本發(fā)明涉及zeb2基因在制備胰腺癌診斷和/或預(yù)后試劑盒中的用途以及zeb2阻斷劑在制備治療胰腺癌藥物中的用途，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。5年生存率<1％，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術(shù)死亡率較高，而治愈率很低。本病發(fā)病率男性高于女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠(yuǎn)較絕經(jīng)前的婦女多見(jiàn)，絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率與男性相仿。胰腺癌因其惡性程度高，早期診斷困難，預(yù)后差成為腫瘤病學(xué)的一大挑戰(zhàn)。盡管目前臨床上將小于2cm的胰腺癌視為早期癌，但此時(shí)約有30％～40％的患者已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，僅根據(jù)腫瘤大小對(duì)胰腺癌分期有其局限性。關(guān)于胰腺癌的高危因素與胰腺癌發(fā)病間的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，但對(duì)這些人群宜定期b超檢查。出現(xiàn)胰腺癌的警報(bào)癥狀，如消瘦、腹瀉、消化不良等應(yīng)高度疑診胰腺癌。

目前常規(guī)的胰腺癌診斷方法包括影像學(xué)診斷，比如b超、ct等。腫瘤標(biāo)志物反映了癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及基因激活程度，可在腫瘤宿主的組織、體液及排泄物中檢出。有多種胰腺癌腫瘤標(biāo)志物已用于臨床，但其敏感性、特異性尚不理想。常見(jiàn)的標(biāo)志物癌胚抗原(cea)：在胰腺癌患者血清中有較高的表達(dá)率，但其特異性低，其增高也見(jiàn)于肝、結(jié)直腸、胃、膽囊癌及非消化道癌。因而限制了其應(yīng)用價(jià)值。另外一個(gè)標(biāo)志物ca19-9：是目前公認(rèn)的胰腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，常作為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物來(lái)判斷其他腫瘤標(biāo)志物對(duì)胰腺癌診斷的實(shí)用價(jià)值，目前巳廣泛用于臨床。ca19-9診斷胰腺癌的敏感性為69％～93％，特異性為81％～85％。對(duì)高?；颊呖捎胏a19-9作為篩選檢查，其結(jié)果優(yōu)于cea。除膽管癌外，與其他消化道惡性腫瘤均有良好的鑒別診斷意義，而且對(duì)早期胰腺癌的診斷亦有一定價(jià)值，但是診斷效果還有改進(jìn)的空間。

zeb2基因在現(xiàn)有技術(shù)中分別與其它的小分子一起在乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌和鼻咽癌中均有一定的指示作用，但是在胰腺癌中還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。特別是在胰腺癌化療預(yù)后診斷中的應(yīng)用還沒(méi)有涉及。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

zeb2基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物用途，基于zeb2基因表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)胰腺癌患者的預(yù)后，zeb2表達(dá)水平低的患者預(yù)后好，表達(dá)水平高的患者預(yù)后差。

基于zeb2基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的檢測(cè)及應(yīng)用方法，a.提取腫瘤患者原發(fā)癌組織標(biāo)本的細(xì)胞總rna；以rna為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cdna；以cdna為模板，用zeb2基因和管家基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增，計(jì)算zeb2基因mrna的相對(duì)表達(dá)量；b.根據(jù)胰腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的zeb2mrna表達(dá)量，確定預(yù)后判斷的臨界值。

zeb2mrna表達(dá)量低于臨界值的患者預(yù)后好，而高于臨界值的患者預(yù)后差。

所述的檢測(cè)方法，以原發(fā)癌組織中zeb2mrna表達(dá)量對(duì)腫瘤患者預(yù)后判斷，表達(dá)量低的患者則判斷為預(yù)后好，表達(dá)量低高的則判斷為預(yù)后差。

本發(fā)明通過(guò)研宄證實(shí)zeb2可應(yīng)用于診斷胰腺癌治療效果的指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后；zeb2可作為胰腺癌治療新藥和生物免疫治療的新靶點(diǎn)。阻斷zeb2表達(dá)可抑制胰腺腫瘤生長(zhǎng)，抑制胰腺腫瘤細(xì)胞，可作為胰腺癌治療新藥和生物免疫治療的新靶點(diǎn)。

另外，本發(fā)明提供一種特異性抑制zeb2基因表達(dá)的sirna，其序列如seqidno：1和2所示。

另外，本發(fā)明提供一種基因干擾慢病毒載體，為將編碼特異性抑制zeb2基因表達(dá)的干擾小分子rna的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人zeb2基因小分子干擾rna。

所述慢病毒載體可以選自：plko.1-puro、plko.1-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tgfp、plko.1-cmv-neo、plko.1-neo、plko.1-neo-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tagcfp、plko.1-puro-cmv-tagyfp、plko.1-puro-cmv-tagrfp、plko.1-puro-cmv-tagfp635、plko.1-puro-ubc-turbogfp、plko.1-puro-ubc-tagfp635、plko-puro-iptg-1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。

本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)zeb2基因的表達(dá)情況針對(duì)胰腺癌治療患者進(jìn)行預(yù)后，具有較好的預(yù)測(cè)效果，為后期進(jìn)一步的治療提供初步的指導(dǎo)。同時(shí)本發(fā)明提供了一種阻斷zeb2基因表達(dá)的sirna，具有較好的抑制zeb2基因表達(dá)的效果。本發(fā)明具有較好的抑制效果以及應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為qrt-pcr對(duì)比正常胰腺組織，胰腺炎，胰腺腫瘤組織和胰腺腫瘤干細(xì)胞中zeb2的表達(dá)水平變化對(duì)比圖。

圖2為胰腺癌病人的zeb2表達(dá)水平及預(yù)后關(guān)系圖。

圖3為sirna干擾zeb2基因表達(dá)效果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1檢測(cè)zeb2在胰腺癌細(xì)胞，胰腺肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞和正常胰腺細(xì)胞中表達(dá)水平

臨床標(biāo)本入選標(biāo)準(zhǔn)：接受外科手術(shù)切除病例，術(shù)后病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌；穿刺活檢術(shù)獲得完整組織學(xué)標(biāo)本，病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。參與本研宄的患者手術(shù)或活檢前均未接受化、放療以及免疫治療，患者簽署了知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)審核。

方法：獲取術(shù)后和活檢正常胰腺組織，胰腺腫瘤組織。抽提rna后進(jìn)行qrt-pcr，qrt-pcr操作步驟為本領(lǐng)域常規(guī)的操作方法，所需的引物分別為：zeb2上游引物：5’-agccaaggaatgctaccaa-3’、下游引物：5’-ggccccagagcatcataatc-3’；β-actin上游引物：5’-cagctgagagggaaatcgtg-3’、下游引物：5’-cgttgccaatagtgatgacc-3’。

zeb2上游引物：5’-caagaggcgcaaacaagcc-3’

下游引物：5’-ggttggcaataccgtcatcc-3’

β-actin上游引物：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’、

下游引物：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’。

qrt-pcr對(duì)比正常胰腺組織、胰腺腫瘤組織和胰腺肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中zeb2的表達(dá)水平變化。

結(jié)果：如圖1所示，定量pcr數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)zeb2的表達(dá)水平在正常胰腺組織中較低，相對(duì)正常組織，胰腺癌組織中升高接近9倍，在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移組織中升高近9.5倍。定量pcr每組分析8例標(biāo)本，β-actin作為內(nèi)參指示檢測(cè)準(zhǔn)確，符合要求。

免疫組織化學(xué)染色采用美國(guó)dako公司envision^tm二步法檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)zeb2蛋白表達(dá)。根據(jù)本領(lǐng)域常用的irs進(jìn)行標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞百分率統(tǒng)計(jì)。應(yīng)用irs可兼顧染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

如表1所示，免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織只有2.9％為zeb2陽(yáng)性，胰腺癌組織為86.9％，胰腺癌肺轉(zhuǎn)移組織為90.5％(表1)。免疫組化檢查每組為10例標(biāo)本。

從以上結(jié)果可以看出，zeb2定量pcr和免疫組化檢查可用來(lái)診斷胰腺癌。

實(shí)施例2檢測(cè)zeb2在胰腺腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性水平和預(yù)后的關(guān)系

選擇具有完整隨訪記錄30例胰腺癌病人，獲取病理切片進(jìn)行zeb2免疫組化檢查，免疫組化操作步驟如上。所選患者均術(shù)后只進(jìn)行常規(guī)吉西他濱化療，無(wú)其他治療記錄。30例胰腺癌病人的zeb2免疫組化檢查分為三組(強(qiáng)陽(yáng)性為3.5，陽(yáng)性為2.5，弱陽(yáng)性為1.5)，每組10例，進(jìn)行預(yù)后跟蹤，跟蹤病人的生存時(shí)間。

結(jié)果：如圖2所示，預(yù)后跟蹤數(shù)據(jù)表明胰腺腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性水平和預(yù)后生存期呈反比關(guān)系，強(qiáng)陽(yáng)性患者預(yù)后差，生存期短，而弱陽(yáng)性患者預(yù)后較好，生存期較長(zhǎng)。結(jié)論，zeb2免疫組化檢查水平可用來(lái)預(yù)測(cè)預(yù)后，并可作為預(yù)測(cè)治療效果的指標(biāo)。

實(shí)施例3zeb2干擾對(duì)于腫瘤的影響

1、人zeb2基因rnai慢病毒的制備

(1).篩選針對(duì)人zeb2基因的有效的sirna靶點(diǎn)

從genbank調(diào)取人zeb2(bc127102)基因信息；利用dnaman設(shè)計(jì)針對(duì)zeb2基因的有效的sirna靶點(diǎn)。在zeb2基因的編碼序列(cds)區(qū)域內(nèi)，設(shè)計(jì)了2條針對(duì)zeb2基因的有效sirna靶點(diǎn)序列。分別為：zeb2-1：cccagaagcccctgaggagctg；zeb2-2：tactgcaagcgggaggcggagg。

針對(duì)sirna靶點(diǎn)合成兩端含agei和ecori酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈dnaoligo序列；以agei和ecori限制性內(nèi)切酶作用于pgcsil-gfp載體，使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段。并構(gòu)建含有zeb2-1或zeb2-2的rnai載體，命名為pgcsil-gfp-zeb2-1-shrna以及pgcsil-gfp-zeb2-2-shrna，同時(shí)還按照本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)方法構(gòu)建pgcsil-gfp-control陰性對(duì)照質(zhì)粒。同時(shí)將所述載體導(dǎo)入到慢病毒中備用。

2、實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr法檢測(cè)zeb2基因的沉默效率

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌panc-1細(xì)胞和正常人口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為6.0×104/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約40％。根據(jù)侵染復(fù)數(shù)(panc-1的moi為20)值，加入適宜量的的病毒，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基，待侵染時(shí)間達(dá)到5天后，收集細(xì)胞。根據(jù)invitrogen公司的trizol操作說(shuō)明書(shū)，抽提總rna。根據(jù)promega公司的m-mlv操作說(shuō)明書(shū)，將rna逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見(jiàn)表7，42℃反應(yīng)1h，然后在70℃水浴鍋中水浴10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活)。

采用abi7500型realtimepcr儀(life)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)?；虻囊锶缟鲜鰧?shí)施例所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，實(shí)驗(yàn)組中人胰腺癌panc-1細(xì)胞的zeb2mrna表達(dá)水平分別下降了99.3％和99.5％，具有較好的抑制表達(dá)效果。

3、檢測(cè)侵染zeb2-shrna慢病毒的腫瘤細(xì)胞的增殖能力

將上述實(shí)驗(yàn)2制備的細(xì)胞，待侵染時(shí)間達(dá)到5天后，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液(2×104/ml)，以細(xì)胞密度約為2000個(gè)/孔，接種96孔板。每組5個(gè)復(fù)孔，每孔100μl。鋪好板后，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第二天開(kāi)始，每天用cellomics儀器(thermofisher)檢測(cè)讀板一次，連續(xù)檢測(cè)讀板5天。通過(guò)調(diào)整cellomicsarrayscan的輸入?yún)?shù)，準(zhǔn)確地計(jì)算出每次掃描孔板中的帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪出細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果表明，二個(gè)zeb2shrna慢病毒侵染的人胰腺癌panc-1細(xì)胞在體外培養(yǎng)5天后，活力細(xì)胞數(shù)目分別下降了88.9％和86.4％，表明zeb2基因沉默導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖能力被抑制。

上面通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，本發(fā)明并不限于此處所列出的實(shí)施例，其保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，下面的實(shí)施例僅僅是以示例的方式說(shuō)明本發(fā)明，以使本發(fā)明更易于理解。

序列表

〈110〉申請(qǐng)人

〈120〉z(mì)eb2基因表達(dá)變異在胰腺癌化療預(yù)后診斷中的應(yīng)用

〈210〉1

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉z(mì)eb2-1sirna

cccagaagcccctgaggagctg

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉z(mì)eb2-2sirna

tactgcaagcgggaggcggagg

〈210〉3

〈211〉19

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉z(mì)eb2上游引物

5’-agccaaggaatgctaccaa-3’

〈210〉4

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉z(mì)eb2下游引物

5’-ggccccagagcatcataatc-3’

〈210〉5

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin上游引物

5’-cagctgagagggaaatcgtg-3’

〈210〉6

〈211〉20

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉β-actin下游引物

5’-cgttgccaatagtgatgacc-3’。