本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌作為一種益生菌，可以應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。枯草芽孢桿菌具有安全高效，無藥物殘留，無毒副作用等特點(diǎn)，同時(shí)可通過調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，減少抗生素的使用，更能促進(jìn)畜禽生長發(fā)育和機(jī)體免疫力。從動(dòng)物生產(chǎn)和飼料工業(yè)特點(diǎn)看，芽孢桿菌比其他有益微生物有更多的優(yōu)點(diǎn)，因而其研究和應(yīng)用受到廣泛重視。
近年來隨著發(fā)酵技術(shù)的全面展開，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)得到了前所未有的發(fā)展?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵是一種復(fù)雜的生化過程，其發(fā)酵好壞涉及諸多因素，除了菌種的生產(chǎn)性能，還與培養(yǎng)基的配比、原料的質(zhì)量、滅菌條件、種子質(zhì)量、發(fā)酵條件以及過程控制等密切相關(guān)。其中營養(yǎng)成分控制，控制培養(yǎng)基的酸堿度，控制培養(yǎng)溫度以及通氣條件的控制等條件都是制約其發(fā)酵的主要原因。目前枯草芽孢桿菌發(fā)酵主要采取液體發(fā)酵方式，其使用的培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗大，價(jià)格成本高，而且枯草芽孢桿菌及其制劑的價(jià)格低廉，市場競爭力大，都成為了制約研究枯草芽孢桿菌發(fā)展的主要因素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，利用枯草芽孢桿菌的生長所需營養(yǎng)的特性，采用糖蜜等提供營養(yǎng)，可以縮短枯草芽孢桿菌的繼代間隔時(shí)間，加快枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，包括如下步驟：
（1）枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的制備：在容器中裝入NA培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌30min，冷卻至室溫，所述NA培養(yǎng)基的成分為蛋白胨20g/L、牛肉粉3g/L和氯化鈉5g/L， pH為7.2±0.1；
（2）枯草芽孢桿菌菌種活化培養(yǎng)：將斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，接種至步驟（1）制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基，37℃，100～120rpm搖床震蕩培養(yǎng)16～20h，制成種子液；
（3）枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為糖蜜9.8g/L 、(NH4)2SO40.2g/L、豆餅粉20g/L、葡萄糖4g/L和氯化鈉4g/L，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)至pH 7.2±0.1；
（4）對(duì)活化后的枯草芽孢桿菌種子液的擴(kuò)培養(yǎng)：將步驟（2）制備的枯草芽孢桿菌種子液按0.1～0.2%的比例接入到已裝有步驟（3）所述發(fā)酵培養(yǎng)基的一級(jí)發(fā)酵罐中，再加入發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量0.2～0.3%的消泡劑，在37℃，通氣量0.4～0.6m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)100～120prm，空氣壓力0.05～0.1MPa，控制體系pH為7.2±0.1，條件下培養(yǎng)14～16h；
（5）用擴(kuò)培養(yǎng)的種子液制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵液：將上述步驟（4）制備的枯草芽孢桿菌擴(kuò)培養(yǎng)的種子液接入到已裝有步驟（3）所制發(fā)酵培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐中，再加入消泡劑，在37℃，通氣量0.8～1m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)120prm，空氣壓力0.05～0.1MPa，控制體系pH為7.2±0.1，培養(yǎng)20～24h，即得枯草芽孢桿菌菌液。
糖蜜是工業(yè)制糖過程中，蔗糖結(jié)晶后，剩余不能結(jié)晶、但仍含有較多糖的液體殘留物，其加工后可以作為某些食品的原料和動(dòng)物飼料。其具有價(jià)格低廉，營養(yǎng)價(jià)值高，易溶于水，利于微生物消化吸收等特點(diǎn)，同時(shí)適口性好，易于成型，可為微生物制劑提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明利用糖蜜為主的發(fā)酵培養(yǎng)基來培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，既降低了原料成本和生產(chǎn)成本，也大大加快枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間，改良了工業(yè)化生產(chǎn)枯草芽孢桿菌方法。
作為優(yōu)選，步驟（5）中所述枯草芽孢桿菌擴(kuò)培養(yǎng)的種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比為0.001~0.002：1。
作為優(yōu)選，步驟（5）中所述消泡劑與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比為0.002~0.003：1。
本發(fā)明的有益效果為：
1. 本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基中代替一般枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米淀粉、部分金屬離子，既降低了原料成本，也減少了玉米淀粉酶解步驟，減少了補(bǔ)料的工作量，進(jìn)而降低了生產(chǎn)成本。
2. 本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基的液體粘度降低，增加了發(fā)酵罐培養(yǎng)基溶氧量，并含有多種維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)及促生長因子等成分，更有適于枯草芽孢桿菌生長的營養(yǎng)需要，同時(shí)可以縮短枯草芽孢桿菌的繼代間隔時(shí)間，加快枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間。
3. 本發(fā)明的培養(yǎng)方法具有設(shè)備常規(guī)、操作簡便、高效的特點(diǎn)，改良了工業(yè)化生產(chǎn)方法，所得枯草芽孢桿菌活菌濃度可達(dá)到80-100億/ml。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例1
（1）枯草芽孢桿菌ESIGMA-945種子培養(yǎng)基的制備：以1000ml三角瓶裝有200ml NA培養(yǎng)基（蛋白胨2.0g，牛肉粉0.6g，氯化鈉1.0g，加水補(bǔ)足200ml，pH7.2±0.1）經(jīng)121℃高壓滅菌30min，冷卻至室溫；
（2）枯草芽孢桿菌ESIGMA-945菌種的活化培養(yǎng)：將斜面保存的枯草芽孢桿菌ESIGMA-945菌種，接種至上述步驟（1）制備的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基，37℃ 120rpm搖床震蕩培養(yǎng)16小時(shí)，制成種子液；
（3）枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：糖蜜9.8g/L+(NH4)2SO40.2g/L+豆餅粉20g/L+葡萄糖4g/L+氯化鈉4g/L，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)至pH 7.3；
（4）對(duì)活化后的枯草芽孢桿菌種子液的擴(kuò)培養(yǎng)：將上述步驟（2）制備的枯草芽孢桿菌種子液按0.1%的比例接入到已裝有20L上述步驟（3）制備發(fā)酵培養(yǎng)基的一級(jí)發(fā)酵罐中，在37℃，通氣量1m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)120prm，空氣壓力0.08MPa，控制體系pH為7.0～7.3，消泡劑0.3%的條件下培養(yǎng)16h。
（5）用擴(kuò)培養(yǎng)的種子液制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵液：將上述步驟（4）制備的枯草芽孢桿菌擴(kuò)培養(yǎng)的種子液按0.2%的比例接入到已裝有150L上述步驟（3）制備發(fā)酵培養(yǎng)基的二級(jí)發(fā)酵罐中，在37℃，通氣量1m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)120prm，空氣壓力0.1MPa，控制體系pH為7.0～7.3，消泡劑0.3%的條件下培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌菌液，其中含枯草芽孢桿菌活菌濃度可達(dá)到80-100億/ml。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。