本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：靈芝是中國名貴中藥材，靈芝在我國已有2000多年的藥用歷史，被歷代醫(yī)藥家視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的神奇珍品，經(jīng)過大量臨床研究，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝解毒、防止心血管系統(tǒng)疾病、抗衰老、抗神經(jīng)衰弱、降血糖血壓和抗過敏等功效。2015版《中國藥典》收錄靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體(國家藥典委員會(huì)，2015)。關(guān)于中國目前廣泛藥用的赤芝，其拉丁學(xué)名一直存在爭議。藥典里用的名稱最早是1907年法國真菌學(xué)家在我國貴州采集得靈芝標(biāo)本后鑒定命名的，沿用迄今。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，我國藥用的赤芝和靈芝模式種存在差異，已于2012年被吳聲華等分類學(xué)家定名為g.lingzhi。目前，在民間常做藥用的芝類除了藥典里的赤芝、紫芝外，還有松杉靈芝、四川靈芝、樹舌靈芝、血芝(假芝屬內(nèi)多個(gè)種的商品名統(tǒng)稱，因新鮮子實(shí)體創(chuàng)傷會(huì)有血樣分泌物流出而得名)等。白肉靈芝是新發(fā)現(xiàn)的靈芝屬中國特有種，是廣東省微生物研究所助理研究員胡慧萍等人于2011年在調(diào)查西藏林芝地區(qū)的野生食藥用菌資源時(shí)，采集到的生長在青岡樹上的野生靈芝。通常夏秋季散生至群生于青岡樹腐木上，靠近樹干基部，分布于西藏與四川等西南地區(qū)，可藥用，目前藥材市場上與靈芝混淆使用。但是近幾年，西藏林芝地區(qū)在白肉靈芝栽培過程中備受菌種混淆、串種及交叉感染之苦，白肉靈芝菌種相對(duì)較弱，從母種到原種再到栽培種的栽培全程均有可能受到其他菌種的侵襲而成批被取代，在菌絲體階段肉眼是完全無法辨別的，等到出芝觀察菌肉才發(fā)現(xiàn)種瓜得豆，為時(shí)已晚。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種鑒定白肉靈芝的有效方法，為白肉靈芝的大規(guī)模生產(chǎn)提供保障，本發(fā)明提供了一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對(duì)及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列名稱序列(5’-3’)seqidno.p1-fgcagatctgcgaagcgtgct1p1-rgcagaggagccgaccgacag2p2-fgttcagtttccgtgcca3p2-rcgtcttccgacaggtta4p3-fgtcccacgactgttgaaatacg5p3-rgtgttgtgagcttcgaccat6發(fā)卡結(jié)構(gòu)cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對(duì)在制備鑒定白肉靈芝試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100～1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。有益效果：(1)本發(fā)明所述引物對(duì)的特異性良好，僅能擴(kuò)增出白肉靈芝的特異性條帶；(2)本發(fā)明所述引物對(duì)靈敏度高，能夠快速準(zhǔn)確鑒定白肉靈芝。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定白肉靈芝試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。實(shí)施例2一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定白肉靈芝試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋600倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。實(shí)施例3一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)，所述引物對(duì)及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對(duì)p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對(duì)在制備鑒定白肉靈芝試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對(duì)、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定白肉靈芝的步驟包括：(1)提取白肉靈芝樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述白肉靈芝樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。如圖1所示，將實(shí)施例1～3的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，條帶清晰可見，產(chǎn)物單一。sequencelisting<110>蘇州市李良濟(jì)健康產(chǎn)業(yè)有限公司<120>一種用于鑒定白肉靈芝的引物對(duì)及其應(yīng)用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcagatctgcgaagcgtgct20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gcagaggagccgaccgacag20<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3gttcagtttccgtgcca17<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4cgtcttccgacaggtta17<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gtcccacgactgttgaaatacg22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gtgttgtgagcttcgaccat20<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當(dāng)前第1頁12