本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化,涉及一種原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法。
背景技術(shù):
1、泛素化是通過e1、e2和e3三種酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將小分子蛋白質(zhì)泛素共價(jià)連接到底物蛋白上的過程。該過程涉及e1酶激活泛素、e2酶轉(zhuǎn)移泛素、以及e3酶識(shí)別底物并將泛素附著在底物上。泛素化不僅可以單一附著,還可以通過泛素的七個(gè)賴氨酸殘基(k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63)或n端甲硫氨酸(m1)形成不同類型的多聚泛素鏈,調(diào)控蛋白質(zhì)的降解、活性和細(xì)胞內(nèi)定位等多種功能。cullin1-ring?e3連接酶復(fù)合物(crl)是e3泛素連接酶家族中最龐大和多樣化的一類,由骨架蛋白cullin1、ring蛋白(如rbx1)、銜接蛋白和底物識(shí)別蛋白組成。cullin1蛋白作為骨架,通過與ring蛋白和底物識(shí)別模塊的相互作用,確保泛素從e2酶順利轉(zhuǎn)移至底物蛋白。crl1在細(xì)胞周期調(diào)控、dna修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其失調(diào)與多種疾病特別是癌癥密切相關(guān)。在cullin1催化的泛素化過程中,k48連接的多聚泛素鏈?zhǔn)且粋€(gè)經(jīng)典例子。首先,e2酶ube2d將第一個(gè)泛素分子連接到底物蛋白上,隨后在e2酶cdc34的作用下,泛素鏈通過k48連接位點(diǎn)進(jìn)行延伸。k48鏈的形成是蛋白質(zhì)降解信號(hào),被蛋白酶體識(shí)別并降解,從而調(diào)控細(xì)胞周期和基因表達(dá)。cullin1作為crl復(fù)合物的核心成分,其催化機(jī)制對(duì)于理解泛素化過程的生化機(jī)制至關(guān)重要。crl的研究不僅揭示了泛素化的分子機(jī)制,還為疾病治療提供了潛在的藥物靶點(diǎn)。
2、然而,高效表達(dá)和純化cullin1-rbx1一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的瓶頸問題。傳統(tǒng)上,研究人員主要采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)cullin1-rbx1的表達(dá)。然而,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也存在顯著的局限性。首先,其表達(dá)周期較長,從病毒轉(zhuǎn)化到蛋白質(zhì)收獲通常需要一個(gè)月的時(shí)間,這大大降低了實(shí)驗(yàn)的效率。其次,昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒生產(chǎn)的成本較高,增加了實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外,操作復(fù)雜性較高,需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和專業(yè)的技術(shù)人員,這在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn),提供一種在體外高效便捷地制備cullin1-rbx1?e3酶復(fù)合物的方法,將優(yōu)化改造的cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng),得到e3連接酶復(fù)合物。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的?,本發(fā)明提供原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,先分別對(duì)cullin1基因和rbx1基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,將cullin1和rbx1共表達(dá),得到cullin1-rbx1融合蛋白,再將cullin1-rbx1融合蛋白與skp1-skp2、cks1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng),得到cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物;具體步驟如下:
3、(1)通過原核表達(dá)手段獲取cullin1-rbx1融合蛋白:
4、1)構(gòu)建重組載體msyb-cullin1-rbx1-his:為了構(gòu)建同時(shí)表達(dá)cullin1和rbx1的載體,首先對(duì)全長人類cullin1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,在其n端添加了msyb增溶標(biāo)簽和hrv3c酶切位點(diǎn),然后,將優(yōu)化后的cullin1克隆到pet29a載體的第一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)后面;接著,對(duì)全長人類rbx1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,在其n端添加了6x?his標(biāo)簽和hrv?3c酶切位點(diǎn),并將其克隆到pet29a載體的第二個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)后面,得到重組載體msyb-cullin1-rbx1-his;
5、2)融合蛋白cullin1-rbx1的表達(dá):通過熱激法把得到的重組載體msyb-cullin1-rbx1-his轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(de3)中,在含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb平板上培養(yǎng)過夜,過夜培養(yǎng)后長出的菌落視為陽性菌落;
6、取含有重組質(zhì)粒的陽性單菌落,接種到含有終濃度為50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中,37℃、200?rpm振蕩培養(yǎng)10?~?12h,按照體積比為1:50的比例將培養(yǎng)的菌液接種到新鮮的含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中,37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液濃度od600在0.8?~?1.2,然后加入誘導(dǎo)物iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至工作濃度0.2?mm,繼續(xù)以16℃、180rpm的條件培養(yǎng)10-26h后,離心20min,收集并重懸菌體;
7、將離心收集的菌體,用50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液(ph=7.5)重懸,加入pmsf(苯甲基磺酰氟)至工作濃度1mm,混勻,于冰上超聲破碎,超聲參數(shù):功率100w,超聲3s,間隔6s,共40min;然后?4℃,12000rpm,離心30min,獲取含有蛋白的上清液;
8、3)融合蛋白cullin1-rbx1的純化:采用鎳柱純化,將獲取的上清液與鎳柱孵育后用20mm和300mm的咪唑洗雜和洗脫,收集洗脫液并用prescission蛋白酶裂解蛋白質(zhì)以去除his標(biāo)簽,將洗脫液在透析緩沖液(50?mm?mes,?50?mm?nacl,ph?6.5)中透析過夜;第二天再用0.22μm濾膜過濾上樣至用緩沖液(50mm?mes,ph?6.5)預(yù)平衡的source?s?10/300gl色譜柱中,線性梯度洗脫分離;得到純凈的cullin1-rbx1融合蛋白;利用此方法,每升菌可純化得到2毫克蛋白;
9、(2)cullin1-rbx1?e3連接酶的制備:
10、將蛋白成分接頭蛋白?skp1-skp2、cks1和cullin1-rbx1在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為:冰上孵育一小時(shí),得到cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物。
11、所述反應(yīng)體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液(ph?7.5),該體系中各物質(zhì)的含量為:?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。
12、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,在體外利用改造過的cullin1-rbx1e3融合蛋白高效便捷地制備出了cullin1-rbx1e3酶復(fù)合物;在cullin1的n端引入msyb標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣叩鞍踪|(zhì)的溶解性,解決原核表達(dá)系統(tǒng)中cullin1難以折疊的問題;此外,通過將cullin1和rbx1共表達(dá),使得cullin1和rbx1形成穩(wěn)定的復(fù)合物,減少了各自單獨(dú)存在時(shí)的錯(cuò)誤折疊和聚集;這些改進(jìn)使得能夠在更短的時(shí)間內(nèi)便捷而高效地表達(dá)和純化cullin1-rbx1融合蛋白,為后續(xù)的生化結(jié)構(gòu)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ);與昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)需要接近一個(gè)月的時(shí)間相比,通過本發(fā)明所述方法的優(yōu)勢在于能夠在一周內(nèi)每一升菌便捷地獲取2mg?cullin1-rbx1融合蛋白,完全滿足相應(yīng)生化特征,結(jié)構(gòu)機(jī)制和活性分子篩選的需求;本發(fā)明制備cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法簡單、高效,適于大規(guī)模推廣使用。
1.原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,具體步驟如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,所述反應(yīng)體系還含有50mm?hepes?150mm?nacl緩沖液,該體系中各物質(zhì)的含量為:?1μm?skp1-skp2、1μm?cks1和1μm?cullin1-rbx1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,lb平板和lb液體培養(yǎng)基中卡那霉素的終濃度均為50μg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,步驟2)在振蕩培養(yǎng)的條件為:37℃、200?rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,所述msyb的氨基酸序列如下所示:
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)高效獲取cullin1-rbx1?e3連接酶復(fù)合物的方法,其特征在于,所述超聲破碎的參數(shù)為:功率100w,超聲3s,間隔6s,共40min。