本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種毒死蜱抗原及其制備方法。

背景技術(shù)：

毒死蜱[chlorpyrifos，o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名為毒死蜱、樂斯本、白蟻清等，毒死蜱原藥為白色顆粒狀晶體，室溫下穩(wěn)定，有硫醇?xì)馕?，比?.398(43.5℃)，熔點(diǎn)41.5～43.5℃，在水中的溶解度為1.2×10^-5g/kg，溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。通過觸殺、胃毒和熏蒸三種作用方式防治糧食、果樹、蔬菜和其他經(jīng)濟(jì)作物的害蟲，經(jīng)過皮膚、呼吸道以及腸胃吸收等途徑進(jìn)入人體后，可與膽堿酯酶迅速結(jié)合，形成磷?；憠A酯酶，使其失去催化水解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致大量的乙酰膽堿在體內(nèi)蓄積，并抑制僅有的乙酰膽堿酯酶活力，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)及膽堿能神經(jīng)過度興奮而出現(xiàn)中毒癥狀，長期作用人體還可引起致畸、致癌、致突變危害。

毒死蜱目前廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，作為一種廣譜型有機(jī)磷酸酯類殺蟲劑，是甲胺磷和甲基對硫磷等高毒農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種之一，也是安全農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留監(jiān)控的重要品種；而且，環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)毒死蜱殘留的情況也日趨嚴(yán)重，對人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。農(nóng)藥殘留對食品安全造成了嚴(yán)重威脅，農(nóng)藥殘留量的快速檢測技術(shù)受到人們越來越廣泛的關(guān)注。

目前國內(nèi)檢測農(nóng)殘的方法多為氣相色譜和液相色譜法，這些方法不僅需要昂貴的儀器，而且樣品預(yù)處理繁瑣，不能滿足現(xiàn)場快速測定農(nóng)殘的需要。因此，研究一種農(nóng)藥殘留的快速測定方法具有重要的意義。免疫分析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的檢測農(nóng)殘新方法，具有簡便、快速、靈敏和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其中，酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)enzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa)，是將免疫技術(shù)與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的測定方法，具有成本低、速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單的特點(diǎn)，適合大批量樣品的快速分析。而免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)是相應(yīng)的高特異性、高親和力的抗體的制備，而毒死蜱作為小分子化合物，本身不具備免疫原性，因此，其半抗原的結(jié)構(gòu)改造和全抗原合成是建立免疫速測技術(shù)的關(guān)鍵和難點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種毒死蜱抗原及其制備方法，本發(fā)明所提供的毒死蜱抗原的合成方法簡單，純度高、產(chǎn)量高，對于毒死蜱抗體的制備以及毒死蜱農(nóng)藥殘留檢測具有重要價(jià)值。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種毒死蜱半抗原，所述毒死蜱半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：

第二方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述的毒死蜱半抗原的制備方法，其包括如下步驟：

將毒死蜱與巰基丙酸按照1:(2～2.5)的摩爾比反應(yīng)，得到所述毒死蜱半抗原。

本發(fā)明中所述毒死蜱半抗原的反應(yīng)路線如下所示：

本發(fā)明中，所述毒死蜱與巰基丙酸的摩爾比為1:(2～2.5)，例如1:2、1:2.05、1:2.1、1:2.15、1:2.2、1:2.25、1:2.3、1:2.35、1:2.4、1:2.45或1:2.5。

優(yōu)選地，所述毒死蜱與巰基丙酸的反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為含有naoh的乙醇溶液。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的時(shí)間為2～4h，例如2h、2.2h、2.5h、3h、3.2h、3.5h或4h。

優(yōu)選地，所述毒死蜱半抗原的制備方法可以具體包括如下步驟：

(1)向毒死蜱的乙醇溶液中邊攪拌邊加入naoh，再加入巰基丙酸的乙醇溶液，毒死蜱與巰基丙酸的摩爾比為1:(2～2.5)，回流反應(yīng)2～4h；

(2)反應(yīng)完全后，抽濾出固體，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，殘余物中加入5％的nahco3溶液，用正己烷萃取，棄去有機(jī)相，水相用鹽酸調(diào)ph值至3～4，再用二氯甲烷萃取三次，有機(jī)相用無水naso4干燥過夜后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，過硅膠柱純化，得到所述毒死蜱半抗原。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種毒死蜱抗原，所述毒死蜱抗原由第一方面所述的毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。

優(yōu)選地，所述毒死蜱半抗原與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯(lián)。

優(yōu)選地，所述毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯(lián)的摩爾比為(25～30):1，例如25:1、25.5:1、26:1、26.5:1、27:1、27.5:1、28:1、28.5:1、29:1、29.5:1或30:1，優(yōu)選為30:1。

優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(bsa)。

優(yōu)選地，所述毒死蜱抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示：

第四方面，本發(fā)明還提供了如第三方面所述的毒死蜱抗原的制備方法，其包括以下步驟：

將所述毒死蜱半抗原、載體蛋白、三正丁胺和氯甲酸異丁酯在硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，得到所述毒死蜱抗原。

優(yōu)選地，所述載體蛋白、毒死蜱半抗原、三正丁胺、氯甲酸異丁酯和硼酸鹽緩沖液的配比為：100mg:0.09mol:23μl:11μl:5ml。

優(yōu)選地，所述硼酸鹽緩沖液的ph值為8.5，其濃度為0.1mol/l。

與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

本發(fā)明所提供的毒死蜱抗原的合成方法簡單，一步反應(yīng)即可完成制備，并且制得的毒死蜱抗原純度高，產(chǎn)量高，其對于毒死蜱抗體的制備以及毒死蜱農(nóng)藥殘留檢測具有重要價(jià)值。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制備得到的毒死蜱半抗原的esi圖譜；

圖2是實(shí)施例1制備得到的毒死蜱半抗原與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯(lián)后的紫外掃描圖。

下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下：

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等。如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所使用的ph值為8.5、濃度為0.1mol/l硼酸鹽緩沖液的配方如下：稱2.84g硼酸、5.15g硼砂，用蒸餾水定容至1l。

下述實(shí)施例中所使用的ph值為7.4、濃度為0.01m磷酸鹽緩沖液配方如下：稱7.9gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4和1.8gk2hpo4，溶于800ml蒸餾水中，用hcl調(diào)節(jié)溶液的ph值至7.4，最后加蒸餾水定容至1l。

實(shí)施例1毒死蜱半抗原的制備

毒死蜱半抗原的合成過程如下：

毒死蜱半抗原的合成方法，包括以下步驟：

在100ml反應(yīng)瓶中，稱取1.75g(5mmol)毒死蜱溶于25ml乙醇，稱取0.53g(5mmol)巰基丙酸溶于25ml乙醇，滴加到毒死蜱溶液中，并加入0.71gnaoh，回流反應(yīng)3h，tlc監(jiān)測反應(yīng)過程。反應(yīng)完成后，抽濾出白色固體，濾液旋干溶劑后，加入25ml5％nahco3溶解，用2*50ml正己烷萃取，收集水相。水相用6mhcl調(diào)ph值至2～3，再用二氯甲烷3*50ml萃取，收集有機(jī)相，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜。抽濾出固體，旋干有機(jī)相，過硅膠柱。洗脫液為正己烷:乙酸乙酯＝8:1，收集產(chǎn)品部分，旋干收集液，得到的產(chǎn)品即為毒死蜱半抗原，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(i)所示。

圖1是本實(shí)施例制備得到的毒死蜱半抗原的esi圖譜，該合成產(chǎn)物的esi分子離子峰為442.1(m+23)，402.3為去掉羥基后的離子峰，由此可以看出毒死蜱半抗原已被成功合成。

實(shí)施例2毒死蜱人工抗原的制備

1、毒死蜱人工抗原的制備

取30mg由實(shí)施例1制備的毒死蜱半抗原30mg(0.071mmol)，溶于1.5mldmf中，4℃攪拌下加入18μl三正丁胺，反應(yīng)30min后，加入9μl氯甲酸異丁酯，室溫反應(yīng)1h，反應(yīng)完畢后成為a液；稱取bsa79mg，溶于硼酸鹽緩沖液中，稱為b液；將a液逐滴加入到b液中，邊加邊攪拌，置室溫(25℃)下磁力攪拌反應(yīng)過夜(12h)，離心后取上清，4℃0.01m，ph7.4磷酸鹽緩沖液中透析3天，每天更換透析液2次，得到毒死蜱人工抗原，冷凍保存。

2、毒死蜱人工抗原的鑒定

將上述產(chǎn)物用0.01m，ph7.4磷酸鹽緩沖液配成溶液進(jìn)行紫外(200～400nm)掃描，完全抗原紫外光譜在277.5nm處有特征吸收峰，牛血清白蛋白(bsa)在264.5nm有特征吸收峰，而半抗原在250nm處有特征吸收峰，完全抗原的紫外吸收圖譜不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，說明毒死蜱半抗原與載體蛋白成功偶聯(lián)(見圖2)。

通過上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明成功制備得到了毒死蜱人工抗原，其合成方法簡單，一步反應(yīng)即可完成制備，并且制得的毒死蜱抗原純度高，產(chǎn)量高，其對于毒死蜱抗體的制備以及毒死蜱農(nóng)藥殘留檢測具有重要價(jià)值。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。