曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]HER2 又稱 ErbB2，是表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的家族成員之一，它是由HER2基因編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。HER2作為一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)志物分子，其在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中都存在基因擴(kuò)增或蛋白過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，臨床上稱為HER2陽(yáng)性腫瘤。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌病人中HER2過(guò)表達(dá)的比例高達(dá)20-30%，HER2陽(yáng)性腫瘤臨床表現(xiàn)為惡性程度高、對(duì)放療和化療不敏感、治療后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其潛在的危害性更大(詳見(jiàn)Ross JS, FletcherJA, (1999)The HER2/neu oncogene:prognostic factor, predictive factor and targetfor therapy, Semin Cancer B1l,9:125-138)。
[0003]由于HER2在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平具有顯著的差異，因而成為腫瘤免疫生物治療的理想靶點(diǎn)，對(duì)于靶向HER2抗腫瘤藥物的研宄，1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)針對(duì)HER2人源化單克隆抗體的藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab，商品名赫賽汀)上市，如今采用曲妥珠單抗聯(lián)合化療藥物已成為國(guó)際公認(rèn)的治療HER2陽(yáng)性晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，與傳統(tǒng)化療方法相比，采用該聯(lián)合化療方案可以明顯提高乳腺腫瘤的治療效果，2010年美國(guó)FDA又批準(zhǔn)曲妥珠單抗用于HER2陽(yáng)性晚期胃癌的治療。
[0004]但是，大量臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，很多HER2陽(yáng)性腫瘤病人對(duì)曲妥珠單抗治療產(chǎn)生了原發(fā)性和繼發(fā)性的耐藥現(xiàn)象，因此研宄人員需要深入研宄抗體藥物的作用機(jī)理，以更好地進(jìn)行腫瘤個(gè)體化的治療，近幾年新上市的人源化抗體藥物帕妥珠單抗(Pertuzumab)、小分子激酶抑制劑拉帕替尼(Lapatinib)以及抗體藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-DMl (Trastuzumab-DMl)等HER2靶向抗腫瘤藥物，這些都是研宄人員基于HER2陽(yáng)性腫瘤對(duì)曲妥珠單抗治療的耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)理進(jìn)行研宄而取得的成果。
[0005]當(dāng)然，開(kāi)發(fā)新型的HER2靶向抗腫瘤藥物需要尋找和建立合適的曲妥珠單抗耐藥的腫瘤模型。人乳腺癌細(xì)胞系BT-474是一種從臨床腫瘤病人體內(nèi)分離出的對(duì)曲妥珠單抗高度敏感的HER2過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞，其在裸鼠體內(nèi)具有較好的腫瘤生長(zhǎng)特性，因此經(jīng)常用作構(gòu)建耐藥的腫瘤模型?，F(xiàn)有技術(shù)中，有些研宄人員使用曲妥珠單抗體外誘導(dǎo)的方法建立BT-474耐藥細(xì)胞株，一般抗體處理時(shí)間為3-9個(gè)月(詳見(jiàn)Konecny GE, et al, (2006) Activity ofthe Dual Kinase Inhibitor Lapatinib(GW572016)against HER-2-0verexpressing andTrastuzumab-Treated Breast Cancer Cells, Cancer Res, 66:1630—1639 ；Yoshida R，etal, (2012)Mechanism of resistance to trastuzumab and molecular sensitizat1n viaADCC activat1n by exogenous express1n of HER2_extracellular domain in humancancer cells, Cancer Immunol Immunotherj 61:1905 - 1916),但是有研究認(rèn)為體外誘導(dǎo)的方法建立的BT-474耐藥細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)的耐藥性不明顯，曲妥珠單抗依舊可以明顯抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(詳見(jiàn) Kute TE, et al, (2009)Breast tumor cells isolated fromin vitro resistance to trastuzumab remain sensitive to trastuzumab ant1-tumoreffects in vivo and to ADCC killing.Cancer Tmmunol Immunother, 58:1887 - 1896),因此也有研宄使用曲妥珠單抗體內(nèi)誘導(dǎo)的方法建立BT-474耐藥細(xì)胞株，該細(xì)胞株也表現(xiàn)出一定程度的體外耐藥特性(詳見(jiàn) Emerson E0, et al, (2005) In vivo select1n andcharacterizat1n of herceptin-resistance in the human breast adennocarcinomamodel, BT-474, Proc Amer Assoc Cancer Res, Abstract 2646 ；Ritter CA, et al.(2007)Human Breast Cancer Cells Selected for Resistance to Trastuzumab In vivoOverexpress Epidermal Growth Factor Receptor and ErbB Ligands and RemainDependent on the ErbB Receptor Network.Clin Cancer Res.13:4909-4919)，但是，關(guān)于BT-474耐藥細(xì)胞株對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理的研宄結(jié)果卻不一致，具體使用BT-474耐藥細(xì)胞株時(shí)，Emerson EO等人發(fā)現(xiàn)HER2和EGFR受體表達(dá)降低，IGF-1R受體表達(dá)升高，而Ritter RA等發(fā)現(xiàn)HER2受體表達(dá)不變，EGFR受體和EGF生長(zhǎng)因子表達(dá)均升高，另外也有其他文獻(xiàn)資料報(bào)告使用了曲妥珠單抗耐藥的BT-47人乳腺癌細(xì)胞株，但是并未公開(kāi)該細(xì)胞株的制備流程。因此，制備出一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)耐藥特性的人乳腺癌細(xì)胞株，這對(duì)于研宄人員深入研宄曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制，并進(jìn)一步篩選新的抗腫瘤藥物以開(kāi)發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物來(lái)說(shuō)，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的是提供一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC C2014245，保藏日期為2015年I月14日。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0009]I)將普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT474在體外培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向培養(yǎng)基中加入曲妥珠單抗至有效濃度為10ug/ml，所用的普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，曲妥珠單抗購(gòu)自Roche公司，其規(guī)格為320mg/支；
[0010]2)分2-4次逐步增加培養(yǎng)基中曲妥珠單抗的有效濃度，每次增加后維持曲妥珠單抗的有效濃度一段時(shí)間，直至細(xì)胞能在該濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代，如此最終獲得在曲妥珠單抗的有效濃度為100ug/ml的培養(yǎng)基中可穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇的曲妥珠單抗耐藥的BT474細(xì)胞；
[0011]3)將步驟2獲得的曲妥珠單抗耐藥的BT474細(xì)胞注射雌性裸鼠體內(nèi)，待腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定后分3-5次給予曲妥珠單抗處理，每次給藥10mg/kg，I個(gè)月后，分離出腫瘤原代細(xì)胞并置于培養(yǎng)瓶中，加入曲妥珠單抗?jié)舛葹?00ug/ml的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)和傳代I個(gè)月；
[0012]4)將步驟3獲得的細(xì)胞重復(fù)進(jìn)行步驟3處理，即得可穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇的曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR。
[0013]采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于:本發(fā)明利用人乳腺癌細(xì)胞株BT-474，結(jié)合曲妥珠單抗體外和體內(nèi)誘導(dǎo)兩種手段，得到一種同時(shí)具有很強(qiáng)的體外和體內(nèi)曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株，該細(xì)胞株命名為BT-474/HR，經(jīng)檢測(cè)和研宄分析結(jié)果表明，與普通的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474相比，本發(fā)明公開(kāi)的曲妥珠單抗耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株BT-474/HR經(jīng)過(guò)抗體處理后，不僅細(xì)胞形態(tài)更穩(wěn)定，體外生長(zhǎng)增殖速度的降低幅度小，而且細(xì)胞的HER