專利名稱：生產(chǎn)輔酶q－10的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過微生物對輔酶Q-10進(jìn)行生產(chǎn)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物和轉(zhuǎn)化子(transformant)本身增加輔酶Q-10產(chǎn)量的方法。轉(zhuǎn)化子是Rhodobacter屬的微生物，優(yōu)選地，是已經(jīng)過來自不同微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子轉(zhuǎn)化過的R.sphaeroides，所述不同微生物優(yōu)選是Paracoccus屬的，更優(yōu)選是P.zeaxanthinifaciens種的。
輔酶Q-10(2，3-二甲氧基-二甲基-6-十異戊二烯基-1，4-苯醌)，也被稱為泛醌-10，是脂溶性苯醌，具有類異戊二烯側(cè)鏈，所述側(cè)鏈包括十個C-5類異戊二烯單元。輔酶Q-10(下文中縮寫為CoQ10)被發(fā)現(xiàn)于微生物和植物以及動物中。它是人類和大多數(shù)哺乳動物中泛醌最普遍的存在形式。已有人提出，并有越來越多的證據(jù)表明，CoQ10對人類健康狀況以及對疾病抵抗來說是重要因素。CoQ10的醫(yī)藥和健康方面的有益效果已被認(rèn)為與其兩種主要的生理功能相關(guān)，即作為線粒體電子傳遞鏈的重要輔助因子的功能(與三磷酸腺苷的合成偶聯(lián))以及作為脂溶性抗氧化劑發(fā)揮作用的功能。
CoQ10的健康方面的好處使得該化合物的商業(yè)重要性增加?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成或通過用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)CoQ10。這些微生物可以是已通過遺傳工程對其CoQ10生產(chǎn)進(jìn)行過改進(jìn)的天然的CoQ10生產(chǎn)者，或者它們可以不是天然生產(chǎn)CoQ10的，但是通過遺傳功能改造而能對CoQ10進(jìn)行合成了。
在細(xì)菌中，泛醌的醌環(huán)獲得自分支酸(Chorismate)，其是芳香族化合物生物合成中的核心中間產(chǎn)物，而泛醌的類異戊二烯尾巴獲得自C-5化合物異戊烯焦磷酸酯(IPP)。加到醌環(huán)上的類異戊二烯尾巴的長度取決于細(xì)菌中存在的特定異戊二烯轉(zhuǎn)移酶。例如，在Escherichia coli中，八異戊二烯焦磷酸酯合酶催化從法尼基焦磷酸酯(FPP，C-15)和五個IPP單位來合成八異戊二烯焦磷酸酯(C-40)的過程。將該分子加入到醌環(huán)中導(dǎo)致了泛醌-8的形成。在Paracoccus和Rhodobacter的種中，十異戊二烯焦磷酸酯(DPP)合酶催化用FPP(C-15)和七個IPP單位來形成DPP(C-50)的過程。將DPP加入到醌環(huán)中然后會導(dǎo)致泛醌-10(CoQ10)的形成。
自然界中，已知有兩種不同的對IPP進(jìn)行生物合成的途徑(

圖1)。甲羥戊酸鹽/酯途徑，如其名稱所暗示的，其利用甲羥戊酸鹽/酯作為核心中間產(chǎn)物，該途徑已被很好地研究于真核生物中。多年以來甲羥戊酸鹽/酯途徑都被認(rèn)為是自然界中IPP合成的普遍途徑。但是，近十年來，還發(fā)現(xiàn)了第二條IPP生物合成途徑，其被稱為非甲羥戊酸鹽/酯途徑或MEP途徑(因?yàn)槠溆?C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸酯作為中間產(chǎn)物)。目前已發(fā)現(xiàn)，該MEP途徑存在于多種真細(xì)菌以及高等植物的質(zhì)體區(qū)室中。
US 4070244公開了一種通過培養(yǎng)Sporidiobolus和Oosporidium屬的某些微生物來生產(chǎn)CoQ10的方法，所述方法在含有可被吸收的碳源和可被消化的氮源的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
Zhu，X.et al.(J.Fermentation & Bioengin.，79，493-5，1995)最先描述了對含有泛醌生物合成所涉及的基因的質(zhì)粒的構(gòu)建，以及將這些基因在E.coli中過量表達(dá)，以生產(chǎn)泛醌。
EP 1070759 A1中公開了一種生產(chǎn)CoQ10的方法，其通過對宿主微生物轉(zhuǎn)化并對轉(zhuǎn)化子生物進(jìn)行培養(yǎng)來進(jìn)行，所述宿主微生物尤其是E.coli，用來自Agrobacterium屬的、編碼具有十異戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白質(zhì)的DNA對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
EP 1072683 A1中公開了一種通過經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物來生產(chǎn)(尤其是泛醌)類異戊二烯化合物的方法。在列出的70來種宿主物種中，特別提到了Rhodobacter capsulatus和R.sphaeroides。然而，其實(shí)施例僅描述了在E.coli的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)行的對CoQ8的生產(chǎn)。
EP 1123979 A1公開了通過對E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化使得對CoQ10的生產(chǎn)效率提高的方法，其中，用包含來自Saitoella屬的真菌菌株的、編碼十異戊二烯二磷酸酯合酶的DNA的表達(dá)載體對E.coli進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
WO 02/099095 A2最后公開了一種對細(xì)菌進(jìn)行改造的方法，尤其是對Paracoccus屬的細(xì)菌進(jìn)行的，以通過過量表達(dá)甲羥戊酸鹽/酯途徑的基因來生產(chǎn)類異戊二烯化合物，特別是玉米黃質(zhì)。
革蘭氏陰性細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides是天然的CoQ10生產(chǎn)者，并且，人們已企圖用其來發(fā)展對CoQ10進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的方法。Yoshida et al.(J.Gen.Appl.Microbiol.44，19-26，1998)描述了通氣情況對于CoQ10生產(chǎn)的影響，還描述了對具有提高的CoQ10含量的R.sphaeroides非重組突變體的分離，此外，Sakato et al.(Biotechnol.Appl.Biochem.16，19-28，1992)也描述了通過優(yōu)化培養(yǎng)(發(fā)酵)條件，在R.sphaeroides的非重組突變體中提高CoQ10產(chǎn)量的方法。最近，人們已在用分子遺傳技術(shù)來增加R.sphaeroides對CoQ10的生產(chǎn)。
EP 1227155 A1公開了通過能生產(chǎn)CoQ10的微生物(尤其是Rhodobacter屬的)來提高CoQ10產(chǎn)量的方法。CoQ10產(chǎn)量的增加是通過向微生物中引入一種或多種屬性來獲得的，所述屬性選自由如下屬性所構(gòu)成的組降低的或有缺陷的牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶活性，增強(qiáng)的十異戊二烯二磷酸酯合酶活性及增強(qiáng)的對-羥基安息香酸十異戊二烯轉(zhuǎn)移酶活性。
基于R.sphaeroides中yaeM基因(現(xiàn)在被稱為ispC，其編碼1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸酯還原異構(gòu)酶)的存在，以及基于近來完成的對R.sphaeroides基因組序列的研究，看上去該細(xì)菌排他性地使用MEP途徑用于對IPP進(jìn)行生物合成。支持R.sphaeroides中排他性使用MEP途徑的其它證據(jù)是以下發(fā)現(xiàn)與其緊密相關(guān)的種，Rhodobacter capsulatus，僅用MEP途徑進(jìn)行類異戊二烯生物合成。
WO 02/26933公開了在Rhodobacter sphaeroides中提高CoQ10產(chǎn)量的方法，其通過過量表達(dá)編碼MEP途徑中某些酶的一些天然和/或異源基因來實(shí)現(xiàn)。但是，這些酶的過量表達(dá)僅使CoQ10的產(chǎn)量獲得非常有限的提高。這可能是由于如下事實(shí)MEP途徑中僅有少量酶的活性被提高，而在R.sphaeroides中顯著提高IPP生物合成還需要其它基因的過量表達(dá)。
如上所述，一些細(xì)菌僅用甲羥戊酸鹽/酯途徑來對IPP進(jìn)行生物合成。Paracoccus zeaxanthinifaciens是此類細(xì)菌的一個例子。在P.zeaxanthinifaciens中，編碼甲羥戊酸鹽/酯途徑的五個酶的基因加上編碼IPP異構(gòu)酶的基因(見圖1)，一起成簇于染色體的單個轉(zhuǎn)錄單元中，即下文中被稱為甲羥戊酸鹽/酯操縱子的操縱子(Hümbelin et al.，Gene 297，129-139，2002)。從乙酰乙酰CoA到IPP的轉(zhuǎn)化所需要的所有基因的單一簇可以提供有效的遺傳途徑通過將克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子插入到細(xì)胞中，以在任何細(xì)菌中增加IPP的產(chǎn)量。這不僅僅可在天然含有用于IPP生物合成的甲羥戊酸鹽/酯途徑的細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)，還可在僅利用MEP途徑的細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榧琢u戊酸鹽/酯途徑的前體，乙酰乙酰CoA是共同的代謝物。乙酰乙酰CoA是通過被稱為β-酮硫解酶的一大家族酶的作用，從兩個乙酰CoA分子制得的。因此，甚至在不用甲羥戊酸鹽/酯途徑進(jìn)行IPP生物合成的細(xì)菌中，也有乙酰乙酰CoA的供應(yīng)。
在通過對天然CoQ10生產(chǎn)者進(jìn)行遺傳改造，在微生物中進(jìn)一步提高CoQ10產(chǎn)量的一種嘗試中，已發(fā)現(xiàn)，這可通過將來自Paracoccus屬微生物的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter屬的微生物中來實(shí)現(xiàn)。雖然通過引入來自Paracoccus的甲羥戊酸鹽/酯操縱子以在Rhodobacter中增加IPP供應(yīng)并提高CoQ10產(chǎn)量的概念在推理上看似簡單，但之前并無證據(jù)表明，這些來自Paracoccus的基因可在Rhodobacter中進(jìn)行功能性表達(dá)，也沒有證據(jù)表明，IPP生物合成中涉及的Paracoccus的酶可在Rhodobacter中正常地發(fā)揮作用。此外，鑒于所有可獲得的證據(jù)都表明，Rhodobacter原本不含甲羥戊酸鹽/酯途徑的中間產(chǎn)物，因此明顯存在下述可能這些非天然的化合物將被降解，或者，會使異源表達(dá)的Paracoccus酶不可用。
本發(fā)明涉及在Rhodobacter屬的微生物中，尤其是在Rhodobactersphaeroides中，增加CoQ10產(chǎn)量的方法，這是通過向Rhodobacter菌株中引入來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)CoQ10的方法，其中包括將屬于Paracoccus屬的微生物中的(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens中的)甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到屬于Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobacter sphaeroides中，并對經(jīng)過修飾的Rhodobacter菌株進(jìn)行培養(yǎng)，由此所述方法導(dǎo)致CoQ10產(chǎn)量提高。
換句話說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)CoQ10的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhodobacter屬的微生物，所述微生物中已經(jīng)引入了來自Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，使得CoQ10形成并積累于培養(yǎng)物中；以及從其中回收CoQ10。
本發(fā)明還涉及Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobactersphaeroides，所述微生物中含有來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
本發(fā)明還涉及來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccuszeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的用途，用于在Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobacter sphaeroides中增加CoQ10產(chǎn)量的方法或過程。
本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)通過將來自Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter屬的宿主生物中，并對經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行培養(yǎng)，后者能以較高產(chǎn)量表達(dá)CoQ10。
實(shí)際操作中，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明需要進(jìn)行的所有步驟都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的傳統(tǒng)步驟，無須對其進(jìn)行特別的解釋。
用于本發(fā)明的甲羥戊酸鹽/酯操縱子由9066個核苷酸的DNA序列構(gòu)成，除調(diào)控序列(操縱序列)之外，其含有編碼下述酶的結(jié)構(gòu)基因，所述的酶是將乙酰乙酰CoA轉(zhuǎn)化為DMAPP所必需的，它們按照如下順序MvaA(羥甲基戊二酸單酰-CoA還原酶)、Idi(異戊烯二磷酸異構(gòu)酶)、Hcs(羥甲基戊二酸單酰-CoA合酶)、Mvk(甲羥戊酸鹽/酯激酶)、Pmk(磷酸甲羥戊酸鹽/酯激酶)和Mvd(二磷酸甲羥戊酸鹽/酯脫羧酶)。該操縱子的DNA序列被公開于WO 02/099095(見，例如SEQ ID NO42)中。該序列獲得自Paracoccus sp.R114，其是生產(chǎn)玉米黃質(zhì)的菌株(P.zeaxanthinifaciens)，根據(jù)《布達(dá)佩斯條約》，已于2001年4月24日將其保藏至ATCC，專利保藏號為PTA-3335。必須注意，操縱子中結(jié)構(gòu)基因的順序不同于它們編碼的酶催化連續(xù)代謝途徑反應(yīng)的順序。
術(shù)語“Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子”或“Paracoccus屬甲羥戊酸鹽/酯操縱子”并不意味著用于本發(fā)明的該操縱子實(shí)際上就分離或獲得自一種Paracoccus生物，而僅表示其與存在于Paracoccus生物中的甲羥戊酸鹽/酯操縱子相同。因此，其可能是完全分離自Paracoccus的、完全合成的或部分分離部分合成的。該操縱子DNA序列的具有完全功能的等位變異體或突變體也被包括于上述術(shù)語中。
WO 02/099095的47ff頁中描述了其它的Paracoccus菌種和菌株，以及將Flavobacterium sp.重新作為Paracoccus分類的參考。應(yīng)當(dāng)理解，微生物“Paracoccus zeaxanthinifaciens”和“Rhodobacter sphaeroides”還包括具有同樣的物理化學(xué)屬性的、此類物種的異名和有效名，如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義的。
術(shù)語“引入”被用于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中關(guān)于對Rhodobacter屬的宿主生物或微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的部分，其包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的、任何可用于將遺傳物質(zhì)(特別是甲羥戊酸鹽/酯操縱子)有效帶入到宿主生物中的方法，即以能使微生物對其進(jìn)行表達(dá)的方式進(jìn)行的。引入(例如)可通過載體(優(yōu)選地，表達(dá)質(zhì)粒)來進(jìn)行，或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過整合到宿主基因組中來進(jìn)行。
雖然根據(jù)本發(fā)明用于改進(jìn)CoQ10生產(chǎn)的優(yōu)選宿主生物是Rhodobactersphaeroides，但是Rhodobacter屬的能生產(chǎn)CoQ10的其它菌種也可以作為宿主使用，例如R.adriaticus、R.capsulatus、R.sulfidophilus和R.veldkampii。所有宿主細(xì)胞可代表野生型菌株的突變體，或者代表經(jīng)過遺傳操作的菌株，所述菌株的特征在于，較之野生型菌株的CoQ10產(chǎn)量，其具有被提高的CoQ10產(chǎn)量。
將甲羥戊酸鹽/酯操縱子成功引入到宿主微生物之后，根據(jù)已知的方法對經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行培養(yǎng)，即在含有可被宿主吸收的碳源和氮源、無機(jī)鹽等的培養(yǎng)基中，在適于有效生長以及適于目標(biāo)產(chǎn)物CoQ10表達(dá)的溫度、pH和通風(fēng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
從發(fā)酵培養(yǎng)物和/或轉(zhuǎn)化子(即，其中已被引入了屬于Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的微生物)進(jìn)行分離，以及，如果需要的話，對獲得的CoQ10進(jìn)行純化(包括針對人類和動物的使用對其進(jìn)行配方)，都可按照本領(lǐng)域公知的方法來進(jìn)行。但是，為用于動物健康和營養(yǎng)用途，可以不需要進(jìn)行特定的純化。在這種情況下，可對CoQ10和生物物質(zhì)和/或發(fā)酵培養(yǎng)物的其它組分一同進(jìn)行進(jìn)一步加工，以得到具有商業(yè)吸引力的產(chǎn)品。
圖1示出了在R.sphaeroides中對CoQ10進(jìn)行生物合成的途徑，其用MEP途徑來形成IPP?？虺龅膮^(qū)域表示包含甲羥戊酸鹽/酯途徑(導(dǎo)致IPP形成)加上IPP異構(gòu)酶步驟的反應(yīng)序列。甲羥戊酸鹽/酯途徑在R.sphaeroides中天然并不存在。在P.zeaxanthinifaciens中，編碼甲羥戊酸鹽/酯途徑的五個酶加上IPP異構(gòu)酶的基因組成一個操縱子，其在下文中被稱為甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
下述實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，而非以任何方式對其進(jìn)行限制。
實(shí)施例該實(shí)施例顯示了將來自Paracoccus zeaxanthinifaciens的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入之后，R.sphaeroides DSM 158中CoQ10產(chǎn)量的提高。
細(xì)菌和培養(yǎng)條件Rhodobacter sphaeroides菌株DSM 158(從the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH獲得)被用作為基礎(chǔ)菌株，以構(gòu)建具有提高的CoQ10產(chǎn)量的重組菌株。在培養(yǎng)基RS100中，于28℃下對所有的R.sphaeroides菌株進(jìn)行培養(yǎng)。表1中概括了培養(yǎng)基RS100的組成和制備方法。將50mg/l的卡納霉素加入到培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)重組菌株。在LB培養(yǎng)基(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)中，于37℃對E.coli菌株進(jìn)行培養(yǎng)。為保持重組E.coli菌株中的質(zhì)粒，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(ampicillin，100mg/l)和/或卡納霉素(25-50mg/l，取決于質(zhì)粒)。在旋轉(zhuǎn)式搖床中，于200rpm，需氧條件下，對E.coli和R.sphaeroides的液體培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時，加入瓊脂(1.5％的終濃度)。
表1培養(yǎng)基RS100的組成和制備方法
構(gòu)建質(zhì)粒pBBR-K-Nde和pBBR-K-mev-opR114在WO 02/099095中的實(shí)施例6(第91頁，12-17行)和實(shí)施例13(第105頁，第10行至第106頁第8行)，對質(zhì)粒pBBR-K-Nde(空質(zhì)粒)和pBBR-K-mev-op-up-4(含有甲羥戊酸鹽/酯操縱子前4個基因的質(zhì)粒)的構(gòu)造分別進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
PCR引物hcs-5326(SEQ ID NO1)對應(yīng)P.zeaxanthinifaciens hcs基因(起始于密碼子214，結(jié)束于密碼子220的第二個核苷酸)，而PCR引物mvd-9000(SEQ ID NO2)對應(yīng)于P.zeaxanthinifaciens mvd基因終止子后104至123位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列(WO 02/099095，分別見SEQ ID Nos46和52)。通過克隆用引物hcs-5326和mvd-9000(用P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588基因組DNA作為模板)在pCR2.1-TOPO中獲得的PCR片段，來構(gòu)建質(zhì)粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt。因此該質(zhì)粒含有甲羥戊酸鹽/酯操縱子的下游一半，其中包括hcs的3’末端和最后三個基因，mvk、pmk和mvd。用限制性內(nèi)切酶SacI和NdeI來消化質(zhì)粒pBBR-K-mev-op-up-4和TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt，將后一消化得到的較短片段與來自pBBR-K-mev-op-up-4的較大片段連接。得到的質(zhì)粒，pBBR-K-mev-op-wt，含有來自P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的完整的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，其中包括其(可能的)啟動子。P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588(野生型)和R114的甲羥戊酸鹽/酯操縱子序列之間僅有的區(qū)別在于mvk中的突變，導(dǎo)致殘基265從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸(A265V)。因?yàn)镻.zeaxanthinfaciens ATCC 21588的基因組DNA被用作為PCR模板，以構(gòu)建質(zhì)粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt，因此其中含有野生型mvk基因。通過定點(diǎn)誘變向mvk中引入突變(密碼子265從GCC變?yōu)镚TC)，產(chǎn)生了質(zhì)粒pBBR-K-mev-op-R114。
用于R.sphaeroides的轉(zhuǎn)化方法使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過接合，用質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化E.coli S17-1，用于克隆和隨后將質(zhì)粒從S117-1轉(zhuǎn)運(yùn)到R.sphaeroides DSM 158中(Nishimura et a1.，Nucl.Acids Res.18，6169，1990；Simon et al.，Bio/Technology 1983，784-91)。首先分離出R.sphaeroides DSM 158的、具有自發(fā)的利福平抗性的突變體，這是通過如下步驟來進(jìn)行的在補(bǔ)充有100mg/l利福平(rifampicin)的RS100液體培養(yǎng)基上對DSM 158進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞涂布于含有100mg/1利福平的RS100平板上，分離單個菌落。為達(dá)到接合的目的，從受體細(xì)胞(具有利福平抗性的R.sphaeroides DSM 158)培養(yǎng)物(生長于含有100mg/l利福平的RS100培養(yǎng)基中)和供體細(xì)胞(攜帶有將被轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的E.coli S17-1，被培養(yǎng)于含有50mg/l卡納霉素的LB培養(yǎng)基中)中各取1ml，通過離心獲得沉淀。棄去上清液，用新鮮的RS100培養(yǎng)基洗兩次細(xì)胞，以去除抗生素。然后將每份沉淀重新懸浮于1ml新鮮的RS100培養(yǎng)基中。混合50微升的供體細(xì)胞和0.45ml的受體細(xì)胞，通過離心獲得沉淀，重新懸浮于0.03ml的RS100培養(yǎng)基中，點(diǎn)到RS100平板上。在28℃進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，用接種環(huán)收獲細(xì)胞，將其重新懸浮于0.3ml的RS100培養(yǎng)基中。將該懸浮液的稀釋液涂布到含有100mg/l利福平和50mg/l卡納霉素的RS100平板上，在28℃進(jìn)行培養(yǎng)。從平板上挑出菌落(可能經(jīng)過轉(zhuǎn)化的R.sphaeroides DSM 158細(xì)胞)，培養(yǎng)于含有50mg/l卡納霉素的液體RS100培養(yǎng)基中，用合適的引物通過PCR來檢測是否存在質(zhì)粒。將陽性克隆劃線到含有50mg/l卡納霉素的RS100平板上，獲得單個菌落。然后在含有50mg/l的液體RS100培養(yǎng)基上，再次對來自每個克隆的單個菌落進(jìn)行培養(yǎng)，通過PCR證實(shí)了目標(biāo)質(zhì)粒的存在。通過向培養(yǎng)物中加入甘油(15％v/v)并冷凍于-80℃，來保存最終經(jīng)過轉(zhuǎn)化的R.sphaeroides DSM 158菌株。
用于評價R.sphaeroides中CoQ10生產(chǎn)情況的培養(yǎng)條件將培養(yǎng)基RS100用于用R.sphaeroides進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)重組的R.sphaeroides菌株時，加入50mg/l的卡納霉素)。在200rpm振蕩下，于28℃，在250ml帶蓋Erlenmeyer瓶中，對25毫升培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。為檢驗(yàn)CoQ10的生產(chǎn)情況，用R.sphaeroides菌株的經(jīng)冷凍和加入甘油的貯藏培養(yǎng)物去接種25ml的種子培養(yǎng)物。對種子培養(yǎng)物進(jìn)行24-28小時的培養(yǎng)之后，取合適體積的培養(yǎng)物，用于接種實(shí)驗(yàn)用瓶，使得660納米處最初的光密度(OD660)為0.16。以24小時為間隔，分別于無菌條件下取2毫升樣品。分析項目包括生長情況(以O(shè)D660來測)、pH、培養(yǎng)物上清液中的葡萄糖、以及CoQ10和類胡蘿卜素(通過高效液相色譜[HPLC]來測定-見下文中“分析方法”一節(jié))。
分析方法試劑乙腈、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)、叔丁基甲醚(TBME)和丁基化羥基甲苯(BHT)是分析純或HPLC級的，其都獲得自Fluka(瑞士)。CoQ10也購自Fluka。甲醇(Lichrosolv)購自Merck，Darmstadt。類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品從Chemistry Research Department，RocheVitamins Ltd.，Switzerland獲得。
樣品制備和抽提將全培養(yǎng)液中的400微升轉(zhuǎn)移到一次性的15ml聚丙烯離心管中。加入4毫升經(jīng)穩(wěn)定的抽提溶液(0.5g/l BHT，處于1∶1(v/v)DMSO/THF中)，在實(shí)驗(yàn)室搖床(IKA，德國)中，對樣品進(jìn)行20分鐘的混合，以促進(jìn)抽提。最后，對樣品進(jìn)行離心，將上清液轉(zhuǎn)移到琥珀色玻璃管中，以通過HPLC進(jìn)行分析。
HPLC開發(fā)了反向HPLC方法，用于對泛醌及其相應(yīng)氫醌進(jìn)行同時測定。該方法能將類胡蘿卜素(八氫番茄紅素、球形酮(spheroidenone)、spheroidene和鏈孢紅素(neurosporene))與CoQ10清楚地分開。用裝備有溫控自動上樣儀和二極管陣列檢測器的Agilent1100HPLC系統(tǒng)來進(jìn)行色譜分析。該方法的參數(shù)如下所示柱 YMC Carotenoid C30柱3微米，鋼質(zhì)，150mm長×3.0mm I.D.
(YMC，Part No.CT99S031503QT)保護(hù)柱 Security Guard C18(ODS，十八烷)4mm長×3.0mm I.D.
(Phenomenex，Part No.AJO-4287)典型柱壓開始時60bar流速0.5ml/min移動相 乙腈(A)∶甲醇(B)∶TBME(C)的混合物
后時間(post time) 4分鐘注射體積 10μl柱溫 15℃檢測 按照表2，用三種波長來對特定化合物進(jìn)行檢測表2.HPLC保留時間和所用的波長
計算計算基于峰的面積來進(jìn)行。
靈敏度通過向其中注射相關(guān)參照化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液來驗(yàn)證該方法的靈敏度。目標(biāo)化合物(輔酶Q10和ubiquinol-10)完全分開，沒有顯示任何的干擾。
線性范圍和檢測極限對輔酶Q10在穩(wěn)定抽提溶液中的一系列稀釋物(見上文)進(jìn)行制備和分析。線性范圍被發(fā)現(xiàn)為5mg/l至50mg/l。相關(guān)系數(shù)為0.9999。用該HPLC方法檢測輔酶Q10的極限被確定為4mg/l。
可重現(xiàn)性對該方法(包括抽提步驟)的可重現(xiàn)性進(jìn)行了驗(yàn)證。對十份單獨(dú)的樣品制劑進(jìn)行比較。相對標(biāo)準(zhǔn)差被確定為4％。
測定R.sphaeroides菌株對CoQ10的生產(chǎn)情況在上文指出的條件下，對R.sphaeroides菌株DSM 158、DSM158/pBBR-K-Nde(空載體對照)和DSM 158/pBBR-K-mev-opR114于搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，對CoQ10的生產(chǎn)情況進(jìn)行測定。結(jié)果被概括于表3中。其中展示的值是兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，在每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，對每種菌株進(jìn)行兩次檢測。這些結(jié)果清楚地表明，來自P.zeaxanthinifaciens的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的表達(dá)顯著地提高了R.sphaeroides中的CoQ10產(chǎn)量。
表3
1比形成率被表示為每mg細(xì)胞干物質(zhì)生產(chǎn)出的CoQ10的mg數(shù)/。SD＝標(biāo)準(zhǔn)差。
序列表<110>帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>生產(chǎn)輔酶Q-10的改進(jìn)方法<130>Case 21841<150>EP 03015367.0<151>2003-07-08<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物hcs-5336<400>1gcgc tggtcg aggcgtggaa 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物mvd-9000<400>2cgtcagcgtg gcgggcaagt20
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)CoQ10的方法，其中包括將屬于Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到屬于Rhodobacter屬的微生物中，并對經(jīng)過修飾的Rhodobacter菌株進(jìn)行培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中R.sphaeroides被用作為生產(chǎn)CoQ10的微生物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，將Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter菌株中。
4.一種生產(chǎn)CoQ10的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhodobacter屬的微生物，所述微生物中已經(jīng)引入了Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子；使得CoQ10形成并積累于培養(yǎng)物中；以及從其中回收CoQ10。
5.Rhodobacter屬的微生物，其中含有Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物，它是Rhodobacter sphaeroides。
7.如權(quán)利要求5或6所述的微生物，其中含有Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
8.Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子在如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的方法中的用途。
9.一種用于在Rhodobacter屬的微生物中增加CoQ10產(chǎn)量的方法，所述方法通過下述步驟來實(shí)現(xiàn)將Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter菌株中，并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)CoQ10的改進(jìn)方法，所述方法通過對Rhodobacter屬的微生物進(jìn)行發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)，所述微生物已經(jīng)被Paracoccus zeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子所轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12R1/01GK1820077SQ200480019505
公開日2006年8月16日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者阿蘭·貝利, 瑪庫斯·胡姆貝利恩, 如爾·羅帕斯-烏里巴瑞 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司