曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]HER2 又稱 ErbB2,是表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的家族成員之一,它是由HER2基因編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。HER2作為一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)志物分子,其在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中都存在基因擴(kuò)增或蛋白過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象,臨床上稱為HER2陽(yáng)性腫瘤。經(jīng)統(tǒng)計(jì),乳腺癌病人中HER2過(guò)表達(dá)的比例高達(dá)20-30%,HER2陽(yáng)性腫瘤臨床表現(xiàn)為惡性程度高、對(duì)放療和化療不敏感、治療后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其潛在的危害性更大(詳見(jiàn)Ross JS, FletcherJA, (1999)The HER2/neu oncogene:prognostic factor, predictive factor and targetfor therapy, Semin Cancer B1l,9:125-138)。
[0003]由于HER2在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平具有顯著的差異,因而成為腫瘤免疫生物治療的理想靶點(diǎn),對(duì)于靶向HER2抗腫瘤藥物的研宄,1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)針對(duì)HER2人源化單克隆抗體的藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab,商品名赫賽汀)上市,如今采用曲妥珠單抗聯(lián)合化療藥物已成為國(guó)際公認(rèn)的治療HER2陽(yáng)性晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,與傳統(tǒng)化療方法相比,采用該聯(lián)合化療方案可以明顯提高乳腺腫瘤的治療效果,2010年美國(guó)FDA又批準(zhǔn)曲妥珠單抗用于HER2陽(yáng)性晚期胃癌的治療。
[0004]但是,大量臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn),很多HER2陽(yáng)性腫瘤病人對(duì)曲妥珠單抗治療產(chǎn)生了原發(fā)性和繼發(fā)性的耐藥現(xiàn)象,因此研宄人員需要深入研宄抗體藥物的作用機(jī)理,以更好地進(jìn)行腫瘤個(gè)體化的治療,近幾年新上市的人源化抗體藥物帕妥珠單抗(Pertuzumab)、小分子激酶抑制劑拉帕替尼(Lapatinib)以及抗體藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-DMl (Trastuzumab-DMl)等HER2靶向抗腫瘤藥物,這些都是研宄人員基于HER2陽(yáng)性腫瘤對(duì)曲妥珠單抗治療的耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)理進(jìn)行研宄而取得的成果。
[0005]當(dāng)然,開(kāi)發(fā)新型的HER2靶向抗腫瘤藥物需要尋找和建立合適的曲妥珠單抗耐藥的腫瘤模型。人乳腺癌細(xì)胞系BT-474是一種從臨床腫瘤病人體內(nèi)分離出的對(duì)曲妥珠單抗高度敏感的HER2過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞,其在裸鼠體內(nèi)具有較好的腫瘤生長(zhǎng)特性,因此經(jīng)常用作構(gòu)建耐藥的腫瘤模型?,F(xiàn)有技術(shù)中,有些研宄人員使用曲妥珠單抗體外誘導(dǎo)的方法建立BT-474耐藥細(xì)胞株,一般抗體處理時(shí)間為3-9個(gè)月(詳見(jiàn)Konecny GE, et al, (2006) Activity ofthe Dual Kinase Inhibitor Lapatinib(GW572016)against HER-2-0verexpressing andTrastuzumab-Treated Breast Cancer Cells, Cancer Res, 66:1630—1639 ;Yoshida R,etal, (2012)Mechanism of resistance to trastuzumab and molecular sensitizat1n viaADCC activat1n by exogenous express1n of HER2_extracellular domain in humancancer cells, Cancer Immunol Immunotherj 61:1905 - 1916),但是有研究認(rèn)為體外誘導(dǎo)的方法建立的BT-474耐藥細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)的耐藥性不明顯,曲妥珠單抗依舊可以明顯抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(詳見(jiàn) Kute TE, et al, (2009)Breast tumor cells isolated fromin vitro resistance to trastuzumab remain sensitive to trastuzumab ant1-tumoreffects in vivo and to ADCC killing.Cancer Tmmunol Immunother, 58:1887 - 1896),因此也有研宄使用曲妥珠單抗體內(nèi)誘導(dǎo)的方法建立BT-474耐藥細(xì)胞株,該細(xì)胞株也表現(xiàn)出一定程度的體外耐藥特性(詳見(jiàn) Emerson E0, et al, (2005) In vivo select1n andcharacterizat1n of herceptin-resistance in the human breast adennocarcinomamodel, BT-474, Proc Amer Assoc Cancer Res, Abstract 2646 ;Ritter CA, et al.(2007)Human Breast Cancer Cells Selected for Resistance to Trastuzumab In vivoOverexpress Epidermal Growth Factor Receptor and ErbB Ligands and RemainDependent on the ErbB Receptor Network.Clin Cancer Res.13:4909-4919),但是,關(guān)于BT-474耐藥細(xì)胞株對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理的研宄結(jié)果卻不一致,具體使用BT-474耐藥細(xì)胞株時(shí),Emerson EO等人發(fā)現(xiàn)HER2和EGFR受體表達(dá)降低,IGF-1R受體表達(dá)升高,而Ritter RA等發(fā)現(xiàn)HER2受體表達(dá)不變,EGFR受體和EGF生長(zhǎng)因子表達(dá)均升高,另外也有其他文獻(xiàn)資料報(bào)告使用了曲妥珠單抗耐藥的BT-47人乳腺癌細(xì)胞株,但是并未公開(kāi)該細(xì)胞株的制備流程。因此,制備出一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)耐藥特性的人乳腺癌細(xì)胞株,這對(duì)于研宄人員深入研宄曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制,并進(jìn)一步篩選新的抗腫瘤藥物以開(kāi)發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物來(lái)說(shuō),具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的首要目的是提供一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR,其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC C2014245,保藏日期為2015年I月14日。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR的構(gòu)建方法,包括以下步驟:
[0009]I)將普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT474在體外培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,向培養(yǎng)基中加入曲妥珠單抗至有效濃度為10ug/ml,所用的普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),曲妥珠單抗購(gòu)自Roche公司,其規(guī)格為320mg/支;
[0010]2)分2-4次逐步增加培養(yǎng)基中曲妥珠單抗的有效濃度,每次增加后維持曲妥珠單抗的有效濃度一段時(shí)間,直至細(xì)胞能在該濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代,如此最終獲得在曲妥珠單抗的有效濃度為100ug/ml的培養(yǎng)基中可穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇的曲妥珠單抗耐藥的BT474細(xì)胞;
[0011]3)將步驟2獲得的曲妥珠單抗耐藥的BT474細(xì)胞注射雌性裸鼠體內(nèi),待腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定后分3-5次給予曲妥珠單抗處理,每次給藥10mg/kg,I個(gè)月后,分離出腫瘤原代細(xì)胞并置于培養(yǎng)瓶中,加入曲妥珠單抗?jié)舛葹?00ug/ml的培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)和傳代I個(gè)月;
[0012]4)將步驟3獲得的細(xì)胞重復(fù)進(jìn)行步驟3處理,即得可穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇的曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR。
[0013]采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于:本發(fā)明利用人乳腺癌細(xì)胞株BT-474,結(jié)合曲妥珠單抗體外和體內(nèi)誘導(dǎo)兩種手段,得到一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株,該細(xì)胞株命名為BT-474/HR,經(jīng)檢測(cè)和研宄分析結(jié)果表明,與普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474相比,本發(fā)明公開(kāi)的曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR經(jīng)過(guò)抗體處理后,不僅細(xì)胞形態(tài)更穩(wěn)定,體外生長(zhǎng)增殖速度的降低幅度小,而且細(xì)胞的HER