的提取制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于輔酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輔酶Qltl的提取制備方法，通過對自然生態(tài)條件下發(fā)酵的光合細(xì)菌進行濃縮、破壁、皂化、萃取和純化后制得輔酶Qltl純品。
【背景技術(shù)】
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[0002]輔酶Qltl是一種脂溶性抗氧化劑，又名癸烯醌、泛醌、泛癸利酮、輔酵素Q 1(1，其醌式及側(cè)鏈異戊烯基的結(jié)構(gòu)特點，決定了它在生物體內(nèi)具有許多重要生理功能；它參與線粒體氧化磷酸化與ATP的產(chǎn)生過程，也能激活人體細(xì)胞和細(xì)胞能量的營養(yǎng)，具有提高人體免疫力、增強抗氧化、延緩衰老和增強人體活力等功能，且無毒性、無致畸作用、無副作用，使用十分安全，因此醫(yī)學(xué)上廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病，國內(nèi)外廣泛將其用于營養(yǎng)保健品及食品添加劑。2004年，日本厚生省將輔酶Qltl批準(zhǔn)為食品添加劑，正式用于飲料、糖果、糕點、乳酪、和酸奶中；美國FDA在2003年正式將輔酶Qltl應(yīng)用于食品中，并于2004年9月批準(zhǔn)將液體輔酶Qltl作為食品添加劑；在我國，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2006年9月25日出臺了《以輔酶Qltl作為原料保健食品申報與審批規(guī)定》，此文件的頒布使輔酶Q K1正式進入保健食品市場。
[0003]目前，輔酶Qltl的生產(chǎn)方法大致有發(fā)酵法、半合成法、全合成法、生物提取法和細(xì)胞培養(yǎng)法，上世紀(jì)八十年代初，日本最早實現(xiàn)了從煙葉中提取茄呢醇為原料合成生產(chǎn)輔酶Q1q，使得輔酶Qltl的成本大幅度下降，這對于輔酶Q K1的應(yīng)用、普及和推廣起到了重要的推動作用；半化學(xué)合成法技術(shù)上比較成熟，已實現(xiàn)了工業(yè)化，產(chǎn)品成本低，價格適中，但是使用半化學(xué)合成法生產(chǎn)的產(chǎn)品雖然在價格上存在優(yōu)勢，但在使用上與用生物提取法生產(chǎn)的產(chǎn)品相比還有較大差距，這是因為生物提取法生產(chǎn)的91(|是天然的、有機的，易于被人體吸收轉(zhuǎn)化，而化學(xué)合成法生產(chǎn)的Qltl是人工化學(xué)合成的，生物活性極差、不易被人體吸收，難以充分發(fā)揮輔酶Qltl的藥理作用；自1977年發(fā)達國家實現(xiàn)了用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Qltl后，近幾年微生物發(fā)酵提取法得到了長足的發(fā)展。例如有中國專利200810225225.1公開的一種從微生物中提取輔酶Qltl的方法；中國專利200810062350.5公開的一種利用鞘氨醇單胞菌發(fā)酵萃取耦合制備輔酶Qltl的方法；中國專利200810114118.1公開的一種超臨界CO 2條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Qltl的方法；中國專利200910094263.2公開的一種將氧化型輔酶Q 1(|制備并純化為還原型輔酶Qltl的方法；中國專利201310667868.2公開的一種從微生物中分離純化輔酶Qltl的方法等等；上述專利技術(shù)中均存在產(chǎn)品輔酶Q K1純度不高、生產(chǎn)原料成本高、制備條件苛刻等缺點。
[0004]研宄發(fā)現(xiàn)，在光合細(xì)菌中所含B族維生素種類豐富，尤其是B12、葉酸、生物素等；而在酵母中幾乎不含有的種類，特別是輔酶Qltl在光合細(xì)菌中含量較多，尤其是沼澤紅假單胞菌其輔酶Qltl的含量高達3900ug/g干細(xì)胞。因此，本發(fā)明研宄出一種新型的基于光合細(xì)菌發(fā)酵法來萃取沼澤紅假單胞菌中輔酶Qltl的方法，從而實現(xiàn)低成本、大批量的產(chǎn)業(yè)化提取制備輔酶Qltl,所涉及的光合細(xì)菌發(fā)酵法為已經(jīng)授權(quán)的專利，專利號為201010590805.8，發(fā)明名稱為“一種自然生態(tài)條件的光合細(xì)菌發(fā)酵方法”。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，尋求設(shè)計提供一種輔酶Qltl的提取制備方法，以在自然生態(tài)條件下發(fā)酵的光合細(xì)菌為原料，經(jīng)濃縮、破壁、皂化、萃取、純化后制得純品輔酶Q1Ci。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的提取制備方法具體包括以下工藝步驟:
[0007](I)細(xì)菌發(fā)酵:將培養(yǎng)用水加入透光容器后，加入培養(yǎng)用水重量0.1 %的消毒劑，攪拌均勻、靜置后過濾得滅菌清液；向滅菌清液中加入培養(yǎng)用水重量I %的細(xì)菌培養(yǎng)劑，充分溶解、攪勻后得培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入沼澤紅假單胞菌種液并攪拌均勻；把已接種好的沼澤紅假單胞菌分裝至發(fā)酵容器中，留氣室、置于室外有光照處，每日攪拌十次以上，15-40°C條件下培養(yǎng)2-5天至生物量達18時采收；
[0008](2)離心濃縮:將采收的沼澤紅假單胞菌菌液用碟式離心機以1000L/h的速率連續(xù)離心使離心率達95%以上，得到濃縮菌泥；
[0009](3)破壁處理:將濃縮菌泥放入細(xì)胞破碎機進行破壁處理，控溫10°C以下，壓力1000psi，反復(fù)兩次，使菌體破壁率達90%以上，以得到破壁菌體；
[0010](4)皂化處理:向每150kg的破壁菌體中加入焦性沒食子酸700g，氫氧化鉀5kg，甲醇35kg和純凈水50L，混合均勻后放入反應(yīng)釜中回流30min，然后迅速冷卻至室溫；
[0011](5)萃取回收:向反應(yīng)釜中加入石油醚萃取2次，每次加入的石油醚的體積數(shù)與步驟(4)中破壁菌體的質(zhì)量數(shù)的比值為1:1，然后快速攪拌5分鐘，在溫度為20°C條件下靜置Ih后分離萃取液即石油醚層，將兩次萃取液合并回收；將反應(yīng)釜升溫至65°C，經(jīng)揮發(fā)回收殘留石油醚，反應(yīng)釜中所剩物即為輔酶Qltl粗制品；
[0012](6)純化處理:具體步驟包括:
[0013]1.將輔酶Qltl粗制品用無水乙醇溶解后制成體積百分比濃度為20%的輔酶Qltl乙醇溶液；
[0014]I1.將輔酶Qltl乙醇溶液加入反應(yīng)釜中，每100L輔酶Qltl乙醇溶液中加入HZ816樹脂30kg，持續(xù)攪拌30min，使輔酶Qltl充分被HZ816樹脂吸附，然后分離取出HZ816樹脂；
[0015]II1.將吸附有輔酶Qltl的HZ816樹脂用丙酮解析洗脫2次。
[0016]IV.將兩次丙酮洗脫液進行合并，減壓到常壓101325Pa，回收丙酮后得到輔酶Qiq濃縮液；
[0017]V.將濃縮液在O°C條件靜置過夜24小時有結(jié)晶體析出，回收結(jié)晶體經(jīng)干燥后得純品，純度達93.4%。
[0018]本發(fā)明中所述步驟(I)中培養(yǎng)用水為河水、池水、井水或自來水；消毒劑為重量比是漂粉精:硫酸鋁鉀:碳酸鈉=2:5:0.5配制而成；細(xì)菌培養(yǎng)劑為重量比是醋酸鈉:硫代硫酸鈉:碳酸氫鈉:磷酸二氫鉀:氯化鈣:硫酸鎂=7:3:1.3:0.1: (0.04-0.05):(0.01-0.02)配制而成；培養(yǎng)液與球形紅假單胞菌種液的重量比為3:0.9—1.1 ;步驟(I)中還可選用球形紅假單胞菌、脫氫假單胞菌、脫氮付球菌或莢膜紅細(xì)菌替代沼澤紅假單胞菌。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用常見光合細(xì)菌為原料，在自然生態(tài)條件下發(fā)酵后，經(jīng)過離心濃縮和破壁處理后，加入焦性沒食子酸、氫氧化鉀、甲醇和純凈水進行皂化處理，然后用石油醚進行萃取，最后經(jīng)純化處理制得高純度的輔酶91(|;該方法步驟簡單，操作簡便，原理可靠，設(shè)計科學(xué)，成本低廉，溶劑平均回收率高，條件可控，提取效率高，產(chǎn)品純度好。
【附圖說明】
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[0020]圖1為本發(fā)明中提取制備方法的工藝流程示意圖。
[0021]圖2為本發(fā)明涉及的純化處理步驟的流程示意圖。
【具體實施方式】
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[0022]下面結(jié)合附圖并通過實施例對本發(fā)明作出進一步詳細(xì)說明。
[0023]實施例1: