大腸桿菌總DNA的提取
[0023] 1)挑大腸桿菌MG1655的單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0024] 2) 5000g離心力離心lOmin，收集菌體，參照TIANGEN公司的DNA提取說(shuō)明書，獲得 大腸桿菌的基因組DNA。
[0025] (2)ACP基因的克隆
[0026] 1)設(shè)計(jì)2條引物：
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，其特征在于為如核苷酸序列SEQ ID NO: 1所示的大腸桿菌酰基載體蛋白基因序列或如核苷酸序列SEQ ID N0:2所示的可被 4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽基因中的一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列，其特征在于：所編 碼的具有生物活性的短肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
3. -種重組表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的可被4'-磷酸泛酰巰基乙胺 修飾的序列，將其用于與目的基因融合表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，具體制備步驟為：將可被4'磷 酸泛酰巰基乙胺修飾的序列與目的基因重組融合構(gòu)建到表達(dá)載體獲得；所述的表達(dá)載體為 表達(dá)載體pET系列載體。
5. -種包含上述重組表達(dá)載體的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于具體為：將權(quán) 利要求4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)至0D600為 0. 5?0. 7,加入終濃度為0. 5mM的異丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷，于30°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 10h ;5000g，lOmin，4°C離心收集菌體，獲得表達(dá)融合目標(biāo)蛋白的大腸桿菌。
6. -種基于可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 由權(quán)利要求5的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得包含目標(biāo)蛋白的融合蛋白，經(jīng)酶AcpS或Sfp 催化進(jìn)行4'-磷酸泛酰巰基乙胺修飾，由4'-磷酸泛酰巰基乙胺的高活性巰基介導(dǎo)固定化， 實(shí)現(xiàn)固定目標(biāo)蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于可被4' -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列固定蛋白質(zhì)的 方法，其特征在于：所述的固定化為在固定化緩沖液中按lmg :0. 2ml的比例將重組蛋白與 Sulfo Link coupling resin 混合，30°C溫浴 lh，實(shí)現(xiàn)蛋白固化； 所述的固定化緩沖液為 50mmol Tris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8. 5。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列及其用于固定蛋白質(zhì)的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的序列為如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示的大腸桿菌?；d體蛋白基因序列或如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾的短肽基因中的一種。通過(guò)包含上述序列的表達(dá)載體構(gòu)建的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得包含目標(biāo)蛋白的融合蛋白，經(jīng)酶AcpS或Sfp催化進(jìn)行4’-磷酸泛酰巰基乙胺修飾，然后進(jìn)行固定化，實(shí)現(xiàn)固定目標(biāo)蛋白。該固定化方法反應(yīng)條件溫和，操作非常簡(jiǎn)便，固定化效率高，固定的目標(biāo)蛋白穩(wěn)定并保持非常高的活性，具有極大的市場(chǎng)價(jià)值與應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15-70, C12N15-31, C12N11-00, C12N1-21, C12N15-62, C07K17-00, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104531725
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410820070
【發(fā)明人】王聲斌, 汪華珍, 孫長(zhǎng)勝, 袁啟航, 陳長(zhǎng)超, 洪福林, 馬皖燕
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日