本發(fā)明涉及生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物及利用其的1,4-丁二醇的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

1、1,4-丁二醇(1,4-butanediol)作為溶劑、聚合物中間體、精細(xì)化學(xué)中間物質(zhì)等用于整個化學(xué)產(chǎn)業(yè)。1,4-丁二醇主要通過使乙炔和甲醛反應(yīng)后加氫的工序來生產(chǎn)，除此以外，也可以由馬來酸酐、環(huán)氧丙烷生產(chǎn)，但由于隨著化石原料的使用而產(chǎn)生的溫室氣體和廢棄物，加之不穩(wěn)定的國際油價，具有原料供應(yīng)存在差池、生產(chǎn)費用增加等問題。

2、為了完善這樣的化學(xué)生產(chǎn)工序，近年來，開發(fā)了一種以生物質(zhì)為原料且用生物學(xué)方法生產(chǎn)1,4-丁二醇的低費用及環(huán)保的工序。通常情況下，在微生物的代謝過程中，通過α-酮戊二酸或琥珀酰-coa生產(chǎn)1,4-丁二醇。但是，在利用微生物的1,4-丁二醇的生產(chǎn)工序中，微生物的代謝過程中不僅產(chǎn)生1,4-丁二醇，還產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物，并且存在諸如表現(xiàn)出相對較低的生產(chǎn)收率等限制。因此，為了克服這樣的限制，不斷嘗試致力于開發(fā)利用基因工學(xué)技術(shù)而可以高收率生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物。

3、現(xiàn)有技術(shù)文獻

4、專利文獻

5、(專利文獻1)歐洲授權(quán)專利第3050970號

6、(專利文獻2)歐洲授權(quán)專利第2782893號

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物。

2、另外，本發(fā)明的目的在于提供利用上述微生物的1,4-丁二醇的生產(chǎn)方法。

3、現(xiàn)有已知的微生物中的1,4-丁二醇生產(chǎn)途徑是，在相應(yīng)過程中從葡萄糖(glucose)生產(chǎn)的丙酮酸(pyruvate)氧化為乙酰-coa(acetyl-coa)，在tca循環(huán)中合成為α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)和琥珀酰-coa(succinyl-coa)，在這里，經(jīng)過α-酮戊二酸的脫羧反應(yīng)或琥珀酰-coa的還原反應(yīng)制造4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)，由此最終生產(chǎn)1,4-丁二醇。

4、但是，本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了使用鳥氨酸(ornithine)代替α-酮戊二酸、琥珀酰-coa作為起始物質(zhì)的新的1,4-丁二醇生產(chǎn)途徑，通過確認(rèn)具有這樣的生產(chǎn)途徑的微生物可以通過高的酶活性有效地生產(chǎn)1,4-丁二醇，從而完成了本發(fā)明。

5、本發(fā)明的一個方式提供基于鳥氨酸生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物。

6、本發(fā)明中使用的“微生物”是指原核細(xì)胞或真核生物，包括細(xì)菌、酵母、真菌等。

7、本發(fā)明中使用的“生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物”是指參與1,4-丁二醇生產(chǎn)途徑的酶或包含編碼其的基因的微生物。本發(fā)明中的基于鳥氨酸生產(chǎn)1,4-丁二醇的途徑是從未在目前已知的微生物中確認(rèn)過的生產(chǎn)途徑，因此本發(fā)明中的生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物(以下稱為“1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物”)是指對編碼參與鳥氨酸-1,4-丁二醇生產(chǎn)途徑的酶的基因通過內(nèi)在基因序列的修飾(核酸缺失、添加、置換等)、外源基因的基因組內(nèi)插入和/或?qū)氚庠椿虻馁|(zhì)粒(載體)而修飾的微生物。在本發(fā)明中，“修飾的微生物”可與“變異微生物”、“變異菌株”、“重組微生物”、“重組菌株”、“遺傳性修飾的微生物”或“遺傳性修飾的菌株”同義混用。作為與之相反的概念，“修飾前的微生物”、“修飾前的菌株”、“非變異微生物”、“非變異菌株”或“親本菌株”是指由于自然或人為因素經(jīng)遺傳性變異轉(zhuǎn)化前的微生物，例如，是指沒有作用于鳥氨酸-1,4-丁二醇生產(chǎn)途徑的酶而不/無法生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物。

8、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，上述1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物可以具有：將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酰胺(4-butaneamide)的酶反應(yīng)、將4-氨基丁酰胺轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸(4-aminobutyric?acid)的酶反應(yīng)、將4-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛(succinatesemialdehyde)的酶反應(yīng)、將琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)的酶反應(yīng)、以及將4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為1,4-丁二醇(1,4-butanediol)的酶反應(yīng)。

9、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，對上述將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酰胺的酶反應(yīng)進行催化的酶可以為由davb基因編碼的賴氨酸2-單加氧酶(lysine2-monooxygenase)。

10、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，對上述將4-氨基丁酰胺轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸(4-aminobutyric?acid)的酶反應(yīng)進行催化的酶可以為由dava基因編碼的5-氨基戊酰胺酶(5-aminovaleramidase)。

11、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，對上述將4-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛(succinatesemialdehyde)的酶反應(yīng)進行催化的酶可以為由gabt基因編碼的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(gamma-aminobutyrate?aminotransferase)。

12、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，對上述將琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸(4-hydroxybutyric?acid)的酶反應(yīng)進行催化的酶可以為由yahk基因編碼的醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase)。

13、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，對上述將4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為1,4-丁二醇(1,4-butanediol)的酶反應(yīng)進行催化的酶可以為由yahk基因編碼的醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)或由car基因編碼的羧酸還原酶(carboxylic?acid?reductase)。

14、上述羧酸還原酶可以通過由sfp基因編碼的4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(4'-phosphopantetheinyl?transferase)激活。

15、這樣的1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物包含的賴氨酸2-單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、醇脫氫酶和羧酸還原酶是在修飾前的微生物中不存在的酶。此外，上述4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶可以存在或不存在于修飾前的微生物。

16、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，上述酶可以利用外源基因的導(dǎo)入。

17、更具體而言，上述酶通過將選自存在于通常的微生物中的davb、dava、gabt、yahk、car和sfp中的基因或與其具有實質(zhì)同一性的序列人為地導(dǎo)入1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物，從而可以催化用于由鳥氨酸生產(chǎn)1,4-丁二醇的酶的表達和酶反應(yīng)。

18、本發(fā)明中使用的“實質(zhì)同一性”是指在將各個基因序列，即堿基序列或核苷酸序列和任意的其它核苷酸序列以最大程度對應(yīng)的方式對齊而進行分析時，上述任意的其它核苷酸序列和各個核苷酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。

19、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，編碼上述酶的基因davb、dava、gabt、yahk、car和sfp可以來源于本技術(shù)領(lǐng)域中公知的微生物，微生物的種類沒有特別限定。

20、更具體而言，上述酶的基因可以來源于選自大腸桿菌(escherichia?coli)、惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)、膿腫分枝桿菌(mycobacterium?abscessus)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、鮑曼不動桿菌(acinetobacter?baumannii)、棕色固氮菌(azotobacter?vinelandii)、需鹽色鹽桿菌(chromohalobacter?salexigens)、克氏檸檬酸桿菌(citrobacter?koseri)、楊氏檸檬酸桿菌(citrobacter?youngae)、陰溝腸桿菌(enterobacter?cloacae)、水油海桿菌(marinobacter?aquaeolei)、海洋單胞菌(marinomonas?mediterranea)、菠蘿泛菌(pantoea?ananatis)、游海假交替單胞菌(pseudoalteromonas?haloplanktis)、羅氏真養(yǎng)菌(ralstonia?eutropha)、腐敗希瓦氏菌(shewanella?putrefaciens)和脫氮硫桿菌(thiobacillus?denitrificans)中的1種以上的微生物。

21、例如，上述davb基因可以由seq?id?no:1的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:2的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

22、上述dava基因可以由seq?id?no:3的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:4的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

23、上述gabt基因可以由seq?id?no:5的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:6的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

24、上述yahk基因可以由seq?id?no:7的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:8的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

25、上述car基因可以由seq?id?no:9的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:10的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

26、上述sfp基因可以由seq?id?no:11的堿基序列表示或者可以由seq?id?no:12的氨基酸序列編碼，但并不限定于此。

27、根據(jù)本發(fā)明的1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物可以通過將davb、dava、gabt、yahk、car和sfp基因全部包含或個別包含的一個以上的載體導(dǎo)入或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而制造。

28、本發(fā)明中所使用的“載體(vector)”是指作為用于向宿主細(xì)胞傳遞、表達目標(biāo)基因的手段所使用的所有類型的核酸序列轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)體。除非另有說明，否則上述載體可以是指使擔(dān)載的核酸序列插入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)進行表達和/或獨立進行表達。這樣的載體為了表達基因插入物而包括可操作地連接的必需的調(diào)控元件，“可操作地連接的(operablylinked)”是指目標(biāo)基因與其調(diào)控序列彼此功能性地結(jié)合并以能夠進行基因表達的方式連接，“調(diào)控元件”包括用于實施轉(zhuǎn)錄的啟動子、用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄的任意的操縱子序列、編碼合適的mrna核糖體結(jié)合位點的序列、以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。

29、本發(fā)明中所使用的載體只要能夠在宿主細(xì)胞中進行復(fù)制就沒有特別限定，可以利用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任意的載體。作為上述載體的一個例子，可以舉出天然狀態(tài)或重組狀態(tài)的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，作為噬菌體載體或粘粒載體，有pwe15、m13、λmbl3、λmbl4、λixii、λashii、λapii、λt10、λt11、charon4a、charon21a等，作為質(zhì)粒載體，有pbr系、puc系、pbluescriptii系、pgem系、ptz系、pcl系和pet系等，但并不限定于此。

30、上述載體可以代表性地構(gòu)建為用于克隆的載體或用于表達的載體。用于表達的載體可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中用于在植物、動物或微生物中表達外源基因或蛋白質(zhì)的常規(guī)載體，并且可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的各種方法而構(gòu)建。

31、重組載體可以以原核細(xì)胞或真核細(xì)胞為宿主而構(gòu)建。例如，在所使用的載體為表達載體且以原核細(xì)胞為宿主時，通常包含可以使轉(zhuǎn)錄進行的強啟動子(例如，plλ啟動子、cmv啟動子、trp啟動子、lac啟動子、tac啟動子、t7啟動子)、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。在以真核細(xì)胞為宿主時，在載體所包含的真核細(xì)胞中啟動的復(fù)制起點包括f1復(fù)制起點、sv40復(fù)制起點、pmb1復(fù)制起點、腺病毒復(fù)制起點、aav復(fù)制起點和bbv復(fù)制起點等，但并不限定于此。此外，可以利用源于哺乳動物細(xì)胞的基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或者源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、疫苗病毒7.5k啟動子、sv40啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、hsv的tk啟動子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄終止序列。

32、上述重組載體可以包括選擇標(biāo)記(selection?marker)，上述選擇標(biāo)記用于篩選利用載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體(宿主細(xì)胞)，在經(jīng)上述選擇標(biāo)記處理的培養(yǎng)基中只有表達選擇標(biāo)記的細(xì)胞可以生存，因此能夠篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。作為代表性的例子，上述選擇標(biāo)記有卡那霉素、鏈霉素、氯霉素等，但并不限定于此。

33、通過將重組載體插入宿主細(xì)胞，從而可以制作轉(zhuǎn)化體，上述轉(zhuǎn)化體可以通過將重組載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞而得到。宿主細(xì)胞是可以穩(wěn)定且連續(xù)地克隆或表達上述表達載體的細(xì)胞，也可以利用本技術(shù)領(lǐng)域中公知的任何宿主細(xì)胞。

34、在為了制作重組微生物而對原核細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化時，作為宿主細(xì)胞，可以利用e.coli?jm109、e.coli?bl21、e.coli?rr1、e.coli?le392、e.coli?b、e.coli?x?1776、e.coli?w3110、e.coli?xl1-blue之類的大腸桿菌屬菌株；枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌之類的芽孢桿菌屬菌株；棒狀桿菌屬菌株；鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和假單胞菌種之類的各種腸道細(xì)菌和菌株等，但并不限定于此。

35、在為了制作重組微生物而對真核細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化時，作為宿主細(xì)胞，可以利用酵母(例如，釀酒酵母)、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞，例如，sp2/0、cho?k1、cho?dg44、per.c6、w138、bhk、cos7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck細(xì)胞株等，但并不限定于此。

36、本發(fā)明中所使用的“轉(zhuǎn)化(transformation)”是指將外源dna導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)而人為引起基因改變的現(xiàn)象，“轉(zhuǎn)化體(transformat)”是指導(dǎo)入有外源dna并穩(wěn)定維持目標(biāo)基因的表達的宿主細(xì)胞。

37、在上述轉(zhuǎn)化中，根據(jù)宿主細(xì)胞而選擇合適的載體導(dǎo)入技術(shù)，從而可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達目標(biāo)基因或包含其的重組載體。例如，載體導(dǎo)入可以通過電穿孔法(electroporation)、熱沖擊(heat-shock)、磷酸鈣(capo4)沉淀、氯化鈣(cacl2)沉淀、顯微注射法(microinjection)、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、乙酸鋰-dmso法、或者它們的組合而實施，但并不限定于此。轉(zhuǎn)化的基因只要可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達，就可以被包括在內(nèi)，而不限制于將其插入宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)或者位于染色體外。

38、上述轉(zhuǎn)化體包括在生物體內(nèi)或試管內(nèi)利用根據(jù)本發(fā)明的重組載體進行了轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的細(xì)胞，并且可以與重組宿主細(xì)胞、重組細(xì)胞或重組微生物作為相同的用語被使用。

39、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，上述轉(zhuǎn)化體作為1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物，只要是本技術(shù)領(lǐng)域中公知的微生物，就沒有特別限定。

40、更具體而言，上述1,4-丁二醇生產(chǎn)微生物可以為埃希菌(escherichia)屬或棒狀桿菌(corynebacterium)屬菌株。

41、作為上述埃希菌屬菌株，有大腸桿菌(escherichia?coli)、艾伯特埃希菌(escherichia?albertii)、蟑螂埃希菌(escherichia?blattae)、弗格森埃希菌(escherichia?fergusonii)、赫氏埃希菌(escherichia?hermannii)、傷口埃希菌(escherichia?vulneris)等，但并不限定于此。

42、作為上述棒狀桿菌屬菌株，棒狀桿菌屬菌株可以為谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)、生乳棒狀桿菌(corynebacterium?crudilactis)、沙漠棒狀桿菌(corynebacterium?deserti)、帚石南棒狀桿菌(corynebacterium?callunae)、蘇那棒狀桿菌(corynebacterium?suranareeae)、油橄欖棒狀桿菌(corynebacteriumlubricantis)、道桑棒狀桿菌(corynebacterium?doosanense)、高效棒狀桿菌(corynebacterium?efficiens)、烏氏棒狀桿菌(corynebacterium?uterequi)、停滯棒狀桿菌(corynebacterium?stationis)、帕氏棒狀桿菌(corynebacterium?pacaense)、奇棒狀桿菌(corynebacterium?singulare)、腐殖質(zhì)還原棒狀桿菌(corynebacteriumhumireducens)、海洋棒狀桿菌(corynebacterium?marinum)、耐鹽棒狀桿菌(corynebacterium?halotolerans)、蝶科棒狀桿菌(corynebacterium?spheniscorum)、弗氏棒狀桿菌(corynebacterium?freiburgense)、紋帶棒狀桿菌(corynebacteriumstriatum)、犬棒狀桿菌(corynebacterium?canis)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacteriumammoniagenes)、腎棒狀桿菌(corynebacterium?renale)、污染棒狀桿菌(corynebacteriumpollutisoli)、漢氏棒狀桿菌(corynebacterium?imitans)、里海棒狀桿菌(corynebacterium?caspium)、睪丸棒狀桿菌(corynebacterium?testudinoris)、假性棒狀桿菌(corynebacaterium?pseudopelargi)、微黃棒狀桿菌(corynebacterium?flavescens)等，但并不限定于此。

43、本發(fā)明的另一方式提供1,4-丁二醇的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物的步驟；以及從上述微生物或培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中回收1,4-丁二醇的步驟。

44、上述培養(yǎng)可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域中已知的合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件而進行，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以容易地調(diào)整培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來使用。具體而言，上述培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基，但并不限定于此。培養(yǎng)方法可以包括例如分批式培養(yǎng)(batch?culture)、連續(xù)式培養(yǎng)(continuous?culture)、補料分批式培養(yǎng)(fed-batch?culture)或者它們的組合培養(yǎng)，但并不限定于此。

45、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，上述培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足特定菌株的要求，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡M行修飾。關(guān)于埃希菌屬菌株和棒狀桿菌屬菌株的培養(yǎng)基，可以參考公知的文獻(manual?of?methods?for?general?bacteriology.american?societyfor?bacteriology.washington?d.c.,usa,1981)，但并不限定于此。

46、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，培養(yǎng)基中可以包含各種碳源、氮源和微量元素成分。作為可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素之類的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸之類的脂肪酸；甘油、乙醇之類的醇；乙酸之類的有機酸。這些物質(zhì)可以單獨使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作為可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿、豆粕和尿素或者無機化合物，例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源同樣可以單獨使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作為可以使用的磷的供應(yīng)源，可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉的鹽，但并不限定于此。此外，培養(yǎng)基可以含有生長所需要的硫酸鎂或硫酸鐵之類的金屬鹽，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和維生素之類的必要生長物質(zhì)。此外，可以使用適合培養(yǎng)基的前體。上述培養(yǎng)基或單個成分可以在培養(yǎng)過程中通過適當(dāng)?shù)姆绞椒峙蜻B續(xù)添加到培養(yǎng)液中，但并不限定于此。

47、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，在培養(yǎng)過程中，可以將氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸之類的化合物以適當(dāng)?shù)姆绞教砑拥轿⑸锱囵B(yǎng)液中來調(diào)整培養(yǎng)液的ph。此外，在培養(yǎng)過程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之類的消泡劑來抑制氣泡產(chǎn)生。進一步，為了維持培養(yǎng)液的有氧狀態(tài)，可以向培養(yǎng)液內(nèi)注入氧氣或者含氧氣的氣體(例如空氣)。培養(yǎng)液的溫度通?？梢詾?0℃至45℃，例如，可以為25℃至40℃。培養(yǎng)時間可以持續(xù)到有用物質(zhì)獲得期望的生產(chǎn)量為止，例如，可以為10至160小時。

48、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，在上述從培養(yǎng)的變異株和培養(yǎng)變異株的培養(yǎng)基中回收1,4-丁二醇的步驟中，可以根據(jù)培養(yǎng)方法并利用本技術(shù)領(lǐng)域中公知的合適的方法，從培養(yǎng)基中收集或回收所生產(chǎn)的1,4-丁二醇。例如，可以使用離心分離、過濾、提取、噴霧、干燥、蒸發(fā)、沉淀、結(jié)晶化、電泳、分級溶解(例如，硫酸銨沉淀)、色譜法(例如，離子交換、親和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。

49、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，在回收1,4-丁二醇的步驟中，可以將培養(yǎng)基低速離心分離而去除生物質(zhì)，可以將得到的上清液通過離子交換色譜法而分離。

50、根據(jù)本發(fā)明的一具體例，在上述回收1,4-丁二醇的步驟中，可以包括純化1,4-丁二醇的工序。

51、根據(jù)本發(fā)明的微生物與自然中存在的微生物不同，使用鳥氨酸作為碳源，從而可以有效地生產(chǎn)1,4-丁二醇。