本發(fā)明涉及一種快速鑒定乳酸菌產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳酸菌是發(fā)酵食品或飲料(例如醬油、發(fā)酵香腸、黃酒等)中廣泛存在的一種微生物，其代謝產(chǎn)生的乳酸是一種風(fēng)味物質(zhì)，因此對(duì)發(fā)酵起積極作用。但是，最近國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌能夠分解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸，而瓜氨酸又是廣泛存在于發(fā)酵食品中的一種致癌物—氨基甲酸乙酯(EC)的一種重要前體物質(zhì)，尤其在消費(fèi)者日常食用(飲用)較多的醬油和黃酒中，EC的含量相對(duì)較高。瓜氨酸由乳酸菌經(jīng)精氨酸脫亞胺酶途徑降解精氨酸形成，但是并非所有乳酸菌都具有該途徑，其存在表現(xiàn)為菌株特異性，即不同菌株降解精氨酸或產(chǎn)生瓜氨酸的能力不盡相同。

乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的編碼基因，除了arcA、arcB、arcC、arcD基因，部分乳酸菌如清酒乳桿菌還有arcR(調(diào)控基因)，PTP(可能與瓜氨酸分泌和重吸收有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因)，不同乳酸菌菌株arc基因簇排列順序和完整性可能有所不同。研究證明，各乳酸菌菌株降解精氨酸和產(chǎn)生瓜氨酸的能力差異根源在于arc基因簇的多態(tài)性。

目前，檢測(cè)乳酸菌是否產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體瓜氨酸的方法主要是菌株分離后純培養(yǎng)，然后在含有精氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間(例如在添加精氨酸的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵3天)，離心取上清液，使用高效液相色譜檢測(cè)胞外精氨酸和瓜氨酸的含量，進(jìn)而確定該菌是否具有產(chǎn)瓜氨酸的能力。此方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不僅需要配制流動(dòng)相，還需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)周期約1周左右，并不是一個(gè)快速的檢測(cè)方法。另一種方法是以簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增arcA、arcB、、arcC基因的部分序列，該方法快速簡(jiǎn)便，但是普適性差，主要是用于檢測(cè)希氏乳桿菌、短乳桿菌、酒酒球菌、戊糖片球菌、腸膜明串珠菌等來(lái)源于葡萄酒中的乳酸菌，對(duì)于從黃酒中分離的乳酸菌檢測(cè)效果很差，主要表現(xiàn)為以該引物檢測(cè)時(shí)，許多能夠產(chǎn)生瓜氨酸的乳酸菌都不能擴(kuò)增出arcA和arcB，已有報(bào)道的這些引物在實(shí)際應(yīng)用時(shí)具有相當(dāng)大的局限性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的方法，所述方法是以乳酸菌基因組DNA為模板，分別用引物對(duì)A和引物對(duì)B進(jìn)行PCR，如果能夠得到分別為200～300bp、450bp～550bp的PCR產(chǎn)物，那么該乳酸菌具有精氨酸脫亞胺酶途徑，否則該乳酸菌不具有精氨酸脫亞胺酶途徑。

其中引物對(duì)A由核苷酸序列為SEQ ID NO.1和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的核苷酸片段組成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同時(shí)進(jìn)行反向互補(bǔ)后得到的兩個(gè)核苷酸片段組成；所述引物對(duì)B由核苷酸序列為SEQ ID NO.3和核苷酸序列為SEQ ID NO.4的核苷酸片段組成，或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同時(shí)進(jìn)行反向互補(bǔ)后得到的兩個(gè)核苷酸片段組成。

在一種實(shí)施方式中，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、彎曲乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、乳桿菌、短乳桿菌、魏斯氏菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、棒狀乳桿菌、檸檬明串珠菌、假腸膜明串珠菌、腸膜明串珠菌。

在一種實(shí)施方式中，所述200～300bp具體是指250bp；所述用450bp～550bp具體是指500bp。

在一種實(shí)施方式中，所述PCR的反應(yīng)體系為：DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP4μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至50μL。

在一種實(shí)施方式中，所述PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性，94℃，4min；變性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；變性、退火、延伸進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，繼續(xù)延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。

在一種實(shí)施方式中，所述PCR產(chǎn)物的檢測(cè)是使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種組合引物對(duì)，包括引物對(duì)A和引物對(duì)B；其中引物對(duì)A由核苷酸序列為SEQ ID NO.1和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的核苷酸片段組成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同時(shí)進(jìn)行反向互補(bǔ)后得到的兩個(gè)核苷酸片段組成；所述引物對(duì)B由核苷酸序列為SEQ ID NO.3和核苷酸序列為SEQ ID NO.4的核苷酸片段組成，或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同時(shí)進(jìn)行反向互補(bǔ)后得到的兩個(gè)核苷酸片段組成。

本發(fā)明還要求保護(hù)所述組合引物對(duì)在食品中乳酸菌檢測(cè)方面的應(yīng)用。

在一種實(shí)施方式中，所述食品包括發(fā)酵食品或飲料。

在一種實(shí)施方式中，所述食品是醬油、發(fā)酵香腸、醬油、黃酒等。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明公開的引物特異性高、通用性好，檢測(cè)方法靈敏、準(zhǔn)確、便捷，可以檢測(cè)不同食品來(lái)源不同種屬的乳酸菌，具有良好的食品安全檢測(cè)前景。

附圖說(shuō)明

圖1為利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物檢測(cè)來(lái)源于黃酒發(fā)酵液的乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的凝膠圖像(A、B分別為利用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物)，其中孔道M為2000bp marker(從上到下分別為2000、1000、750、500、250、100bp)，孔道1-33依次為黃酒發(fā)酵液中分離的乳酸乳球菌1-20，彎曲乳桿菌1-21，發(fā)酵乳桿菌2-1，發(fā)酵乳桿菌2-17，發(fā)酵乳桿菌2-18，植物乳桿菌2-19，彎曲乳桿菌2-20，乳桿菌2-22，植物乳桿菌2-24，發(fā)酵乳桿菌2-28，短乳桿菌2-29，發(fā)酵乳桿菌2-32，短乳桿菌2-34，發(fā)酵乳桿菌2-36，發(fā)酵乳桿菌2-1-1，發(fā)酵乳桿菌2-1-17，乳桿菌2-1-19，魏斯氏菌2-1-26，魏斯氏菌4-15，魏斯氏菌4-19，短乳桿菌4-22，植物乳桿菌7-6，德氏乳桿菌7-13，發(fā)酵乳桿菌7-14，干酪乳桿菌14-1，發(fā)酵乳桿菌14-6，植物乳桿菌14-8，棒狀乳桿菌14-9，檸檬明串珠菌14-16，假腸膜明串珠菌1-5、檸檬明串珠菌1-6、腸膜明串珠菌1-15。

具體實(shí)施方案

下面是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1：

1、乳酸菌基因組DNA的提?。菏褂肊zup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，根據(jù)說(shuō)明書提取黃酒發(fā)酵液中分離的乳酸菌菌株的基因組DNA。

2、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：

設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物對(duì)A和簡(jiǎn)并引物對(duì)B；其中引物對(duì)A的上下游引物的核苷酸序列分別為5’-AACCAYGCHATGATGCAYYT-3’/5’-TTKGABCCRTCRTTCCATTG-3’，用于檢測(cè)arcA基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為250bp；引物對(duì)B的上下游引物的核苷酸序列分別為5’-AYTCHGGKGTDGTTTGGAA-3’/5’-TCVGTMACTTCCATTTCHGT-3’，用于檢測(cè)arcB基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為500bp；其中，Y＝C/T，K＝G/T，R＝A/G，B＝G/T/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T。

乳酸菌菌株基因組DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×Ex Taq Buffer5μL，dNTP 4μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性，94℃，4min；變性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；變性、退火、延伸進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，繼續(xù)延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：如果使用引物對(duì)A和引物對(duì)B進(jìn)行擴(kuò)增，分別出現(xiàn)250bp、500bp大小的條帶，則說(shuō)明該乳酸菌菌株具有精氨酸脫亞胺酶途徑，能夠利用精氨酸產(chǎn)瓜氨酸，其在發(fā)酵食品或飲料中就有產(chǎn)生一種致癌物-氨基甲酸乙酯(EC)的可能性；如果沒(méi)有相應(yīng)大小的條帶，則說(shuō)明該乳酸菌不具有精氨酸脫亞胺酶途徑，不能利用精氨酸產(chǎn)瓜氨酸。

實(shí)施例2：本發(fā)明方法的有效性驗(yàn)證

結(jié)合黃酒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的檢測(cè)實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并非局限于此，也可以推廣到其他食品或飲料中乳酸菌的檢測(cè)。

如圖1所示，從黃酒發(fā)酵液中分離的33株乳酸菌(包括發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌、德氏乳桿菌、棒狀乳桿菌、檸檬明串珠菌、乳酸乳球菌等種屬的乳酸菌)，采用實(shí)施例1的方法進(jìn)行處理，有30株均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶，有3株無(wú)法檢測(cè)到相應(yīng)的條帶。

然后，將這些乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵并利用高效液相色譜檢測(cè)乳酸菌降解精氨酸、產(chǎn)瓜氨酸的能力，具體是：甘油保藏菌在MRS培養(yǎng)基中活化2次至OD₆₀₀＝0.8-1.0，轉(zhuǎn)接到MRS-Arg(添加5g/L精氨酸的MRS培養(yǎng)基，pH5.0)，30℃靜置培養(yǎng)72h，然后10000rpm離心5min，取上清液，以5％TCA溶液稀釋1倍以沉淀上清液中的蛋白，再以高效液相色譜檢測(cè)樣品中精氨酸和瓜氨酸含量。HPLC檢測(cè)氨基酸的方法如下：使用安捷倫1260高效液相色譜，色譜柱為ODS HYPERSIL C-18column(250×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相A為0.8％(w/v)乙酸鈉，0.5％(v/v)四氫呋喃的水溶液，流動(dòng)相B為乙酸鈉：水：甲醇：乙腈＝1:50:100:100。洗脫程序?yàn)?min，A：B＝92:8；15-22min，A：B＝40:60；22-25min，A：B＝92:8。流速保持1mL/min，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。

測(cè)定結(jié)果顯示，上一步檢測(cè)到均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶的這30株乳酸菌在發(fā)酵72h后都能利用完5g/L的瓜氨酸，并產(chǎn)生一定量的瓜氨酸(不同菌株產(chǎn)量有事差異，多數(shù)菌株產(chǎn)量約100mg/L)；而上一步檢測(cè)到無(wú)法擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶的3株菌，無(wú)法產(chǎn)生瓜氨酸。

除此之外，發(fā)明人還嘗試了大量其他來(lái)源的乳酸菌的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果使用本發(fā)明的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增能夠分別出現(xiàn)250bp、500bp左右大小的條帶的乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證后確實(shí)具有利用精氨酸和產(chǎn)瓜氨酸的性能；而經(jīng)檢測(cè)沒(méi)有相應(yīng)大小的條帶乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證后確實(shí)無(wú)法利用瓜氨酸和/或產(chǎn)瓜氨酸。

以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，本發(fā)明的簡(jiǎn)并引物，具有較強(qiáng)的通用性、特異性和準(zhǔn)確性。

實(shí)施例3：引物序列對(duì)檢測(cè)有效性、準(zhǔn)確性的影響

發(fā)明人還采用了已有報(bào)道的來(lái)自Detection ofarc Genes Related with the Ethyl Carbamate Precursors in Wine Lactic Acid Bacteria文獻(xiàn)中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測(cè)從黃酒中分離的乳酸菌能否產(chǎn)生瓜氨酸，結(jié)果顯示很多通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)確定能夠產(chǎn)生瓜氨酸的菌株基因組不能擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，說(shuō)明該文獻(xiàn)中報(bào)道的引物并不適用于黃酒來(lái)源的乳酸菌的檢測(cè)。然而，用本發(fā)明中的引物檢測(cè)來(lái)源于黃酒中的乳酸菌產(chǎn)瓜氨酸是全部適用的，而且本發(fā)明還對(duì)其他來(lái)源(如酸奶)的乳酸菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也是與菌株產(chǎn)瓜氨酸能力吻合的，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法有效性高，適用性廣。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。