專利名稱：一氧化碳分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及ー氧化碳釋放分子在免疫抑制方面的新用途，具體的說，涉及一種早期應(yīng)用ー氧化碳釋放分子治療皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
同種異基因移植(Allotranspantation)是目前治療器官衰竭終末期的主要途徑。同種異基因皮膚移植作為ー種簡便的器官移植手段，不僅在抗移植排斥的研究中應(yīng)用廣泛，而且在臨床上，一定程度解決了自體皮膚的缺乏以及異種皮膚移植帶來的倫理學(xué)問題。但是接受了同種異基因組織器官移植的個體，移植物MHC抗原被自身免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生排斥。早在18世紀，人類就開始了異體皮膚移植的探索。最初的嘗試都因為無法邁過最初的急性排斥反應(yīng)而最終宣告失敗。到了近代，免疫學(xué)有了突破進展，伴隨著免疫抑制劑的出現(xiàn)和免疫耐受誘導(dǎo)概念的提出，使突破這些障礙成為可能。目前的免疫抑制劑雖然在療效取得一定的突破，但因為缺乏特異性而帶來嚴重的副作用使之仍然無法令人滿意，研制高效低毒特異性強的免疫抑制劑仍然是今后艱巨的任務(wù)。由于皮膚的特殊結(jié)構(gòu)，血液循環(huán)的建立較之行血管吻合的實質(zhì)器官晚，其致敏的發(fā)生場主要在引流淋巴結(jié)，且皮下組織內(nèi)含有大量的郎罕氏巨細胞(LC)，作為ー種專職APC，使同種異基因皮膚移植發(fā)生的急性排斥反應(yīng)尤其劇烈。正因為這樣的特性，加上皮膚移植的直觀性便于連續(xù)觀察排斥狀況，使其成為研究排斥反應(yīng)及相應(yīng)抗排斥手段的最常用模型。目前發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的藥物主要有以下5類化學(xué)制劑類、激素類、真菌代謝產(chǎn)物類、中藥及其有效成分、多克隆和單克隆抗淋巴細胞抗體。環(huán)磷酰胺，是最早用于臨床的烷化劑類免疫抑制劑，作用強大，破壞DNA的結(jié)構(gòu)功能，抑制細胞分裂増殖，從而起到殺傷免疫細胞的作用，但副作用極大，多用于自身免疫性疾病的研究和治療，對于在皮膚移植研究中的應(yīng)用尚無特別報道。環(huán)孢素A(CsA)，為11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽，最早是從真菌代謝產(chǎn)物中提取，可人工合成，選擇性抑制Th細胞產(chǎn)生的細胞因子，特別是對IL-2及其受體的表達，從而一起對IL-2不能反應(yīng)；對體液免疫及炎癥反應(yīng)也有一定作用。他克莫司(FK506)，為新一代真菌肽類免疫抑制劑，作用機理類似CsA，但效能更強大，主要抑制IL-2、IL-3、IFN-y等致炎因子。AG490，為人工合成的苯亞甲基丙ニ腈的脂類衍生物，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置。雷帕霉素，為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，1989年經(jīng)證實有強大的免疫抑制作用，主要是通過阻止IL-2、IL-4對T細胞活化的信號傳導(dǎo)從而抑制了 T細胞増殖周期的Gl期向S期分化，并對體液免疫也有抑制作用，而對非特異性免疫無明顯影響。但是，由于非特異性抗免疫排斥的局限，在長期服用傳統(tǒng)免疫抑制劑的情況下會出現(xiàn)諸多致命的并發(fā)癥，如腫瘤、全身免疫力低下、中樞及肝腎功能損害等等。因此，研究高效、低毒、特異性免疫抑制劑成為當今移植領(lǐng)域的研究熱點。一氧化碳(CO)常溫常壓下是ー種雙原子、小分子的氣態(tài)物質(zhì)，由于ー氧化碳可與機體內(nèi)血紅蛋白結(jié)合生成碳氧血紅蛋白(HbCO)，使得血液運輸氧的能力發(fā)生障礙，高濃度時還可與還原性細胞色素氧化酶的兩價鐵結(jié)合，抑制組織呼吸，故CO在以往被認為是有毒氣體，對CO的研究僅局限于它的生物學(xué)毒性。近年來，大量的研究證實ー氧化碳(CO)與一氧化氮(NO)相類似，也是ー種重要的氣體細胞信使分子，在細胞功能和通訊的調(diào)節(jié)カー面發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用。到1990年代初，Snyder等[6]提出至少在ー種類型的神經(jīng)細胞內(nèi)，CO將不僅僅是副產(chǎn)物且作為cGMP的調(diào)節(jié)分子，它將和NO —樣激活生物信號。Snyder等研究證明，cGMP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺信號傳導(dǎo)中起了重要的作用，而這種作用可被HO的抑制劑阻斷，從而提出了 CO的分子信號作用。
外源性一氧化碳釋放分子(Carbonmonoxide-releasing molecules, CORMs)是近年來新合成的一種ー氧化碳復(fù)合物，該ー氧化碳復(fù)合物的制備方法和理化性能參數(shù)，在Motterlini R等所著文獻(Curr. Pharm. 2003 ；9 :2525-39)中有詳細的報道,該一氧化碳復(fù)合物通常可用于制備緩釋的一氧化碳。上世紀九十年代初,Mahin Maines等提出Heme在大腦內(nèi)由H0-1降解產(chǎn)生的CO激活了 3’，5’-cGMP。CO將不僅僅是副產(chǎn)物，而且是作為cGMP的調(diào)節(jié)分子。H0-1作為體內(nèi)唯一一種催化血紅素(heme)分解代謝的限速酶，對細胞的保護作用最早在急性肺損傷和內(nèi)毒素休克動物模型上被證實當H0-1被抑制劑鋅原卟啉所抑制或不被誘導(dǎo)，移植的心臟很快被排斥；而利用一定濃度的外源性CO處理移植的心臟后，即使H0-1的活性被抑制的情況下，也可防止急性排斥的發(fā)生，并達到與H0-1表達ー樣的效果。H0-1或外源性CO可抑制心血管系統(tǒng)白細胞浸潤及平滑肌細胞的増殖，從而抑制了移植物微血管新生內(nèi)膜的形成。此作用是通過順序激活cGMP、p38MARK途徑，從而表達細胞周期抑制因子p21，使平滑肌細胞周期停留在G1/S階段。根據(jù)我們的前期研究已經(jīng)證實，外源性CO對膿毒癥早期的炎癥反應(yīng)有抑制作用。如能夠?qū)⑺龅末`氧化碳釋放分子用于抑制同種異體移植排斥反應(yīng)中，將為研究開發(fā)新型低毒、高效的免疫抑制劑開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー氧化碳釋放分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用，以滿足臨床應(yīng)用的需要。將所述ー氧化碳釋放分子溶解在溶劑中，然后將其置于細胞培養(yǎng)液或生物體內(nèi)，中可以持續(xù)性釋放CO，作為ー種外源性CO供體，動物試驗發(fā)現(xiàn)，可用于抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，可作為ー種抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物，所述的急性排斥反應(yīng)，包括同種異基因小鼠皮膚移植后，脾臟淋巴細胞分泌功能的增強，或者是同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細胞體外增值能力的增強。因此，所述的ー氧化碳釋放分子C0RM-2，可以用于制備抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物；本發(fā)明以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮膚作為供體和受體建立同種異基因急性排斥反應(yīng)模型，小鼠尾靜脈注射外源性CO，將所述的ー氧化碳釋放分子作為ー種抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物，施加于皮膚移植后的動物，劑量一般7 8mg/kg體重/天，具體可根據(jù)患者的具體情況，由醫(yī)師決定，進行早期干預(yù)，進行試驗，發(fā)現(xiàn)ー氧化碳釋放分子對皮膚移植后急性排斥反應(yīng)有抑制作用。采用所述的ー氧化碳釋放分子抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，其濃度控制相對容易且正確，長期使用時追加方便，可以作為ー種特異性強、低毒、高效的免疫抑制劑，能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。


圖I為移植皮片HE染色光鏡下視野(400倍)。圖2為移植皮片真皮層IL-2免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖3為移植皮片真皮層IL-4免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖4為移植皮片真皮層IL-10免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖5為移植皮片真皮層IFN- Y免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖6為移植皮片真皮層FAS免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖7為移植皮片真皮層FasL免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)。圖8為各組小鼠外周血淋巴細胞增值指數(shù)。
具體實施例方式實施例I外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對同種異基因小鼠皮膚移植后移植物的實驗觀察試驗方法(I)動物及同種異基因小鼠皮膚移植模型以清潔級ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+C0RM-2組，4組異體皮膚移+iC0RM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組；術(shù)后分別依據(jù)每組要求給藥，觀察移植皮片排斥程度，觀察期為7天。于觀察期結(jié)束時，分別取下移植皮片以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)病理HE染色、免疫組化檢測。(2)檢測指標a外源性ー氧化碳釋放分子(CORM) 2對同種異基因小鼠皮膚移植后移植物存活時間的觀察I組、2組自模型建立后僅單籠飼養(yǎng)，正常喂食；3組以DMSO溶解C0RM-2，給藥濃度8mg/kg，按25g體重即每只小鼠注射40M母液8ul，配以152ul生理鹽水，尾靜脈注射160ulC0RM-2稀釋液；4組按照3組的方法配制稀釋液，在室溫下將稀釋液敞開放置24小時后用氮氣驅(qū)趕掉稀釋液內(nèi)的殘余CO后則配成失活的C0RM(iC0RM-2)作為陰性對照，每只小鼠尾靜脈注射160ul ；5組小鼠按照20mg/kg的劑量腹腔注射Csk作為陽性對照，160ul/只。所有給藥均為7天，每天一次，自造模成功后即開始。b外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對同種異基因小鼠皮膚移植物病理學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察移植皮片樣本石蠟切片HE染色步驟1.取材組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μπι切片。2.切片常規(guī)用ニ甲苯脫蠟，梯度濃度こ醇脫水ニ甲苯(I)作用5分鐘，100%こ醇脫水2分鐘，95%的こ醇脫水I分鐘，80%こ醇脫水I分鐘，75%こ醇脫水I分鐘，最后蒸餾水洗滌2分鐘。
3.蘇木素染色5min，自來水沖洗。4.鹽酸こ醇分化30s (提插數(shù)下)。5.自來水浸泡15min或溫水(約50°C ) 5min。
6.置伊紅液2min。移植皮片樣本石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測步驟I質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材井置20%蔗糖溶液(4°C)中過夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.0謹1^3清洗51^11;2加入配好的O. 3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0. OIMKPBS IOOml+質(zhì)量分數(shù)為30%過氧化氫)30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，O. OlMPBS清洗5min ；3 加入配好的O. 3% Triton XlOO (30% Triton X100+0. OIMKPBS 100ml) 30min，以增加細胞的通透性，0. OIMKPBS清洗5min ；4加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白I. 00g+0. OlMPBS IOOml+疊氮納O. 08g)稀釋的ー抗，4°C存放24-48h ;吸去抗體，O. 01MKPBS洗5min ;5加入O. 01MKPBS稀釋的的ニ抗，室溫孵育2h。O. OIMKPBS洗5min ；6加入ABC復(fù)合物之類的抗體，室溫孵育2h，0. OIMKPBS洗5min ;蒸懼水迅速沖三次；7加入顯色液，進行免疫組織化學(xué)顯色，時間一般不超過30min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖三次后加入O. OIMKPBS終止反應(yīng)；8梯度酒精脫水之后，封片，拍照。局部移植物免疫組化檢測指標本實驗選擇了白細胞介素2、4、10、IFN-Y及凋亡相關(guān)蛋白FAS及其配體FasL共5項指標進行免疫組化檢測。結(jié)果如下a外源性ー氧化碳釋放分子(CORM) 2對同種異基因小鼠皮膚移植后移植物存活時間的觀察表I示50%皮片平均存活時間(median survival time,MST)的觀察在同種異基因小鼠皮膚移植模型中，經(jīng)外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2注射7天的小鼠，其皮片生存時間接近經(jīng)環(huán)孢素A(CsA)腹腔注射7天的小鼠，與對照組相比，皮片生存時間明顯延長。b外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對同種異基因小鼠皮膚移植物病理學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察圖I示5組移植皮片HE染色光鏡下視野(400倍)除了炎性滲出，可見呈藍紫色深染的細胞核分布于皮膚全層，包括皮膚固有的角質(zhì)細胞、成纖維細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞，炎癥細胞包括單核細胞，中性粒細胞、淋巴細胞等。假手術(shù)組組炎癥細胞浸潤程度最低，同種異基因皮膚移植組、異體皮膚移+iC0RM-2組明顯増加，特別是在炎性滲出強烈的區(qū)域，同種異基因皮膚移植+C0RM-2組、異體皮膚移植+CsA組比較假手術(shù)組也明顯增加，但相對同種異基因皮膚移植組、異體皮膚移+iC0RM-2組，炎性細胞浸潤相對減弱。圖1-1，炎癥細胞浸潤程度最低，圖1-2、圖1-4明顯增加，特別是在炎性滲出強烈的區(qū)域，圖1-3、圖1-5組比較圖1-1組也明顯增加，但相對圖1-2、圖1-4，炎性細胞浸潤相對減弱。
圖2示5組移植皮片真皮層IL-2免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖2_1真皮層呈棕黃色染色的IL-2陽性細胞非常稀疏，圖2-1、圖2-4顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽性細胞，胞漿染色均勻，圖2-3、圖2-5組顯示也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖2-2、圖2-4組，說明IL-2在圖2-3、圖2-5組移植物內(nèi)的表達比較圖2-2、圖2-4組有所減弱。圖3示5組移植皮片真皮層IL-4免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖3_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IL-4陽性細胞非常稀疏，圖3-2、圖3-4組顯示，真皮層出現(xiàn)大片深染陽性細胞，胞漿染色均勻，圖3-3、圖3-5顯示，也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖3-2、圖3-4組，說明IL-4在圖3-3、圖3-5組移植物內(nèi)的表達比較圖3-2、圖3-4組有所減少。
圖4示5組移植皮片真皮層IL-10免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖4_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IL-10陽性細胞胞漿染色均勻，分布廣泛，圖4-2、圖4-4組顯示真皮層也有部分深染陽性細胞，但明顯數(shù)量較少，圖4-3、圖4-5組顯示，也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯多于圖4-2、圖4-4，說明IL-10在3、5組移植物內(nèi)的表達比較圖4-2、圖4-4組有所增加。圖5示5組移植皮片真皮層IFN- Y免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖5_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IFN-Y陽性細胞非常稀疏，圖5-2、圖5-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽性細胞，胞漿染色均勻，圖5-3、圖5-5顯示組也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖5-2、圖5-4組，說明IFN-Y在圖5-3、圖5-5組移植物內(nèi)的表達比較圖5-2、圖5-4組有所減少。圖6示5組移植皮片真皮層FAS免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖6_1顯示組真皮層呈棕黃色染色的FAS陽性細胞非常稀疏，圖6-2、圖6-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽性細胞，胞漿染色均勻，圖6-3、圖6-5組顯示也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖6-2、圖6-4組,說明FAS在圖6-3、圖6_5組移植物內(nèi)的表達比較圖6-2、圖6-4組有所減少。圖7示5組移植皮片真皮層FasL免疫組織化學(xué)切片光鏡觀察(400倍)圖7_1組顯示真皮層呈棕黃色染色的FasL陽性細胞非常稀疏，圖7-2、圖7-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽性細胞，胞漿染色均勻，圖7-3、圖7-5組顯示也有不同程度的深染細胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖7-2、圖7-4組，說明FasL在圖7 -3、圖7_5組移植物內(nèi)的表達比較圖7-2、圖7-4組有所減少。實施例2外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細胞功能的影響小鼠同種異基因皮膚移植后的急性排斥反應(yīng)，主要以單核細胞介導(dǎo)T淋巴細胞為主的細胞免疫為主要特點。其中，T淋巴細胞的2個亞群之比(⑶47⑶8+)在反映移植免疫排斥的程度上已經(jīng)得到一定的認識。CD4+T細胞屬于是輔助性T淋巴細胞，是移植免疫應(yīng)答過程中的主要細胞，而CD8+T為細胞毒性T淋巴細胞，在移植免疫應(yīng)答過程中為效應(yīng)細胞，起到一定調(diào)控免疫細胞的作用。CD4+/CD8+比值的升高與急性排斥的程度密切相關(guān)，因而可以作為衡量排斥程度的ー項重要指標。
另外，移植后，淋巴細胞増殖能力，以及淋巴細胞分泌功能均反映了脾臟淋巴細胞的功能，最終反映了受體對移植物的排斥能力。同種異基因急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時免疫細胞向外周血釋放重要炎癥因子，如TNF-α、IL-2等，可以加劇受體對移植物的損害。試驗方法 (I)動物及同種異基因小鼠皮膚移植模型以清潔級ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+C0RM-2組，4組異體皮膚移+iC0RM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組，術(shù)后分別依據(jù)每組要求經(jīng)尾靜脈給藥，共給藥7天，每天I次。于觀察期結(jié)束時，在無菌條件下，分別取每只受體小鼠的外周全血、血清。(2)檢測指標I.外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對同種異基因小鼠皮膚移后脾臟T淋巴細胞亞群比例的影響心臟采集小鼠外周全血，取lOOulEDTA抗凝血加20ul熒光單克隆抗體，同時做陰性對照。避光室溫作用20min，以紅細胞裂解液溶去紅細胞后，固定劑固定。流式細胞儀測定，以陰性對照測出本底參數(shù)，設(shè)定陽性參數(shù)值，計算機將讀出陽性值。2、外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細胞體外增值能力的影響每個樣本設(shè)4個板孔，I為增殖本底，3個為實驗孔，小鼠脾臟淋巴細胞懸液按
IX 106濃度IOOul接種于包括增埴本地在內(nèi)的姆個孔板中，12. 5ug/ml刀豆蛋白AlOul及經(jīng)絲裂霉素C預(yù)處理30min的ICR和KM鼠脾淋巴細胞懸液按I X 105濃度IOul分別接種于3個實驗孔中；37°C、5% C02培養(yǎng)培養(yǎng)48小吋，結(jié)束培養(yǎng)前4小時每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入O. 01mol/L pH 7. 2PBS配制的5g/L MTT染液ΙΟμΙ。培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，每孔內(nèi)加入DMSO液150 μ L，搖床振蕩lOmin，使藍紫色結(jié)晶充分溶解，使用酶標儀570nm下測定各孔吸光度。細胞增值率等于測定組吸光度值與對照組吸光度值的比值。I.外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細胞分泌功能的影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作步驟加樣分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液IOOul，余孔分別加標準品或待測樣品IOOul, 37°C反應(yīng)120分鐘。棄去液體,甩干,姆孔加檢測溶液A工作液IOOul(取Iul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制)，37°C，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，毎次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)IOOul，37°C,60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,輕拍將孔內(nèi)液體拍干。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光顯色(30分鐘內(nèi))依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。結(jié)果計算所有OD值減去空白后再計算。繪制標準曲線，查出濃
度統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用X土s差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗。P <0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。差異顯著性檢驗采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件。結(jié)果如下I、T淋巴細胞亞群⑶4+T、⑶8+T的比較圖8示小鼠外周血T淋巴細胞亞群FCM分析姆組FCM圖片各2張，左側(cè)右下象限為⑶4+T占⑶3+T相對百分比(以彩點密度表示)，左上象限為CD8+T占CD3+T相對百分比(以彩點密度表示)，右側(cè)為流式細胞原始圖像，所設(shè)門在T淋巴細胞團，即圖中黑圈所在位置，左側(cè)團塊為B淋巴細胞群，上部細胞團為中性粒細胞、單核細胞、NK細胞等。2、各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群⑶4+/⑶8+ :表2示同種異基因皮膚移植后的小鼠，經(jīng)外源性CO干預(yù)后脾臟T淋巴細胞亞群⑶4+/⑶8+的比值比較對照組顯著下降，與CsA干預(yù)的效果比較接近(表2)。3、淋巴細胞刺激指數(shù)SI = OD (刺激細胞/ConA+反應(yīng)細胞)/OD (增殖底)*100%:圖8示在ConA(藍色條柱)刺激下，1-5組小鼠脾淋巴細胞均出現(xiàn)了相對于增值本底的細胞增殖現(xiàn)象，尤其是在2、4組的淋巴細胞，SI超過了 4，3組C0RM-2實驗組超過3，5組CsA對照組最低，低于2，I組sham組約2. 5左右；在ICR鼠脾淋巴細胞(紅色條柱)刺激下，各組小鼠脾淋巴細胞也發(fā)生了相對本底的增值現(xiàn)象，以1、2、4組最為明顯，3、5組相對明顯抑制，接近1，特別是5組CsA組低于1，即出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象；在KM鼠脾淋巴細胞(黃色條柱)刺激下的情況基本與ICR脾細胞刺激大體趨勢相似。
4、各組小鼠外周血TNF-a、IL-2含量表3示在外源性CO釋放分子干預(yù)7天后，同種異基因小鼠皮膚移植受體外周血TNF-a、IL-2濃度比較對照組有明顯減低，但仍高于CsA組水平。圖8為5組小鼠體外培養(yǎng)脾臟淋巴細胞增殖刺激指數(shù)(SI)在ConA刺激下，1-5組小鼠脾淋巴細胞均出現(xiàn)了相對于增值本底的細胞增殖現(xiàn)象，尤其是在2、4組的淋巴細胞，SI超過了 4，3組C0RM-2實驗組超過3，5組CsA對照組最低，低于2，I組sham組約2. 5左右；在ICR鼠脾淋巴細胞(紅色條柱)刺激下，各組小鼠脾淋巴細胞也發(fā)生了相對本底的增值現(xiàn)象，以1、2、4組最為明顯，3、5組相對明顯抑制，接近1，特別是5組CsA組低于1，即出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象；在KM鼠脾淋巴細胞刺激下的情況基本與ICR脾細胞刺激大體趨勢相似。表I 50%皮片平均存活時間(median survival time, MST)的觀察
權(quán)利要求
1.一氧化碳分子在制備皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的急性排斥反應(yīng)，為同種異基因小鼠皮膚移植后，脾臟淋巴細胞分泌功能的增強。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的急性排斥反應(yīng)，為同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細胞體外增值能力的增強。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項所述的應(yīng)用，劑量為7 8mg/kg體重/天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一氧化碳分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用，發(fā)明人經(jīng)過大量的細胞試驗發(fā)現(xiàn)，將所說的一氧化碳釋放分子溶解在DMSO溶劑中，然后將其置于生物體內(nèi)，可以持續(xù)性釋放CO，故可作為一種外源性CO供體，并以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮膚作為供體和受體建立同種異基因急性排斥反應(yīng)模型，小鼠尾靜脈注射外源性CO，進行早期干預(yù)，進行試驗，發(fā)現(xiàn)一氧化碳釋放分子對皮膚移植后急性排斥反應(yīng)有抑制作用。采用所述的一氧化碳釋放分子抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，其濃度控制相對容易且正確，長期使用時追加方便，可以作為一種特異性強、低毒、高效的免疫抑制劑。
文檔編號A61P37/06GK102614215SQ20121003550
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者孫志偉, 孫炳偉, 孫艷 申請人:江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院