專利名稱:用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獸醫(yī)學(xué)的檢測(cè)試劑盒，確切講是一種用于用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發(fā)生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現(xiàn)丘疹或結(jié)節(jié)、水皰、內(nèi)臟病變甚至死亡，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其規(guī)定為法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點(diǎn)。
綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，SPPV和GTPV基因序列同源性達(dá)到96%-97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異，見(jiàn):Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H.,Sandybaevj N.T.，Kerembekovaj U.Z.，Zaitsev, V.L，Kutishj G.F.，Rock, D.L，2002.The genomes of sheeppox and goatpox viruses.J Virol.76， 6054-6061.。一般來(lái)說(shuō)，SPPV、GTPV具有較嚴(yán)格的宿主嗜性，但有一些研究表明試這兩種病毒也可發(fā)生宿主嗜性改變，引起交叉感染，見(jiàn):M.G.Garner, S.D.Sawarkar, E.K.Brett, J.R.Edwards, V.B.Kulkarni, D.B.Boyle;S.N.th e Extent and Impact of Sheep Poxand Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health andProduction.2000，32(4):205-223.，繼而可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的臨床診斷和獲得不準(zhǔn)確的流行病學(xué)信息，不利于對(duì)該病的有效防控。對(duì)羊痘病毒分離株進(jìn)行準(zhǔn)確的種屬鑒別有助于解決生產(chǎn)中遇到的這個(gè)問(wèn)題，但SPPV和GTPV之間抗原性具有明顯交叉，用血清學(xué)方法很難區(qū)別開(kāi)來(lái)，需通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒別，見(jiàn):Sheeppox and goatpox virus.World Organisation for Animal Health (2009).- Terrestrial Animal Health Code.0ΙΕ, Paris.。準(zhǔn)確鑒定分離株種屬和弄清其來(lái)源將有助于羊痘的流行病學(xué)分析，具有重要意義。
目前為止，基于基因序列分析的分子生物學(xué)鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)克隆結(jié)合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了 PCR-RFLP方法，見(jiàn):顏新敏，吳國(guó)華，李健等.山羊痘病毒感染綿羊的診斷及其基因的分子分析.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41 (01): 14.，但是該方法需要專用的PCR儀器和酶切操作，相對(duì)來(lái)說(shuō)比較繁瑣且費(fèi)用較多，不利于生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)肖雯等建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR方法擴(kuò)增靈敏度僅為1.71X106 copies/μ L的GTPV基因組模板，且同樣需要專門的PCR儀器，因此該方法在生產(chǎn)實(shí)踐中也存在這局限性，見(jiàn):肖雯，聶福平，王昱等.綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2012，7(7):551-554.。康文玉等建立了可檢測(cè)羊痘病毒屬的實(shí)時(shí)定量PCR方法，該方法以PCR為靶基因設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行綿羊痘病毒和山羊痘病毒的檢測(cè)，見(jiàn)康文玉，徐自忠，花群義等.羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan PCR檢測(cè)方法的建立.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006.36(07):529-533.。程振濤、姚俊等也分別基于山羊痘病毒基因組不同的基因片段建立了檢測(cè)山羊痘病毒的實(shí)時(shí)定量PCR，見(jiàn):程振濤，岳筠，李永明等.山羊痘病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25; 25 (3):464-47.姚俊，永軍，彭海生等.山羊痘病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(7):32-39.。但是以上方法均需要專用的價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀，而且對(duì)操作者要求相對(duì)較高，因此在實(shí)際生產(chǎn)中還是有一定的局限。
環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于各種疾病病原的檢測(cè)中。盡管國(guó)內(nèi)外均已有人針對(duì)羊痘病毒屬基因設(shè)計(jì)并建立了能夠檢測(cè)羊痘病毒屬的Lamp方法，如美國(guó)科學(xué)家Amaresh Das等人建立了靈敏度比較高的Lamp方法，見(jiàn):Amaresh Das,Shawn Babiuk, and Michael T.McIntosh.Development of a Loop-Mediated IsothermalAmplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses.Journal of ClinicalMicrobiology.2012, 1613
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒。
本發(fā)明的用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQIDNa USEQ ID Na 2, SEQ ID Ns 3和SEQ ID Ns 4，所涉及的序列見(jiàn)序列表及后敘內(nèi)容。
為方便使用，在本發(fā)明的用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒內(nèi)還可放置有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4) 2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA。
本發(fā)明是一種用于檢測(cè)山羊痘病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，其相應(yīng)的檢測(cè)是應(yīng)用特定的引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，環(huán)等溫介導(dǎo)技術(shù)(loop mediated isothermal amplication,LAMP)具有快速、簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明試劑盒內(nèi)的引物可以特異性擴(kuò)增山羊痘病毒核酸，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可以對(duì)被檢樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸電泳檢測(cè)到是否有特異性條帶確定被檢樣品是否帶有山羊痘病毒。本發(fā)明的引物具有特異性，在同等條件下不能擴(kuò)增綿羊痘病毒的核酸，同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度較高，同時(shí)具有檢測(cè)操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，可在羊痘病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用及疾病的防控中應(yīng)用。
本發(fā)明中設(shè)計(jì)選取山羊痘病毒基因組的反向末端重復(fù)序列ITR區(qū)為靶基因，專門設(shè)計(jì)了只能匹配山羊痘病毒而不能匹配山綿羊痘病毒的特異性Lamp引物。本發(fā)明的試劑盒能夠檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒能夠快捷高效靈敏的檢測(cè)出山羊痘病毒，而不與同屬的綿羊痘病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明可快速特異性地從病料中或者培養(yǎng)的細(xì)胞毒中檢測(cè)出山羊痘病毒，從而判定是山羊痘病毒而不是綿羊痘病毒或別的病原體感染。而且本發(fā)明涉及的試劑盒最低可檢測(cè)出1.045X IO6個(gè)拷貝的模板，靈敏度高于同類能區(qū)分檢測(cè)出山羊痘病毒的分子生物學(xué)方法中的雙重PCR方法和PCR-RFLP方法，且不需要使用專門的PCR儀和DNA酶，因此在使用成本和時(shí)間上都占有一定的優(yōu)勢(shì)。


附圖1為山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增溫度梯度優(yōu)化，擴(kuò)增60min后核酸電泳檢測(cè)圖，其中60°C、62°C和64°C均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，66°C和對(duì)照組均無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個(gè)溫度。
附圖2為山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增在62°C下擴(kuò)增不同時(shí)間的后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中擴(kuò)增60min后均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，擴(kuò)增30min、45min、和對(duì)照組均無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴(kuò)增時(shí)間可在60min之后擴(kuò)增出特異性條帶。
圖3為以羊的不同病原體基因組為模板，以山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴(kuò)增60 min后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中M表不IOObp DNA Ladder marker ;1為山羊痘病毒擴(kuò)增產(chǎn)物；2為綿羊痘病毒擴(kuò)增產(chǎn)物；3為羊水泡病毒擴(kuò)增產(chǎn)物；4為支原體擴(kuò)增產(chǎn)物；5為衣原體擴(kuò)增產(chǎn)物；6為螺旋體擴(kuò)增產(chǎn)物；7為弓形蟲(chóng)擴(kuò)增產(chǎn)物；8為羊泰勒蟲(chóng)擴(kuò)增產(chǎn)物；9為羊巴貝斯蟲(chóng)擴(kuò)增產(chǎn)物；10為陰性對(duì)照。由圖可見(jiàn)，山羊痘病毒lamp引物特異性擴(kuò)增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無(wú)特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對(duì)照組無(wú)條帶產(chǎn)生，說(shuō)明山羊痘病毒lamp引物特異性很高。
圖4為山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增時(shí)間為60min。其中M代表IOObp DNA marker ；1為IO7個(gè)拷貝，2為IO6個(gè)拷貝；3為IO5個(gè)拷貝，4為IO4個(gè)拷貝；5為IO3個(gè)拷貝，6為IO2個(gè)拷貝，7為IO1個(gè)拷貝，8為10°個(gè)拷貝，9為KT1個(gè)拷貝，10為10_2個(gè)拷貝，11為陰性對(duì)照。由圖可見(jiàn)，IO7-1O4個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對(duì)照組無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的山羊痘病毒lamp引物在62°C下，擴(kuò)增60min之后最少可檢出IO4個(gè)拷貝的模板。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解說(shuō)。
1.序列的制備
本發(fā)明的擴(kuò)增引物應(yīng)用相關(guān)的引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)羊痘病毒基因組反向重復(fù)末端(l-2000bp內(nèi))設(shè)計(jì)，再?gòu)墨@得的數(shù)百對(duì)引物中選擇評(píng)分較高的引物，再將設(shè)計(jì)好的序列發(fā)送至南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行5’端修飾合成得到。最終確定的這些序列是:
SEQ Na 1:ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本發(fā)明中被命名為 GTPV F3 ；
SEQ Na 2:CCTAATCCATTTAAGACACTACG，在本發(fā)明中被命名為 GTPV B3 ；
SEQ Na 3:AAGATGTCTTCCGGTAACTATGTCT-GCGGTTGTGATATCGTCA,在本發(fā)明中被命名為GTPV FIP
SEQ Na 4: CCGAACTTGTTATTTCTTGTGCTT-CACAATAAGGAACCACCTAGA，在本發(fā)明中被命名為 GTPV BIP。
2.病毒基因組提取
將VeiO細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，單層細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上融合后，接種羊痘病毒病毒，370C孵育Ih后棄去毒液。加入細(xì)胞維持液含有1%胎牛血清DMEM，370C 5%C02培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變(CPE)Jt 90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收毒。將病毒反復(fù)凍融3次，置-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。使用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取細(xì)胞毒株中的DNA，獲得的病毒DNA即可用于檢測(cè)。
3.Lamp擴(kuò)增條件優(yōu)化
以上一步驟提取純化的病毒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)體系如下:
F30.2 μ M
Β30.2μΜ
FIP1.6μΜ
BIP1.6μΜ
dNTPL4mM (每種)
Tris-HCl20mM
KCl:1OmM
(NH4)2SO4IOmM
MgSO44mM
Tween 200.2%
Bst 酶8U
模板DNA2 μ L
3.1反應(yīng)溫度的優(yōu)化
在進(jìn)行l(wèi)amp引物的反應(yīng)溫度的確定時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。以山羊痘病毒基因組為模板，反應(yīng)溫度設(shè)為60°C、62°C、64°C的水浴鍋或PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為60 min,結(jié)束后80°C加熱2 min,各取2μ L Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍照。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.檢測(cè)結(jié)果顯示，山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增溫度梯度優(yōu)化，擴(kuò)增60min后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中60°C、62°C和64°C均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，66°C和對(duì)照組均無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個(gè)溫度。
3.2反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
在進(jìn)行l(wèi)amp引物的反應(yīng)時(shí)間的確定時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。以山羊痘病毒基因組為模板，反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進(jìn)行,反應(yīng)時(shí)間為3(T60 min,結(jié)束后80°C加熱2 min,各取2 μ L Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍照。其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。
檢測(cè)結(jié)果顯示，山羊痘病毒lamp引物擴(kuò)增在62°C下擴(kuò)增不同時(shí)間的后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中擴(kuò)增60min后均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生,擴(kuò)增30min、45min、和對(duì)照組均無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴(kuò)增時(shí)間可在60min之后擴(kuò)增出特異性條帶。
3.3 反應(yīng)特異性檢測(cè)
在進(jìn)行l(wèi)amp引物的反應(yīng)特異性的檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。模板分別為綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原體、為衣原體、螺旋體、弓形蟲(chóng)、羊泰勒蟲(chóng)、羊巴貝斯蟲(chóng)。反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間按優(yōu)化結(jié)果，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物設(shè)為45min、綿羊痘病毒lamp引物反應(yīng)60min、山羊痘病毒lamp引物為60 min。反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱2 min，之后取出反應(yīng)管，各取2 μ L Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍照。其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3.檢測(cè)結(jié)果顯示以羊的不同病原體基因組為模板，以羊的不同病原體基因組為模板，在62°C下擴(kuò)增60 min后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。山羊痘病毒lamp引物特異性擴(kuò)增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無(wú)特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，陰性對(duì)照組無(wú)條帶產(chǎn)生，說(shuō)明山羊痘病毒lamp引物非常特異。
3.4反應(yīng)靈敏度檢測(cè)
在進(jìn)行l(wèi)amp引物的反應(yīng)靈敏度檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。以山羊痘病毒基因組為模板，模板均通過(guò)核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度計(jì)算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為107 10_2個(gè)拷貝共計(jì)10個(gè)梯度作為模板。反應(yīng)溫度設(shè)為62°C的水浴鍋或PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為60 min。反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱2 min，之后取出反應(yīng)管，各取2 μ L Lamp產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍照。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。
結(jié)果顯示，山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增時(shí)間為60min。結(jié)果顯示，IO7-1O4個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。對(duì)照組無(wú)條帶產(chǎn)生，此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的山羊痘病毒lamp引物在62°C下,擴(kuò)增60min之后最少可檢出IO4個(gè)拷貝的模板。
綜上可見(jiàn)，這里設(shè)計(jì) 合成的4個(gè)基因序列以及其形成的LAMP方法可以單獨(dú)在使用快速檢測(cè)山羊痘病毒。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQ Na 1、SEQ Na 2、SEQ Na 3 和 SEQ Na 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)還有dNTP、Tris-HC 、KCl、(NH4) 2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于檢測(cè)山羊痘病毒的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒中至少包括有SEQ№1、SEQ№2、SEQ№3和SEQ№4四條引物，試劑盒內(nèi)還有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和Bst酶，以及模板DNA。本發(fā)明的引物具有特異性，在同等條件下不能擴(kuò)增綿羊痘病毒的核酸，同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度較高，同時(shí)具有檢測(cè)操作相對(duì)簡(jiǎn)單的、快速的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/93GKCN103215385SQ201310161817
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月4日
發(fā)明者張強(qiáng), 趙志荀, 范斌, 吳國(guó)華, 顏新敏, 李健, 朱海霞, 蘆曉立, 孫曉林, 劉發(fā)央 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan