本發(fā)明屬于卷煙香精香料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種利用特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。
背景技術(shù)：
在煙草行業(yè)中，香精香料對(duì)卷煙產(chǎn)品的口味起著決定性作用?，F(xiàn)今生產(chǎn)的香料、香精中約85％的產(chǎn)品是通過(guò)化學(xué)合成方法得到的。但是用化學(xué)法合成的香料不僅合成較困難、且大量使用會(huì)對(duì)人體健康造成影響。隨著人們生活水平的提高，對(duì)煙用香料的需求趨向于天然、健康、安全、營(yíng)養(yǎng)和多功能性。
天然香精香料是高價(jià)值的精細(xì)化工產(chǎn)品，但由于原料有限、提取成本高，僅僅依靠從天然動(dòng)、植物中提取天然香料，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了卷煙香料市場(chǎng)的需求。利用微生物發(fā)酵技術(shù)可以制備香料或進(jìn)行香料的轉(zhuǎn)化，在提高香料產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，還能夠節(jié)約能源、降低成本，因此，科技人員對(duì)于卷煙用香精香料的生物制取技術(shù)進(jìn)行了不斷嘗試。
類胡蘿卜素是一大類在自然界廣泛分布的四萜類化合物，其降解的致香物質(zhì)包括β-紫羅蘭酮、β-大馬酮、和二氫獼猴桃內(nèi)酯等，因具有較低的感觀閾值，是許多香料的特征香味，這類香味物質(zhì)在天然材料中含量很低，且提取成本昂貴，近年來(lái)一些研究者嘗試通過(guò)酶或微生物體系模擬類胡蘿卜素的自然降解，以獲得新型香料。
米曲霉(aspergillusoryzae)在自然界廣泛分布，是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，但關(guān)于用米曲霉降解葉黃素制備煙用香料的研究，在現(xiàn)有技術(shù)中尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。所得產(chǎn)品符合天然香料的要求，具有濃郁木香味，能夠與煙香形成良好的配伍。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明從云南省紅河州陳化煙葉中分離了一株真菌ynca9804作為試驗(yàn)菌種，對(duì)其進(jìn)行了its序列分析，鑒定結(jié)果表明該細(xì)菌屬于曲霉屬，其分類命名為米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804，保藏號(hào)為cctccno：m2016654。
本發(fā)明所述的米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株的形態(tài)學(xué)特征為：菌落微膨大、疏松粉狀，中間淡黃綠色，邊緣白色，背面乳白色；菌絲體發(fā)達(dá)，菌絲不光滑，有隔多分枝；分生孢子梗粗糙或有麻點(diǎn)，孢子囊呈球形或半球形，孢子鏈著生于小孢子梗上。
本發(fā)明所述的米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株的分子鑒定特征為：測(cè)序結(jié)果在genbank中進(jìn)行同源性比對(duì)，提取相似度98％以上的序列，利用mega6.0軟件，以領(lǐng)域連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ynca9804與菌株aspergillusoryzaestrainatcc42149聚為一簇，同源性為100％，鑒定菌株ynca9804為米曲霉(aspergillusoryzae)。
利用所述米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法，包括以下步驟：
(1)將米曲霉菌株ynca9804置于斜面固體培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆茫?/p>
(2)葉黃素儲(chǔ)備液的制備：稱取5g葉黃素，溶于10ml的二氯甲烷中，待葉黃素徹底溶解后加入1gtween-80進(jìn)行乳化；在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發(fā)干，再加入100ml無(wú)菌蒸餾水混合均勻，得儲(chǔ)備液待用；
(3)降解葉黃素的產(chǎn)香發(fā)酵：
①將保存?zhèn)溆玫拿浊咕陏nca9804轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基中，搖床上28℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為180r/min，得米曲霉種子液；所述的液體種子培養(yǎng)基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5～6.8，裝入250ml錐形瓶，100ml/瓶，121℃，25min滅菌備用；
②取步驟①所得米曲霉種子液，按培養(yǎng)基體積比1％接入50l發(fā)酵罐中進(jìn)行液體培養(yǎng)，同時(shí)按培養(yǎng)基體積比0.05％～1％加入葉黃素儲(chǔ)備液，50l發(fā)酵罐定容30l；所述的培養(yǎng)基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5；培養(yǎng)控制條件：溫度25～40℃，通氣比0.1～10，罐壓：0.03～0.08mpa，do≥20％，攪拌速率120～400r/min，發(fā)酵時(shí)間48h～192h；
(4)發(fā)酵完成后過(guò)濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
進(jìn)一步的，為防止香料變質(zhì)，按煙用香料重量的5％添加丙二醇。
步驟(1)中所述的斜面固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph值6.5～6.8，121℃，25min滅菌，冷卻至60℃倒平板備用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)首次以米曲霉降解葉黃素制備煙用香料，經(jīng)感官評(píng)吸測(cè)定，所得香料具有豐富煙香，增加卷煙木甜香的作用。
(2)經(jīng)由米曲霉菌株ynca9804降解葉黃素得到的煙用香料，具有濃郁木香味，通過(guò)gc-ms檢測(cè)，結(jié)果表明香料中含有β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯及β-環(huán)檸檬醛等致香物質(zhì)成分；將該香料添加到卷煙中進(jìn)行評(píng)吸，結(jié)果表明香氣量較為充足，甜韻感豐富，地方性雜氣減少，喉部舒適性增加，余味較為舒適，口腔收斂較強(qiáng)。
(3)本發(fā)明原料來(lái)源充足；所用培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，菌株性狀穩(wěn)定、易于保存、活化和發(fā)酵。
(4)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、操作性、規(guī)范性及可控性強(qiáng)，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
保藏生物材料的說(shuō)明
本發(fā)明的菌株，已于2016年11月30日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，該中心地址：中國(guó)湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)，該菌株分類命名為：米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804，保藏編號(hào)cctccno：m2016654。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過(guò)實(shí)施例及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限定。
實(shí)施例1
(1)將保存于固體斜面的米曲霉ynca9804菌株(cctccm2016654)轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基中，搖床上28℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為180r/min。
斜面固體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph值6.5-6.8。121℃，25min滅菌，冷卻致60℃倒平板備用。
液體種子培養(yǎng)基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5-6.8。裝入250ml錐形瓶，100ml/瓶，121℃，25min滅菌備用。
(2)稱取5g葉黃素，溶于10ml的二氯甲烷中，待葉黃素徹底溶解后加入1gtween-80進(jìn)行乳化；在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發(fā)干，再加入100ml無(wú)菌蒸餾水混合均勻，得儲(chǔ)備液待用；
(3)將步驟(1)培養(yǎng)生長(zhǎng)米曲霉ynca9804種子液6瓶，按1％(v/v)接入50l發(fā)酵罐中進(jìn)行液體培養(yǎng)，50l種子罐定容30l。葉黃素儲(chǔ)備液的投料量比例為0.1％(w/v)。
培養(yǎng)基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度32℃，通氣比1(v/v)，罐壓：0.03mpa，do≥20％，攪拌速率120r/min，發(fā)酵時(shí)間72h。
(5)發(fā)酵完成后過(guò)濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得發(fā)酵煙用香料。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少，改善余味。
實(shí)施例2
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為0.05％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間48h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少。
實(shí)施例3
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為0.2％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間72h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實(shí)施例4
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為0.5％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間72h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實(shí)施例5
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為0.5％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間96h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(5)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少，改善余味。
實(shí)施例6
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為1％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間120h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實(shí)施例7
重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn)：
(3)培養(yǎng)基：葉黃素儲(chǔ)備液的投料比例為0.3％(w/v)。
(4)培養(yǎng)控制條件：溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間72h。
(5)為防止變質(zhì)，按發(fā)酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結(jié)果：與未加發(fā)酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和變化等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。