本發(fā)明屬于微生態(tài)制劑領(lǐng)域，更具體地，涉及一種乳酸菌復(fù)合菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生態(tài)制劑是一種腸道菌群調(diào)節(jié)劑，其具有防治動物疾病、調(diào)節(jié)免疫功能、改善養(yǎng)殖環(huán)境等多種功能。目前應(yīng)用于微生態(tài)制劑的益生菌種主要有乳酸菌類、芽孢桿菌和酵母菌等。乳酸菌是人和動物消化道微生態(tài)區(qū)系中的優(yōu)勢菌群。研究表明，乳酸菌能產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、細(xì)菌素等生物活性物質(zhì)，能抑制動物腸道病原菌生長，促進消化吸收，維護腸道微生態(tài)平衡，增強免疫功能。我國對微生態(tài)制劑的研究始于20世紀(jì)80年代，但直到最近幾年才在生產(chǎn)中應(yīng)用。
由于飼用抗生素的濫用導(dǎo)致的內(nèi)源性感染，耐藥菌株增加，禽畜免疫力降低，腸道正常菌群的破壞及其在畜產(chǎn)品和環(huán)境中的殘留等問題在我國更為突出，農(nóng)業(yè)部禁止使用的抗生素品種越來越多。今后養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢是抗生素的全面禁止，因此抗生素替代品的研制需求越來越迫切。微生態(tài)制劑安全無毒，具有提高生產(chǎn)性能、防治動物疾病、調(diào)節(jié)免疫功能、改善養(yǎng)殖環(huán)境和提高飼料轉(zhuǎn)化率等多種功能,克服了應(yīng)用抗生素造成的菌群失調(diào)、出現(xiàn)耐藥性菌株及藥物的不良反應(yīng)，不僅可以防病治病，而且可以降低污染及改善環(huán)境，在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用有著良好的經(jīng)濟效益和社會效益，有效促進我國養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。在國外，微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)上的作用日益明顯，并且應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴大，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上也得到推廣應(yīng)用。
目前，單一微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用報道較多，關(guān)于復(fù)合微生態(tài)制劑尤其是不同菌株協(xié)同配比在養(yǎng)殖中的效果研究較少。研究表明，單一微生態(tài)制劑存在著作用單一、質(zhì)量不穩(wěn)定、成本高、殺菌效果不如抗生素等缺陷，復(fù)合微生態(tài)制劑對動物的促生長效果更好。因此，研究一種發(fā)酵工藝簡單、發(fā)酵時間短、產(chǎn)量高、適合工業(yè)化生產(chǎn)的可替代抗生素的復(fù)合微生態(tài)制劑顯得極為迫切。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服以上單一微生態(tài)制劑作用單一、產(chǎn)量低、發(fā)酵時間長等缺陷，提供一種乳酸菌復(fù)合菌劑，本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑產(chǎn)量高、發(fā)酵時間短，可應(yīng)用于乳酸菌固體飲料或乳酸菌飼料添加劑中。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌固體飲料或乳酸菌飼料添加劑中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種乳酸菌復(fù)合菌劑，所述乳酸菌復(fù)合菌劑包括羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，所述乳酸菌復(fù)合菌劑的制備方法為：將羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，然后離心收集菌泥，經(jīng)真空冷凍干燥獲得凍干復(fù)合菌粉即得所述乳酸菌復(fù)合菌劑；
其中，所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)階段中：
所述羅伊氏乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：葡萄糖8～12g/l、蔗糖40～60g/l、酵母提取物15～20g/l、乙酸鈉4～6g/l、檸檬酸氫二銨1～3g/l、七水硫酸鎂0.4～0.6g/l、一水硫酸錳0.1～0.3g/l、吐溫-800.5-1.5ml/l；所述羅伊氏乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖8～12g/l、蔗糖60～80g/l、酵母提取物30～50g/l、乙酸鈉4～6g/l、檸檬酸氫二銨1～3g/l、七水硫酸鎂0.4～0.6g/l、一水硫酸錳0.1～0.3g/l、吐溫-800.5～1.5ml/l；
所述植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的種子培養(yǎng)基為mrs液體培養(yǎng)基，其組成為：蛋白胨5～15g/l、牛肉浸膏5～15g/l、酵母提取物4～6g/l、葡萄糖15～20g/l、乙酸鈉4～6g/l、吐溫-800.5-1.5ml/l、檸檬酸氫二銨1～3g/l、磷酸氫二鉀1～3g/l、七水硫酸鎂0.4～0.6g/l、一水硫酸錳0.1～0.3g/l；
所述植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30～50g/l、酵母浸膏40～60g/l、乙酸鈉4～6g/l、檸檬酸氫二銨1～3g/l、七水硫酸鎂0.4～0.6g/l、一水硫酸錳0.1～0.3g/l、吐溫-800.5～1.5ml/l；
所述鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30～50g/l、蛋白胨30～50g/l、酵母浸膏10～15g/l、乙酸鈉4～6g/l、檸檬酸氫二銨1～3g/l、七水硫酸鎂0.4～0.6g/l、一水硫酸錳0.1～0.3g/l、吐溫-800.5～1.5ml/l；
各乳桿菌在種子培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為7～8h，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為8～10h。
羅伊氏乳桿菌是目前已報道的幾乎天然存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸菌，可穩(wěn)定定殖于動物腸道中，分泌羅伊氏菌素等抑菌物質(zhì)，抑制多種病原微生物的增殖，并通過激活免疫系統(tǒng)，增加抗炎細(xì)胞因子，降低炎癥因子來提高動物免疫力。我國衛(wèi)生部于2003年批準(zhǔn)了羅伊氏乳桿菌可作為人類保健品的微生物菌種，該菌被認(rèn)為是唯一能夠?qū)闹鳟a(chǎn)生廣譜抗菌作用的腸道乳桿菌。羅伊氏乳桿菌可通過與其他乳桿菌復(fù)配應(yīng)用于乳酸菌固體飲料或飼料添加劑中，如羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌可通過提高抗體和淋巴細(xì)胞水平來預(yù)防仔豬腹瀉，降低料肉比，提高生產(chǎn)性能；羅伊氏乳桿菌還可促進兒童腸道蠕動，促進消化改善便秘，對兒童輪狀病毒腹瀉有良好的治療效果。羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，可以通過下調(diào)患者神經(jīng)性膀胱炎中炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子而使患者膀胱炎的癥狀得以減輕。
本發(fā)明通過將羅伊氏乳桿菌植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌復(fù)配制備得到一種乳酸菌復(fù)合菌劑，該乳酸菌復(fù)合菌劑可發(fā)揮出三種乳酸菌的作用，具有質(zhì)量穩(wěn)定，殺菌效果強的優(yōu)點。本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑應(yīng)用于人體和動物腸道微生態(tài)體系時，既可調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、改善腸道環(huán)境、提高人體免疫性能、降低腹瀉發(fā)生、增強人體健康，又可作為飼料中抗生素替代品、提高斷奶仔豬的成活率、改善豬只腸道健康、降低料肉比和殘次發(fā)生率，減少仔豬腹瀉，具有一定的推廣應(yīng)用價值。
本發(fā)明通過對上述三種乳桿菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量進行優(yōu)化，可在較短的時間內(nèi)制備高產(chǎn)量的乳酸菌復(fù)合菌劑。另外，本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑的制備方法工藝簡單、成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述羅伊氏乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/l、蔗糖50g/l、酵母提取物20g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述羅伊氏乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/l、蔗糖80g/l、酵母提取物40g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g/l、牛肉浸膏10g/l、酵母提取物5g/l、葡萄糖20g/l、乙酸鈉5g/l、吐溫801ml/l、檸檬酸氫二銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、七水硫酸鎂0.6g/l、一水硫酸錳0.25g/l。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖40g/l、酵母浸膏50g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖40g/l、蛋白胨40g/l、酵母浸膏10g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基的ph為6.2～6.4。
在本發(fā)明中，所述羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)階段的具體操作為：
甘油管保藏菌種以2%接種量接種至三角瓶中，裝液量為60%，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24h后，以2%～3%的接種量接種至二級種子瓶中，裝液量為80%，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)約7h～8h后，以3%的接種量接種至發(fā)酵罐中。
發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速30～50rpm，壓力0.04～0.06mpa，ph值5.5～6.5，裝液量80%，待發(fā)酵液od600值和ph值趨于穩(wěn)定后開始放罐，培養(yǎng)時間約10～12h，放罐時罐溫降至20℃左右。
在本發(fā)明中，所述菌泥在真空冷凍干燥過程中使用凍干保護劑進行保護，所述凍干保護劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的凍干保護劑。
優(yōu)選地，所述凍干保護劑由脫脂奶粉、乳糖、海藻糖、抗結(jié)塊劑按質(zhì)量比為12:7:5:1的配比組成；所述菌泥與所述凍干保護劑質(zhì)量比為1:1。
作為一種優(yōu)選地技術(shù)方案，所述乳酸菌復(fù)合菌劑中，所述羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的活菌制劑的質(zhì)量比為1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5。
更為優(yōu)選地，所述羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的活菌制劑的質(zhì)量比為2：1：1。按照此質(zhì)量比復(fù)配得到的乳酸菌復(fù)合菌劑，可應(yīng)用于人體和動物腸道微生態(tài)體系，發(fā)揮出三種乳酸菌的作用，并且質(zhì)量穩(wěn)定、殺菌效果強。
上述乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌固體飲料或乳酸菌飼料添加劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，所述乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌固體飲料中的添加量為6～10%。
優(yōu)選地，所述乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌飼料添加劑中的添加量為15～20%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明將羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌進行復(fù)配，得到了一種乳酸菌復(fù)合菌劑，本發(fā)明通過對這三種乳桿菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量進行優(yōu)化，可在較短的時間內(nèi)制備高產(chǎn)量的乳酸菌復(fù)合菌劑。另外，本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑的制備方法工藝簡單、成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑可發(fā)揮羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌三種乳酸菌的作用，具有質(zhì)量穩(wěn)定、殺菌效果強的優(yōu)點；還具有調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡、改善腸道環(huán)境、提高人體免疫性能、降低腹瀉發(fā)生、增強人體健康的作用，可應(yīng)用于乳酸菌固體飲料中。另外，本發(fā)明提供的乳酸菌復(fù)合菌劑還可以提高斷奶仔豬的成活率、改善豬只腸道健康、降低料肉比和殘次發(fā)生率、減少仔豬腹瀉，作為抗生素的替代品被應(yīng)用于乳酸菌飼料添加劑中。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
實施例中所述的羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為商業(yè)化購買的菌種，例如可以廣東省微生物種質(zhì)資源庫購買。
實施例1羅伊氏乳桿菌凍干菌粉的制備
1.液體深層發(fā)酵培養(yǎng)
將羅伊氏乳桿菌甘油管保藏菌種以2%接種量接種至用250ml三角瓶裝著的150ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24h后，以3%的接種量接種至用1l三角瓶裝著的800ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)約7h后，以3%的接種量接種至200ml發(fā)酵罐中，內(nèi)裝160ml發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速50rpm，壓力0.05mpa，通風(fēng)量1.5l/h，發(fā)酵過程中ph值用30%的氫氧化鉀溶液控制在5.5～6.5之間，待發(fā)酵液od600值和ph值趨于穩(wěn)定后開始放罐，培養(yǎng)時間約8h，放罐時罐溫降至20℃左右，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為1010cfu/ml。
在本實施例中，羅伊氏乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/l、蔗糖50g/l、酵母提取物20g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l，ph=6.2～6.4。
羅伊氏乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/l、蔗糖80g/l、酵母提取物40g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l，ph=6.2～6.4。
2.凍干菌劑的制備
待羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液溫度降至20℃左右時，離心收集菌泥，離心菌體管道注意降溫冷卻，離心結(jié)束后收得菌泥4kg，加入脫脂奶粉1.92kg，乳糖1.12kg，海藻糖0.8kg，抗結(jié)塊劑0.16kg作為凍干保護劑，用11l無菌水溶解混勻。然后將此混合物均勻鋪于托盤上，每個托盤裝1l，將托盤置于隔板上，在物料中放置溫度探頭，開始凍干。
冷凍干燥過程可分為三個階段，第一階段為預(yù)凍，將物料降溫至-40℃，維持冷卻4小時后開始抽真空；第二階段為升華，這是干燥的主要階段，打開真空泵，同時將物料溫度由-50℃升溫至-30℃，通過間隙開循環(huán)泵使物料升溫速度控制在每小時5℃，物料溫度維持在-25℃，維持時間為10小時；第三階段為終干燥，通過快速升溫，將物料溫度由-25℃升至20℃，升溫速度控制在每小時5℃，使物料中最后的結(jié)合水蒸發(fā)掉，維持時間為2h。凍干結(jié)束后，菌劑應(yīng)為餅狀，收集凍干菌體，過100目篩，粉碎后，收集菌粉重量為4.5kg，將菌粉置于-20℃冰箱保存。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為2×1011cfu/g。
實施例2植物乳桿菌凍干菌粉的制備
1.液體深層發(fā)酵培養(yǎng)
將植物乳桿菌甘油管保藏菌種以2%接種量接種至用250ml三角瓶裝著的150ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24h后，以3%的接種量接種至用1l三角瓶裝著的800ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)約7h后，以3%的接種量接種至200ml發(fā)酵罐中，內(nèi)裝160ml發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速80rpm，壓力0.05mpa，通風(fēng)量0l/h，發(fā)酵液初始ph值為5.8，發(fā)酵過程中ph值用氨水控制在5.8左右，帶發(fā)酵液od600值和ph值趨于穩(wěn)定后開始放罐，培養(yǎng)時間約10h，放罐時罐溫降至20℃左右，植物乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為1.26×1010cfu/ml。
本實施例中，植物乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g/l、牛肉浸膏10g/l、酵母提取物5g/l、葡萄糖20g/l、乙酸鈉5g/l、吐溫801ml/l、檸檬酸氫二銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、七水硫酸鎂0.6g/l、一水硫酸錳0.25g/l。
植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖40g/l、酵母浸膏50g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
2.凍干菌劑的制備
待植物乳桿菌發(fā)酵液溫度降至20℃左右時，離心收集菌泥，離心菌體管道注意降溫冷卻，離心結(jié)束后收得菌泥5kg，加入脫脂奶粉2.4kg，乳糖1.4kg，海藻糖1kg，抗結(jié)塊劑0.2kg作為凍干保護劑，用13.75l無菌水溶解混勻。然后將此混合物均勻鋪于托盤上，每個托盤裝1l，將托盤置于隔板上，在物料中放置溫度探頭，開始凍干。
冷凍干燥過程可分為三個階段，第一階段為預(yù)凍，將物料降溫至-40℃，維持冷卻4小時后開始抽真空；第二階段為升華，這是干燥的主要階段，打開真空泵，同時將物料溫度由-50℃升溫至-30℃，通過間隙開循環(huán)泵使物料升溫速度控制在每小時5℃，物料溫度維持在-25℃，維持時間為10小時；第三階段為終干燥，通過快速升溫，將物料溫度由-25℃升至20℃，升溫速度控制在每小時5℃，使物料中最后的結(jié)合水蒸發(fā)掉，維持時間為2h。凍干結(jié)束后，菌劑應(yīng)為餅狀，收集凍干菌體，過100目篩，粉碎后，收集菌粉重量為6.5kg左右，置于-20℃冰箱保存。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為4×1011cfu/g。
實施例3鼠李糖乳桿菌凍干菌粉的制備
1.液體深層發(fā)酵培養(yǎng)
將鼠李糖乳桿菌甘油管保藏菌種以2%接種量接種至用250ml三角瓶裝著的150ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24h后，以3%的接種量接種至用1l三角瓶裝著的800ml種子培養(yǎng)基中，于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)約7h后，以3%的接種量接種至200ml發(fā)酵罐中，內(nèi)裝160ml發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速80rpm，壓力0.05mpa，通風(fēng)量0l/h，發(fā)酵液初始ph值為5.8，發(fā)酵過程中ph值用氨水控制在5.8左右，帶發(fā)酵液od600值和ph值趨于穩(wěn)定后開始放罐，培養(yǎng)時間約10h，放罐時罐溫降至20℃左右，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為6×109cfu/ml。
本實施例中，鼠李糖乳桿菌的種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g/l、牛肉浸膏10g/l、酵母提取物5g/l、葡萄糖20g/l、乙酸鈉5g/l、吐溫801ml/l、檸檬酸氫二銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、七水硫酸鎂0.6g/l、一水硫酸錳0.25g/l。
鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖40g/l、蛋白胨40g/l、酵母浸膏10g/l、乙酸鈉5g/l、檸檬酸氫二銨2g/l、七水硫酸鎂0.58g/l、一水硫酸錳0.25g/l、吐溫-801ml/l。
2.凍干菌劑的制備
待植物乳桿菌發(fā)酵液溫度降至20℃左右時，離心收集菌泥，離心菌體管道注意降溫冷卻，離心結(jié)束后應(yīng)收得菌泥3kg，加入脫脂奶粉1.44kg，乳糖0.84kg，海藻糖0.6kg，抗結(jié)塊劑0.120kg作為凍干保護劑，用8.25l無菌水溶解混勻。然后將此混合物均勻鋪于托盤上，每個托盤裝1l，將托盤置于隔板上，在物料中放置溫度探頭，開始凍干。冷凍干燥過程可分為三個階段，第一階段為預(yù)凍，將物料降溫至-40℃，維持冷卻4小時后開始抽真空；第二階段為升華，這是干燥的主要階段，打開真空泵，同時將物料溫度由-50℃升溫至-30℃，通過間隙開循環(huán)泵使物料升溫速度控制在每小時5℃，物料溫度維持在-25℃，維持時間為10小時；第三階段為終干燥，通過快速升溫，將物料溫度由-25℃升至20℃，升溫速度控制在每小時5℃，使物料中最后的結(jié)合水蒸發(fā)掉，維持時間為2h。凍干結(jié)束后，凍干菌劑應(yīng)為餅狀，收集凍干菌粉，過100目篩，粉碎后，收集菌粉重量為3.75kg左右，置于-20℃冰箱保存。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為3×1011cfu/g。
實施例4一種乳酸菌復(fù)合菌劑
一種乳酸菌復(fù)合菌劑，所述乳酸菌復(fù)合菌劑由如下組分組成：
實施例1制備得到的羅伊氏乳桿菌凍干菌粉4kg、實施例2制備得到的植物乳桿菌凍干菌粉2kg、實施例3制備得到的鼠李糖乳桿菌凍干菌粉2kg。
將上述各菌粉混合即得所述乳酸菌復(fù)合菌劑。
對照例1羅伊氏乳桿菌凍干菌粉的制備
本對照例中的羅伊氏乳桿菌的種子培養(yǎng)基為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為8h。
發(fā)酵培養(yǎng)基為為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為16h，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為2×109cfu/ml。
本對照例中其它步驟均與實施例1相同。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為1.6×1011cfu/g，產(chǎn)量為1kg。
表1為實施例1及對照例1的產(chǎn)量表。
表1實施例1及對照例1的產(chǎn)量表
總產(chǎn)量（cfu）=菌粉活菌數(shù)（cfu/g）*產(chǎn)量（kg）
由表1可知，實施例1中乳酸菌的菌粉活菌總產(chǎn)量遠(yuǎn)大于對照例1中的菌粉活菌總產(chǎn)量，這表明本發(fā)明提供的羅伊氏乳桿菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基能夠在較短的時間內(nèi)制備出高產(chǎn)量的羅伊氏乳桿菌。
對照例2植物乳桿菌凍干菌粉的制備
本對照例中的植物乳桿菌的種子培養(yǎng)基為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為8h。
發(fā)酵培養(yǎng)基為為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為16h，植物乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為4×109cfu/ml。
本對照例中其它步驟均與實施例1相同。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為3.6×1011cfu/g，產(chǎn)量為2.3kg。
表2為實施例2及對照例2的產(chǎn)量表。
表2實施例2及對照例2的產(chǎn)量表
總產(chǎn)量（cfu）=菌粉活菌數(shù)（cfu/g）*產(chǎn)量（kg）
由上表2可知，實施例2中乳酸菌的菌粉活菌總產(chǎn)量遠(yuǎn)大于對照例2中的菌粉活菌總產(chǎn)量，這表明本發(fā)明提供的植物乳桿菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基能夠在較短的時間內(nèi)制備出高產(chǎn)量的植物乳桿菌。
對照例3鼠李糖乳桿菌凍干菌粉的制備
本對照例中的鼠李糖乳桿菌的種子培養(yǎng)基為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為8h。
發(fā)酵培養(yǎng)基為為常規(guī)的mrs培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，乙酸鈉5g/l，吐溫801ml/l，檸檬酸氫二銨2g/l，磷酸氫二鉀2g/l，七水硫酸鎂0.6g/l，一水硫酸錳0.25g/l，ph=6.2～6.4。發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為16h，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液放罐活菌數(shù)為3×109cfu/ml。
本對照例中其它步驟均與實施例3相同。
取凍干粉碎后的粉狀活菌制劑，按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)為2.5×1011cfu/g，產(chǎn)量為1.8kg。
表3為實施例3及對照例3的產(chǎn)量表。
表3實施例3及對照例3的產(chǎn)量表
總產(chǎn)量（cfu）=菌粉活菌數(shù)（cfu/g）*產(chǎn)量（kg）
由上表3可知，實施例3中鼠李糖乳桿菌的菌粉活菌總產(chǎn)量均遠(yuǎn)大于對照例3中的菌粉活菌總產(chǎn)量，這表明本發(fā)明提供的鼠李糖乳桿菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基能夠在較短的時間內(nèi)制備出高產(chǎn)量的鼠李糖乳桿菌。
應(yīng)用試驗例1乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌固體飲料中的應(yīng)用
一種乳酸菌固體飲料，所述固體飲料由如下質(zhì)量的組分組成：
實施例4制備得到的乳酸菌復(fù)合菌劑8kg、脫脂奶粉24kg、葡萄糖62.67kg、乳糖37.33kg、低聚果糖1.33kg。
將上述各原料用混料機混合均勻后即得乳酸菌固體飲料。
抽樣按企標(biāo)q/gzwsw0001s-2016《乳酸菌固體飲料》方法測定菌粉活菌數(shù)，測定用此方法生產(chǎn)的乳酸菌固體飲料成品活菌數(shù)為2×1010cfu/g，水分含量為2.67%。
對上述乳酸菌固體飲料的性能進行測試，測試方法為：選取青少年中年老年人共30人，每天晚飯后，用37℃溫開水沖服一袋上述乳酸菌固體飲料，1g/袋，活菌數(shù)為2×1010cfu/g，乳酸菌固體飲料不得與抗生素同時服用，試驗期6個月。
試驗結(jié)果如下：有25人表明服用1周后，食欲明顯增加，30人均狀態(tài)良好，胃腸道未有不適癥狀；24人表明身體狀況良好，服用期間未有腹瀉發(fā)生，與之前相比，腹瀉率顯著下降；6人表明，感冒服用抗生素后，停藥，再服用乳酸菌固體飲料，沒有腹瀉及食欲不振情況發(fā)生，身體狀況良好。這表明本試驗例制備得到的乳酸菌固體飲料可調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡，改善腸道環(huán)境，提高人體免疫性能，降低腹瀉發(fā)生，增強人體健康。
應(yīng)用試驗例2乳酸菌復(fù)合菌劑在乳酸菌飼料添加劑中的應(yīng)用
一種乳酸菌飼料添加劑，所述乳酸菌飼料添加劑由如下質(zhì)量的組分組成：
實施例4制備得到的乳酸菌復(fù)合菌劑8kg、玉米淀粉8kg、麥芽糊精4kg、碳酸鈣2kg。
將上述各原料用混料機混合均勻后即得乳酸菌飼料添加劑。
抽樣按國標(biāo)gb4789.35-2010方法測定乳酸菌飼料添加劑成品活菌數(shù)，用此方法生產(chǎn)的菌粉活菌數(shù)應(yīng)為1.3×1011cfu/g，水分含量為2.43%。
對上述乳酸菌復(fù)合菌劑的性能進行測試，測試方法為：隨機選取60頭30日齡斷奶仔豬，大白×大長×杜絡(luò)克三元雜交豬，平均重約10kg，從中挑選20頭體型外貌較差的作為弱仔組，其它40頭隨機分為兩組，分別為對照組和實驗組，其中對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實驗組飼喂含0.01%的實施例5所述羅伊氏乳桿菌飼料添加劑的基礎(chǔ)日糧，弱仔組飼喂含0.02%的羅伊氏乳桿菌飼料添加劑的基礎(chǔ)日糧，對照組和實驗組隨機分欄，每欄10頭，弱仔組單欄飼養(yǎng)，試驗期30天，試驗開始前，對豬舍進行徹底清潔消毒，仔豬自由采食飲水，按豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理方式進行。
測定指標(biāo)包括日增重、料肉比、腹瀉率，測試結(jié)果見下表4。
表4羅伊氏乳桿菌飼料添加劑對斷奶仔豬生長性能的影響
注：*代表與對照組相比差異顯著，**代表與對照組相比差異極顯著。
由上表4可知，在飼料中不添加抗生素的前提下，本應(yīng)用試驗例所制備的乳酸菌復(fù)合菌劑可提高斷奶仔豬的成活率，改善豬只腸道健康，降低料肉比和殘次發(fā)生率、減少仔豬腹瀉，并且與對照組差異顯著。