三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感基因TNF-α突變檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)及基因診斷學(xué)領(lǐng)域，為檢測與Ξ陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感 基因TNF-a突變的試劑盒，通過檢測TNF-a基因啟動(dòng)子區(qū)308G〉A(chǔ)遺傳變異（rsl800629) 預(yù)測Ξ陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] S陰性乳腺癌（triple-negativebreastcancer,TNBC)作為一種特殊亞型，特指 雌激素受體（estrogenreceptor,ER)、孕激素受體（progestronereceptor,PR)、表皮生長 因子受體2化umanepidermalgrowthfactorreceptor2,肥R2)均為陰性的乳腺癌，約 占全部乳腺癌的15%，好發(fā)于年輕婦女，大約1/3的患者術(shù)后2-3年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且 在復(fù)發(fā)后快速進(jìn)展直至死亡。在TNBC患者中及早評估其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，篩選出轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高的患 者并對該人群進(jìn)行密切檢測及早期干預(yù)治療將有助于臨床上改善TNBC患者預(yù)后。盡管Ξ 陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高且預(yù)后較差，目前并未存在能夠評估TNBC患者轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的分子生 物學(xué)及基因診斷方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種快速有效的檢測TNF-a基因啟動(dòng)子 區(qū)308G〉A(chǔ)遺傳變異從而檢測Ξ陰性乳腺癌的試劑盒，同時(shí)提供了其具體檢測方法。
[0004] 本發(fā)明試劑盒中的各組分及含量如下： 10XPCR反應(yīng)緩沖液l.Oul; 25mMMgClz溶液 0.加1 ; 2. 5mMdNTPMix1:ure1.Oul; 5U/ulTaqDM聚合酶 0. 25ul;lOuM引物F0. 2加 1 ; lOuM引物R0. 2加 1 ; 10X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2μ1 ;?ου/μ1Ncol內(nèi)切酶 0. 5μ1。
[0005] 滅菌蒸饋水13. 5ul; 所述引物F的序列如下：5'-CCCCAMAGMATGGAGGCMTAGGTTTTGAGGGCCATG-3' (SEQ:ID:N0:1); 所述引物1?的序列如下：5'-61766664〔4〔4〔446〔41'(：-3'669:10:側(cè):2); 本試劑盒為一人次檢測用量，保存溫度-20°C。
[0006] 具體檢測步驟如下： 1) 取Ξ陰性乳腺癌患者外周血基因組DNA; 2) PCR反應(yīng)： 反應(yīng)體系總體積為lOul，包括10XPCR反應(yīng)緩沖液1.Oul，25mMMgClz溶液0.加1，dNTP MixUire(2.5mM) 1.0ul，TaqDM聚合酶 0.25ul(5U/ul)，特異性引物對F和R(lOuM) 各0. 25ul，滅菌蒸饋水6.Oul，DM1.Oul;反應(yīng)條件為95°C5分鐘，此后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的 98°C10 秒、55°C30 秒、72°C30 秒，最后一步為 72°C5 分鐘； 3) 限制性內(nèi)切酶酶切 在步驟2)所得產(chǎn)物加入試劑盒中所包含10X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2μ1，化〇1內(nèi)切酶 0. 5μ1 (10U/μ1)，去離子水7. 5μ1，在37°C條件下水浴1小時(shí)； 4) 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述所得酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶大小判斷是否存在 TNF-a308G〉A(chǔ)遺傳變異，判斷方法如下： (1) 若rsl800629位點(diǎn)上兩個(gè)等位基因均存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分 析可見僅171bp處存在條帶； (2) 若rsl800629位點(diǎn)上僅一個(gè)等位基因存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分 析可見17化P、13化P處均存在條帶； (3) 若rsl800629位點(diǎn)上并未存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析僅在13化P 處可見條帶。
[0007] 攜帶A等位基因的Ξ陰性乳腺癌患者發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高（OR= 5.83， 95%CI: 1.64 - 20.76,P= 0.004)〇
[000引 TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域的rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與女性Ξ陰性乳腺癌 的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此，可用于評估Ξ陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)Ξ陰性乳腺癌患者DNA的TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域的rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為AA或AG時(shí)，個(gè)體的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng) 險(xiǎn)較高。
[0009] 盡管Ξ陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高且預(yù)后較差，目前并未存在能夠評估TNBC患者轉(zhuǎn) 移風(fēng)險(xiǎn)的分子生物學(xué)及基因診斷方法。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于從分子生物學(xué)及基因診斷水平 上，首次提供篩選Ξ陰性乳腺癌患者中存在高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)人群的技術(shù)方法。本發(fā)明通過針對 rsl800629位點(diǎn)進(jìn)行巧妙的引物設(shè)計(jì)，僅依靠普通PCR及瓊脂糖凝膠電泳，即可發(fā)現(xiàn)TNBC患 者中是否存在TNF-a基因308G〉A(chǔ)變異。該技術(shù)方法設(shè)計(jì)巧妙、簡易可行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 可在各級醫(yī)院進(jìn)行推廣，對于評估TNBC患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)提供了幫助，有助于臨床 上對該類患者進(jìn)行早期干預(yù)及治療。
【附圖說明】
[0010] 圖1為不同類型患者的電泳檢測結(jié)果對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 為更清楚地闡明本發(fā)明的技術(shù)方法，W下將對該發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳盡闡述， 舉例僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。具體操作步驟如下： 實(shí)施例1 : 一種Ξ陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感基因TNF-a突變檢測試劑盒，其組分及含量如下：包 括 10XPCR反應(yīng)緩沖液 1.Oul，25mMMgClz溶液 0.加1，dNTPMixUire(2. 5mM) 1.Oul，Taq DM聚合酶0. 25ul(5U/ul)，特異性引物F和R(lOuM)各0. 25ul，滅菌蒸饋水6.Oul。本 試劑盒為一人次檢測用量，保存溫度-20°C。
[001引步驟1 :Ξ陰性乳腺癌患者外周血DM提取： 使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)(離屯、柱法）提取患者外周血基因組DNA。
[001引步驟2 :PCR反應(yīng)，復(fù)制目的片段： (1) 根據(jù)TNF-α啟動(dòng)子區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增包含rsl800629位點(diǎn)的DNA片 段設(shè)計(jì)引物序列如下： F: 5' -CCCCAAAAGAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3, R: 5' -GTTGGGGACACACAAGCATC-3'; (2)PCR反應(yīng)： 反應(yīng)體系總體積為lOul，包括10XPCR反應(yīng)緩沖液1.Oul，25mMMgClz溶液0.加1，dNTP MixUire(2.5mM) 1.0ul，TaqDNA聚合酶 0.25ul(5U/ul)，特異性引物對F和R(lOuM)各 0. 2加1，滅菌蒸饋水6.0ul，DNAl.Oul。反應(yīng)條件為95°C5分鐘，此后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的 98°C10 秒、55°C30 秒、72°C30 秒，最后一步為 72°C5 分鐘。
[0014] 步驟3:限制性內(nèi)切酶酶切 使用本檢測試劑盒，在步驟2所得產(chǎn)物加入試劑盒中所包含10X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 2μ1，Ncol內(nèi)切酶0. 5μ1 (10U/μ1)，去離子水7. 5μ1，在37°C條件下水浴1小時(shí)。
[0015] 步驟4 :3%瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟上述所得酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶大小判斷 是否存在TNF-α308G〉A(chǔ)遺傳變異。判斷方法如下： 1. 若rsl800629位點(diǎn)上兩個(gè)等位基因均存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析 可見僅17化P處存在條帶。提示陰性乳腺癌患者具有腫瘤轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)； 2. 若rsl800629位點(diǎn)上僅一個(gè)等位基因存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析 可見17化P、13化P處均存在條帶（40bp處還有一條帶，但量少基本不可見）。提示：Ξ陰性 乳腺癌患者具有腫瘤轉(zhuǎn)移的較高風(fēng)險(xiǎn)； 3. 若rsl800629位點(diǎn)上并未存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析僅在13化P 處可見條帶（40bp處還有一條帶，但量少基本不可見）。提示：Ξ陰性乳腺癌患者具有腫瘤 轉(zhuǎn)移的低風(fēng)險(xiǎn)。
[0016] 攜帶A等位基因的Ξ陰性乳腺癌患者發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高（OR= 5.83， 95%CI: 1.64 - 20.76,P= 0.004)〇
[0017] 不同類型的患者的電泳檢測結(jié)果如圖1所示rsl800629位點(diǎn)上兩個(gè)等位基因均存 在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析可見僅17化P處存在條帶(泳道6)。提示：Ξ陰 性乳腺癌患者具有腫瘤轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)。rsl800629位點(diǎn)上僅一個(gè)等位基因存在308G〉A(chǔ)遺傳 變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析可見17化P、13化P處均存在條帶(泳道3)。提示：Ξ陰性乳腺 癌患者具有腫瘤轉(zhuǎn)移的較高風(fēng)險(xiǎn)。rsl800629位點(diǎn)上并未存在308G〉A(chǔ)遺傳變異，PCR產(chǎn)物 進(jìn)行電泳分析僅在13化P處可見條帶(泳道1、2、4、5)。提示：Ξ陰性乳腺癌患者具有腫瘤 轉(zhuǎn)移的低風(fēng)險(xiǎn)。
[001引 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用實(shí)施例1的方法，我們對募集到的具有完整病歷資料及分型明確的768例乳腺癌(TNBC163例)和565例無腫瘤病史的健康女性對照進(jìn)行了基因型分析。乳腺癌患者和正常 對照均為中國大陸漢族婦女?；颊呓?jīng)組織病理學(xué)確診，無年齡限制；正常對照無腫瘤病史， 經(jīng)體檢無腫瘤體征，年齡（± 5歲）與病例匹配。收集研究對象的年齡、身高、體重、疾病亞 型、腫瘤臨床特征等信息。研究對象的基本情況見表1。每個(gè)研究對象均知情同意參加本研 究并捐獻(xiàn)2ml外周靜脈血，用于分離制備淋己細(xì)胞基因組DNA。研究結(jié)果表明，在校正了 BMI、腫瘤大小、淋己結(jié)轉(zhuǎn)移、初潮年齡、是否絕經(jīng)、癌癥家族史等因素后，TNF-a基因啟動(dòng)子 區(qū)308G〉A(chǔ)遺傳變異（rsl800629)與TNBC患者腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（OR= 5. 83，95%CI: 1. 64 - 20. 76，P= 0. 004)。
[0019]表1.研究對象的基本信息 表1.研究對象的基本信息
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感基因TNF-α突變的檢測試劑盒，其特征在于，包括 如下組分： 10XPCR反應(yīng)緩沖液l.Oul; 25mMMgCl2溶液 0· 5ul; 2. 5mMdNTPMixture1.Oul； 5U/ulTaqDNA聚合酶 0· 25ul; lOuM引物F0· 25ul; lOuM引物R0· 25ul; 10X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2μ1 ; 10U/μ1Ncol內(nèi)切酶 0· 5μ1 ; 滅菌蒸餾水13. 5ul; 所述引物F的堿基序列如SEQ:ID:NO:1所示； 所述引物R的堿基序列如SEQ:ID:NO: 2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感基因TNF-α突變的檢測試劑盒， 其特征在于，具體檢測步驟如下： 1) 取三陰性乳腺癌患者外周血基因組DNA; 2. PCR反應(yīng)： 反應(yīng)體系總體積為l〇ul，包括10XPCR反應(yīng)緩沖液1. 0ul，25mMMgCl2溶液0. 5ul， 2.5mMdNTPMixturel.Oul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul，10uM特異性引物對F和R各 0.25111，滅菌蒸餾水6.〇111，0嫩1.〇111;反應(yīng)條件為951€5分鐘，此后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的 98°C10 秒、55°C30 秒、72°C30 秒，最后一步為 72°C5 分鐘； 3) 限制性內(nèi)切酶酶切 取步驟2)所得產(chǎn)物加入試劑盒中所包含10X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2μ1，10U/μ1Ncol內(nèi)切酶0. 5μ1，去離子水7. 5μ1，在37°C條件下水浴1小時(shí)； 4) 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述所得酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶大小判斷是否存在 TNF-a308G>A遺傳變異，判斷方法如下： (1) 若rsl800629位點(diǎn)上兩個(gè)等位基因均存在308G>A遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分 析可見僅171bp處存在條帶； (2) 若rsl800629位點(diǎn)上僅一個(gè)等位基因存在308G>A遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分 析可見171bp、131bp處均存在條帶； (3) 若rsl800629位點(diǎn)上并未存在308G>A遺傳變異，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析僅在131bp 處可見條帶。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)易感基因TNF-α突變的檢測試劑盒，其包括特異性引物及其相關(guān)反應(yīng)溶液，本發(fā)明同時(shí)提供了試劑盒的檢測方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)巧妙、簡易可行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可在各級醫(yī)院進(jìn)行推廣，對于評估TNBC患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)提供了幫助，有助于臨床上對該類患者進(jìn)行早期干預(yù)及治療。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105368928
【申請?zhí)枴緾N201510618157
【發(fā)明人】李慧慧, 孟雪, 宋寶, 翟侃, 常春曉, 劉聰, 徐娜, 商玉紅
【申請人】山東省腫瘤醫(yī)院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年9月25日