本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的癌癥，主要包括導(dǎo)管癌和小葉癌。2016年美國ca（acancerjournalforclinicians）公布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，美國2016年預(yù)計(jì)將有420840例女性患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的38%，居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位，并且死亡人數(shù)將達(dá)52930例。更為嚴(yán)重的是全球的乳腺癌發(fā)病率正在逐年增長。

細(xì)胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，目前細(xì)胞培養(yǎng)已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科研究的重要基礎(chǔ)。為了深入探討細(xì)胞的生長活動(dòng)規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機(jī)制，開發(fā)具有不同針對(duì)性的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。其中，mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞作為人源性高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞，常用于乳腺癌的體內(nèi)外研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，用于多種人源以及非人源細(xì)胞的培養(yǎng)。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入3-5mlpbs洗滌細(xì)胞2-3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1-2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3-5min，加入2-3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底40-50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000-1500g/min條件下離心3-10min，用移液槍去除上清液，加入2-3ml新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞40-50次；平均加入到3-8個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明所述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，方法合理，易于實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態(tài)及分散度佳，可以方便應(yīng)用于乳腺癌的體內(nèi)外研究。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta?？梢耘c胰蛋白酶相配合，迅速使貼壁細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，減少胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用包括70-90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以進(jìn)一步為培養(yǎng)的細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還能終止胰蛋白酶的消化作用。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖80-90份、碳酸氫鈉10-20份、丙酮酸鈉8-18份、脂肪酸白蛋白4-16份、氯化鉀30-50份、無水硫酸鎂5-12份、氯化鈉60-80份、無水磷酸二氫鈉8-16份、葉酸0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸5-10份、丁二酸鈉9-18份、d-泛酸鈣0.2-0.8份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛0.1-0.6份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.2-1份、乙酸酯1-3份、生物素0.5-0.8份、硫辛酸0.2-0.8份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：胰島素生長因子3-8份、白介素62-5份、白介素101-4份、白介素123-6份、tnf-β2-10份、gm-csf1-5份。基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更多的營養(yǎng)物。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。所述鏈霉素選自10000μg/ml?？梢杂行Х乐古囵B(yǎng)細(xì)胞被污染。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述青霉素選自10000u/ml，青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。

進(jìn)一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)皿為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。

有益效果：本發(fā)明所述的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，方法合理，易于實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，其中，mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更多的營養(yǎng)物（包括生長因子等），細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態(tài)及分散度更佳，可以有利于生物與健康相關(guān)研究。

具體實(shí)施方式

下面將通過幾個(gè)具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是為了說明問題，并不是一種限制。

實(shí)施例1

一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入3mlpbs洗滌細(xì)胞2次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化5min，加入2ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底40次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000g/min條件下離心10min，用移液槍去除上清液，加入2ml新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞40次；平均加入到3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖80份、碳酸氫鈉10份、丙酮酸鈉8份、脂肪酸白蛋白4份、氯化鉀30份、無水硫酸鎂5份、氯化鈉60份、無水磷酸二氫鈉8份、葉酸0.2份、肌醇0.5份、煙酰胺0.2份、無水氯化鈣20份、硝酸鐵0.1份、丁二酸5份、丁二酸鈉9份、d-泛酸鈣0.2份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.2份、酒石酸膽堿0.5份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.1份、鹽酸吡哆辛0.1份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.2份、乙酸酯1份、生物素0.5份、硫辛酸0.2份、酚紅鈉0.8份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：胰島素生長因子3份、白介素62份、白介素101份、白介素123份、tnf-β2份、gm-csf1份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。

實(shí)施例2

一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細(xì)胞3次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心3min，用移液槍去除上清液，加入3ml新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞50次；平均加入到8個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖90份、碳酸氫鈉20份、丙酮酸鈉18份、脂肪酸白蛋白16份、氯化鉀50份、無水硫酸鎂12份、氯化鈉80份、無水磷酸二氫鈉16份、葉酸0.6份、肌醇1.5份、煙酰胺0.8份、無水氯化鈣40份、硝酸鐵0.5份、丁二酸10份、丁二酸鈉18份、d-泛酸鈣0.8份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.8份、酒石酸膽堿1份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.5份、鹽酸吡哆辛0.6份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽1份、乙酸酯3份、生物素0.8份、硫辛酸0.8份、酚紅鈉1.5份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：胰島素生長因子8份、白介素65份、白介素104份、白介素126份、tnf-β10份、gm-csf5份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。

實(shí)施例3

一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入4mlpbs洗滌細(xì)胞2次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化4min，加入2ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底48次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1200g/min條件下離心5min，用移液槍去除上清液，加入3ml新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞45次；平均加入到6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括80%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、脂肪酸白蛋白9份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.6份、乙酸酯1.8份、生物素0.7份、硫辛酸0.6份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：胰島素生長因子5份、白介素63份、白介素102份、白介素125份、tnf-β8份、gm-csf2份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。

實(shí)施例4

一種mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細(xì)胞2次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化5min，加入2-3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心5min，用移液槍去除上清液，加入2ml新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞50次；平均加入到6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉10份、脂肪酸白蛋白8份、氯化鉀38份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.4份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯1.8份、生物素0.6份、硫辛酸0.7份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括6份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸12份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸10份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：胰島素生長因子3份、白介素65份、白介素104份、白介素123份、tnf-β5份、gm-csf3份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。

以上所述僅是發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。