一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了引物組，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ、所述DNA片段-Ⅱ、所述DNA片段-Ⅲ和所述DNA片段-Ⅳ均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示。本發(fā)明提供的引物組基于LAMP法，檢測時間短（在恒溫條件下1個小時內(nèi)就可完成檢測）、實驗條件簡單、可通過多種方式進(jìn)行結(jié)果評判（肉眼觀察濁度、顏色反應(yīng)）、檢測特異性強、靈敏性度高，非常適合出入境檢驗檢疫口岸及現(xiàn)場檢測。
【專利說明】—種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]馬鈴薯帚頂病毒(Potato mop-top virus, PMTV)為屬于帚狀病毒科(Virgaviridae)馬鈴薯帚頂病毒屬(Pomovirus)的RNA病毒,是我國進(jìn)境檢疫性有害生物，主要分布在愛爾蘭、丹麥、芬蘭、挪威、荷蘭、英國、捷克、日本、美國和加拿大等國家。馬鈴薯帚頂病毒嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，受侵染的馬鈴薯塊莖產(chǎn)生環(huán)狀或弧狀壞死，由病薯長成的馬鈴薯植株會表現(xiàn)出帚頂、奧古巴花葉和褪綠V型紋等癥狀。
[0003]馬鈴薯帚頂病毒可隨病薯塊或組培苗通過運輸遠(yuǎn)距離傳播，在田間可以通過土壤中的馬鈴薯粉痂菌Spongospora subterranea、汁液摩擦接種等途徑傳播。該病毒的傳播介體-馬鈴薯粉痂菌在我國內(nèi)蒙古、廣東、貴州、江西、浙江、云南、甘肅等地均有報道。由于PMTV可以在馬鈴薯粉痂菌的休眠孢子中保持很長時間的侵染力，同時缺少有效的抗PMTV馬鈴薯品種，PMTV很難被控制。近年來，我國多次從馬鈴薯起源中心地區(qū)(如秘魯、智利等)引進(jìn)馬鈴薯品種資源，也從荷蘭、英國、美國等馬鈴薯產(chǎn)業(yè)強國引進(jìn)種薯、組培苗，加大了PMTV的傳播風(fēng)險，若其一旦傳入國內(nèi)，將會給我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，必須引起重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明首先提供了引物組A，包括DNA片段-1、DNA片段-11、DNA片段-1II和DNA片段-1V ;所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示。
[0006]所述引物組A可由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V組成。
[0007]所述引物組A還可包括DNA片段-V ;所述DNA片段-V為單鏈DNA片段，如序列表的序列5所示。
[0008]所述引物組A可由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V組成。
[0009]本發(fā)明還提供了引物組B，包括DNA片段-V1、DNA片段-vn、DNA片段-VDI和DNA片段-1X ;所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-VDI和所述DNA片段-1X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示。[0010]所述引物組B還可包括DNA片段-X ;所述DNA片段-X為單鏈DNA片段，如序列表的序列5的反向互補序列所示。
[0011]所述引物組B可由所述DNA片段-V1、所述DNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X組成。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B在輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒的方法，依次包括如下步驟:
[0014](1)以待測病毒的RNA為模板，用所述引物組A或所述引物組B進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)；
[0015](2)通過檢測步驟(1)的產(chǎn)物輔助鑒定待測病毒是否為馬鈴薯帚頂病毒。
[0016]可采用實時濁度儀進(jìn)行所述步驟(2)的檢測，如果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。
[0017]可通過目測進(jìn)行所述步驟(2)的檢測，如果出現(xiàn)白色混濁物、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現(xiàn)白色混濁物、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0018]RT-LAMP反應(yīng)體系中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖蠒r，可通過自然光或紫外燈下觀察進(jìn)行所述步驟(2)的檢測 。自然光下，如果體系顯示為綠色、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果體系顯示為橙黃色、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。紫外光下，如果體系顯示熒光、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果體系不顯示熒光、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0019]可通過電泳進(jìn)行所述步驟(2)的檢測，如果出現(xiàn)階梯狀條帶、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現(xiàn)階梯狀條帶、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0020]所述待測病毒為馬鈴薯帚頂病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯V病毒或甜菜土傳病毒。
[0021]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B ;所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
[0023]本發(fā)明提供的弓丨物組基于LAMP法，檢測時間短(在恒溫條件下I個小時內(nèi)就可完成檢測)、實驗條件簡單、可通過多種方式進(jìn)行結(jié)果評判(肉眼觀察濁度、顏色反應(yīng)等)、檢測特異性強、靈敏性度高，非常適合出入境檢驗檢疫口岸及現(xiàn)場檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為實施例3的步驟一的結(jié)果。
[0025]圖2為實施例3的步驟二的結(jié)果。
[0026]圖3為實施例4的結(jié)果。[0027]圖4為實施例5的結(jié)果。
[0028]圖5為實施例6的步驟一的結(jié)果。
[0029]圖6為實施例6的步驟二的結(jié)果。
[0030]圖7為實施例7的步驟一的結(jié)果。
[0031]圖8為實施例7的步驟二的結(jié)果。
[0032]圖9為實施例7的步驟三的結(jié)果。
[0033]圖10為實施例7的步驟四的結(jié)果。
[0034]圖11為實施例7的步驟五的結(jié)果。
【具體實施方式】[0035]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0036]馬鈴暮帝頂病毒(Potato mop-top virus, PMTV):RNA病毒，參考文獻(xiàn):SatuLatvala-Kilbyj Johanna M.Aura, NedaPupolaj et al.Detection of Potato mop-topvirus in Potato Tubers and Sprouts: Combinations of RNA2and RNA3Variants andIncidence of Symptomless Infections.The American Phytopathological Society,2009，99(5):519-531)0
[0037]馬鈴墓Y 病毒(Potato virus Y，PVY):RNA 病毒；參考文獻(xiàn):Bushra Tabassum，Idrees Ahmad Nasir，Tayyab Husnain.Potato Virus Y mRNA Expression KnockdownMediated by siRNAs in Cultured Mammalian Cell Line.Virologica Sinica，2011,26(2):105-113o
[0038]馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX):RNA病毒；參考文獻(xiàn):姚東校,洪鮑,楊立昌等.馬鈴薯X病毒貴州分離物的分子鑒定.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，(13):139-141.。
[0039]馬鈴薯A病毒(Potato virus A, PVA):RNA病毒；參考文獻(xiàn):劉洪義，張永江，劉忠梅，馬鈴薯A病毒液相芯片快速檢測方法的建立.中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29 (15): 37-41。
[0040]馬鈴薯V 病毒(Potato virus V, PVV):RNA 病毒；參考文獻(xiàn):FatemehShamsadden — Saeed，Hossain Massumi, Sakineh Morad1.1ncidence andcharacterization of Potato virus V infections in Iran.1ndian Journal ofVirology, 2014，25(I):78-84。
[0041]甜菜土傳病毒(Beetsoil-borne virus，BSBV):RNA 病毒；參考文獻(xiàn):R.Koenig，C.W.A.Plei j, G.Biittner.Structure and variability of the3/ end of RNA3of Beetsoil-borne pomovirus - a virus with uncertain pathogenic effects.Archives ofVirology.2000，145(6):1173_1181。
[0042]Loopamp RNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒:日本Eiken Chemical公司，貨號為LMP244。
[0043]Loopamp DNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒:日本Eiken Chemical公司，貨號為LMP204。
[0044]實施例中所用的實時濁度儀均為日本Eiken Chemical公司的LA-320C實時濁度儀。[0045]實施例1、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒
[0046]1、提取馬鈴薯帚頂病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0047]2、以步驟I得到的cDNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【權(quán)利要求】
1.引物組A，包括DNA片段-1、DNA片段-11、DNA片段-1II和DNA片段-1V;所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V組成。
3.如權(quán)利要求1所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A還包括DNA片段-V;所述DNA片段-V為單鏈DNA片段，如序列表的序列5所示。
4.如權(quán)利要求3所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V組成。
5.引物組B，包括DNA片段-VKDNA片段-VIKDNA片段-VDI和DNA片段-1X;所述DNA片段-V1、DNA片段-νπ、所述DNA片段-VDI和所述DNA片段-1X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示。
6.如權(quán)利要求5所述的引物組B，其特征在于:所述引物組B還包括DNA片段-X;所述DNA片段-X為單鏈DNA片段，如序列表的序列5的反向互補序列所示。
7.權(quán)利要求1至6中任一所述的引物組在輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應(yīng)用。
8.一種輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒的方法，依次包括如下步驟: (1)以待測病毒的RNA為模板，用權(quán)利要求1至6中任一所述的引物組進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)； (2)通過檢測步驟(1)的產(chǎn)物輔助鑒定待測病毒是否為馬鈴薯帚頂病毒。
9.權(quán)利要求1至6中任一所述的引物組在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): Ca)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
10.一種試劑盒，包括權(quán)利要求1至6中任一所述的引物組；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
【文檔編號】C12Q1/70GK103834644SQ201410076470
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】趙竹, 丁小蘭, 李明福, 張永江, 許瑾, 宋云, 何增磊 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院