本發(fā)明涉及一種塔格糖的制備方法，尤其涉及一種體外多酶催化將淀粉或纖維素及其衍生物轉化為塔格糖的方法，屬于塔格糖的酶催化制備領域。
背景技術：
：：塔格糖(D-Tagatose)是天然存在的一種稀有單糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向異構體。甜味特性與蔗糖相似，而產生的熱量只為蔗糖的三分之一，所以被稱之為低熱量甜味劑。塔格糖具有低熱量值、零血糖生成指數、血糖鈍化作用、無齲齒性、益生元作用和抗氧化活性等優(yōu)良營養(yǎng)特性。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善腸道菌群和抗齲齒(OhD-K:Tagatose:properties,applications,andbiotechnologicalprocesses.App.Microbiol.Biotechnol.2007,76:1-8)。生產塔格糖的方法有化學合成法和生物轉化法兩種。一般都以半乳糖為原料，通過化學方法或生物轉化進行異構化反應而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到，也有研究使用半乳糖醇為原料，經生物氧化為塔格糖。但半乳糖醇價格較高，目前暫不適宜用作工業(yè)化生產原料?；瘜W合成法是利用可溶性堿金屬鹽或堿土金屬鹽為催化劑，促使D-半乳糖在堿性條件下生成塔格糖，并形成金屬氫氧化物-塔格糖復合物，再用酸中和獲得D-塔格糖。生物轉化法包括將半乳糖醇氧化成塔格糖，和利用微生物所產生的異構酶將半乳糖異構成塔格糖兩種方法。因化學法能耗高，產物復雜，純化困難，副反應多，產生化學污染，故生物轉化法具有較好的應用前景。目前研究較多的生物轉化生產塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖異構酶催化D-半乳糖轉化為塔格糖，然而半乳糖的較高價格影響了塔格糖的最終價格，導致無法廣泛的使用(RhimiM,AghajariN,JuyM,ChouayekhH,MaguinE,HaserR,BejarS:RationaldesignofBacillusstearothermophilusUS100l-arabinoseisomerase:Potentialapplicationsford-tagatoseproduction.Biochim.2009,91:650-653.OhH-J,KimH-J,OhD-K:Increaseind-tagatoseProductionRatebySite-directedMutagenesisofl-arabinoseIsomerasefromGeobacillusthermodenitrificans.Biotechnol.Lett.2006,28:145-149.BosshartA,HeeCS,BechtoldM,SchirmerT,PankeS:DirectedDivergentEvolutionofaThermostableD-TagatoseEpimerasetowardsImprovedActivityforTwoHexoseSubstrates.ChemBioChem2015,16:592-601.MenY,ZhuY,ZhangL,KangZ,IzumoriK,SunY,MaY:EnzymaticconversionofD-galactosetoD-tagatose:Cloning,overexpressionandcharacterizationofl-arabinoseisomerasefromPediococcuspentosaceusPC-5.Microbiol.Res.2014,169:171-178.)。韓國科學家發(fā)明一種多酶催化的方法將果糖轉化為塔格糖，包括利用6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶將果糖轉化為塔格糖(OhDK,HONGSH,LeeSH:Aldolase,aldolasemutantsandtagatoseusingthesameproductionmethodsandcompositionsforproduction.WO2015016544A1.GooglePatents；2015.)，但是從果糖生產6-磷酸果糖需要ATP對果糖進行底物磷酸化，導致塔格糖生產成本高，不適應大規(guī)模生產。因此，亟待開發(fā)一種低成本，低污染，高產率的適合規(guī)模化生產塔格糖的新方法。技術實現要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種塔格糖的制備方法，該方法通過體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物，或者蔗糖制備塔格糖，具有塔格糖的產率和轉化率高，生產成本低，無污染等優(yōu)點。為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：本發(fā)明首先公開了一種淀粉塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶(α-Glucanphosphorylase，EC2.4.1.1)、葡萄糖磷酸變位酶(Phosphoglucomutase，EC5.4.2.2)、葡萄糖磷酸異構酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向異構酶(Tagatose6-phosphate4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反應體系，進行酶催化反應，即得。為了達到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應產物按照常規(guī)的方法進行分離、純化。所述多酶反應體系中，所述底物的濃度為1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述底物的濃度為100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL。所述酶催化反應的條件為：10-90℃反應1-100小時；優(yōu)選為，37℃反應24-40小時。本發(fā)明淀粉塔格糖的制備方法中，所述淀粉優(yōu)選為可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麥芽糊精、麥芽多糖或麥芽糖中的任意一種或多種按照任意比例組成的混合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術方案，所述多酶催化物中還包括(1)、(2)或(3)中任何一種：(1)淀粉去分支酶或麥芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC2.4.1.8)中的任何一種或兩種；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖轉移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)中的任何一種或兩種；(3)淀粉去分支酶、麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉移酶中的任意一種或三種；優(yōu)選的，在多酶反應體系中，所述淀粉去分支酶的用量為0.1-500U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉移酶的用量為0.1-500U/mL；更優(yōu)選的，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉移酶的用量為1U/mL；其中，所述淀粉去分支酶為異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)或普魯蘭酶(pullulanase，EC3.2.1.41)中的任意一種或兩種。進一步優(yōu)選的，為了提高塔格糖的得率，將殘余的葡萄糖轉化為塔格糖，所述多酶催化物中還包括：聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，在多酶反應體系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為0.1-500U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為1-100mM；更優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為1U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM。其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。反應結束后，殘余的淀粉殘渣將是純的直鏈淀粉，此時可加入少量的α淀粉酶(EC3.2.1.1)促進淀粉殘渣的水解，進一步提高塔格糖的產量。優(yōu)選的，在多酶反應體系中，所述α淀粉酶的用量為0.01-100U/ml，更優(yōu)選為0.1U/ml。本發(fā)明所述多酶反應體系中還包括：緩沖液、無機磷酸根和二價鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM，無機磷酸根2-100mM、二價鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH為5.0-9.0；優(yōu)選的，pH為7.0；更優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸鹽緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無機磷酸根)、二價鎂離子5mM。本發(fā)明以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應體系，多酶催化途徑包括：由α-葡聚糖磷酸化酶將淀粉或淀粉衍生物中的一個葡萄糖單元轉化為1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸變位酶將1-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸異構酶將6-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向異構酶將6-磷酸果糖轉化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖和磷酸。由于由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖的酶催化反應是不可逆反應，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉化率，而高得率和高轉化率可以大大降低塔格糖的分離成本。由于淀粉是直鏈淀粉(20-30％)和支鏈淀粉(70-80％)的混合物。支鏈淀粉中的支鏈是以α-1,6糖苷鍵與主鏈相連的，而α-葡聚糖磷酸化酶不能分解α-1,6糖苷鍵。為了提高塔格糖的轉化率，本發(fā)明在多酶反應體系中加入能夠分解淀粉中α-1,6糖苷鍵的去分支酶—異淀粉酶或普魯蘭酶。由于α-葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最終產物是麥芽糖，為了利用麥芽糖，本發(fā)明進一步在反應體系中加入麥芽糖磷酸化酶，將麥芽糖分解為1-磷酸葡萄糖和葡萄糖；更優(yōu)選的，本發(fā)明在多酶反應體系中再進一步加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，將葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，由6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉化為塔格糖，最終將淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉化為塔格糖，從而提高塔格糖的得率和轉化率。在這里，麥芽糖磷酸化酶可被葡聚糖轉移酶替換，該酶可以將短鏈的寡聚糖聚合成為長鏈的寡聚糖，而該長鏈的寡聚糖又可被α-葡聚糖磷酸化酶重新利用，從而能夠提高淀粉的利用率。本發(fā)明還公開了另一種纖維素塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入含有纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶(cellodextrinphosphorylase，EC2.4.1.49)、纖維二糖磷酸化酶(cellobiosephosphorylase，EC2.4.1.20)、葡萄糖磷酸變位酶(EC5.4.2.2)、葡萄糖磷酸異構酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向異構酶(Tagatose6-phosphate4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反應體系，進行酶催化反應，即得。為了達到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應產物按照常規(guī)的方法進行分離、純化。優(yōu)選為，先將纖維素或纖維素衍生物和纖維素酶在冰水浴上混合，4℃離心，去上清，得到纖維素酶和纖維素的混合物；然后在纖維素酶和纖維素的混合物中，再加入纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶建立多酶反應體系。其中，纖維素或纖維素衍生物的用量為1-500g/L、纖維素酶的用量為1-500U/ml；優(yōu)選的，纖維素或纖維素衍生物的用量為100g/L，纖維素酶的用量為10U/ml。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產物是纖維二糖和纖維多糖。在所述多酶反應體系中，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為1-500g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為100g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL。所述酶催化反應的條件為：10-80℃反應1-120小時；優(yōu)選為，37℃反應48-96小時，最優(yōu)選為72小時。為了進一步提高纖維素塔格糖的得率，所述多酶催化物中還包括：聚磷酸葡萄糖激酶(EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，在多酶反應體系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為0.1-500U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為1-100mM；更優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。本發(fā)明所述多酶反應體系中還包括：緩沖液、無機磷酸根和二價鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM、無機磷酸根2-100mM、二價鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸緩沖液；更優(yōu)選的，所述磷酸緩沖液的pH值為5.0-9.0，最優(yōu)選為7.2；進一步優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無機磷酸根)、二價鎂離子5mM。本發(fā)明所述纖維素衍生物包括：纖維素經過預處理后的產物，纖維多糖或纖維二糖中的任意一種。所述預處理方法包括：酸水解法、酶水解法或物理法；優(yōu)選的，所述纖維素經過預處理后的產物為纖維素經過濃磷酸處理后的產物(Zhang,Y.H.P.,etal.(2006)."ATransitionfromCelluloseSwellingtoCelluloseDissolutionbyo-PhosphoricAcid:EvidencefromEnzymaticHydrolysisandSupramolecularStructure."Biomacromolecules7(2):644-648.)。本發(fā)明以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應體系，多酶催化途徑包括：由纖維素酶水解纖維素生成纖維多糖和纖維二糖；由纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶將纖維多糖或纖維二糖的一個葡萄糖單元轉化為1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸變位酶將1-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸異構酶將6-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向異構酶將6-磷酸果糖轉化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖。本發(fā)明在上述多酶反應體系中進一步加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，將纖維素水解后的最終產物葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，再由葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉化為塔格糖，最終將纖維素及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉化為塔格糖。本發(fā)明進一步公開了一種蔗糖塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以蔗糖為底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的多酶催化物建立多酶催化反應體系進行酶催化反應，即得。為了達到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應產物按照常規(guī)的方法進行分離、純化。所述的多酶催化反應體系中，所述蔗糖的濃度為10-300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述蔗糖的濃度為300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量為30U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為30U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為30U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為30U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為30U/mL。所述酶催化反應的條件是：20-70℃反應2-100h；優(yōu)選為，37℃反應10-72h。其中，所述多酶反應體系中還包括：緩沖液、無機磷酸根和二價鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM，無機磷酸根2-100mM、二價鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸緩沖液，pH為5.0-9.0；優(yōu)選的，pH為7.2；更優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無機磷酸根)、二價鎂離子5mM。為了進一步提高蔗糖塔格糖的得率，所述多酶催化反應體系中還包括：葡萄糖異構酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，每10g/L蔗糖，葡萄糖異構酶的用量為1U/mL，聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。本發(fā)明以蔗糖為底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應體系，多酶催化途徑包括：由蔗糖磷酸化酶將蔗糖中的一個葡萄糖單元轉化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉化為葡萄糖-6-磷酸；由葡萄糖磷酸異構酶將葡萄糖-6-磷酸轉化為果糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖差向異構酶將果糖-6-磷酸轉化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖和磷酸。本發(fā)明在上述多酶反應體系中進一步加入葡萄糖異構酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鹽，將蔗糖水解后的終產物葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸，再由葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉化為塔格糖。本發(fā)明體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物，或者蔗糖制備塔格糖的方法，所述酶催化反應可在一個或多個反應器分步進行，優(yōu)選為在一個反應器中進行。本發(fā)明多酶反應體系中的任何一種酶可以為任何一種具有同等功能的酶所替換，也可以為通過蛋白質工程改造所獲得的具有同等功能的突變酶。本發(fā)明體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖實驗中，在一個反應體系中，以可溶性淀粉為底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶進行催化反應，塔格糖的轉化率為37％。而在上述反應體系中進一步加入異淀粉酶、麥芽糖磷酸化酶、聚磷酸葡萄糖激酶、葡聚糖轉移酶和聚磷酸鈉，最終塔格糖的轉化率達到72％，轉化率顯著提高。本發(fā)明體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖實驗中，在一個反應體系中，以重生的非晶形的纖維素為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶進行催化反應，塔格糖的轉化率為35％。在上述反應體系中另外加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，最終塔格糖的轉化率達到68％以上，轉化率顯著提高。本發(fā)明體外多酶催化將蔗糖轉化為塔格糖實驗中，在一個反應體系中，以蔗糖為底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶、葡萄糖異構酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉進行催化反應，最終塔格糖的轉化率達到63％。本發(fā)明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：(1)原料價格低廉。本發(fā)明以淀粉或纖維素以及它們的衍生物為原料，或者以蔗糖為原料，而不是使用昂貴的半乳糖。因此，塔格糖的生產成本低，適于大規(guī)模生產。(2)塔格糖的得率高。本發(fā)明體外多酶催化反應的最后一步，即由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖的酶催化反應是不可逆過程，因此可以獲得很高的塔格糖轉化率，從而降低塔格糖的分離成本。(3)本發(fā)明制備方法不用果糖作原料，不需要ATP進行底物磷酸化生產6-磷酸果糖，大大降低生產塔格糖的成本。本發(fā)明所涉及到的術語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。術語“酶催化反應”意指在生物催化劑-酶作用下進行的化學反應。附圖說明圖1為轉化淀粉生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，IA，異淀粉酶；PA，普魯蘭酶；αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；MP，麥芽糖磷酸化酶(該酶可被葡聚糖轉移酶替換)；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖2為利用HPLC檢測以可溶性淀粉為底物，經過酶促反應后的產物，箭頭所指表示塔格糖的特征峰；圖3為轉化纖維素生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，Cellulase，纖維素酶；CDP，纖維多糖磷酸化酶；CBP，纖維二糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖4為轉化蔗糖生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；GI，葡萄糖異構酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖5為用HPLC檢測以蔗糖為底物，經過酶促反應后的產物，箭頭所指表示塔格糖的特征峰。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。1、實驗材料可溶性淀粉，solublestarch，ACROS公司產品，產品編號：424490020；麥芽糊精，ALDRICH公司產品，產品編號419672；pET20b載體，Novagen，Madison，WI；大腸桿菌表達菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；本發(fā)明中的大部分酶(除了塔格糖-6-磷酸差向異構酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶，聚磷酸葡萄糖激酶和葡聚糖轉移酶)能在Sigma公司購買得到；但是都可以按照基因工程方法通過原核表達獲得；纖維素酶從Sigma公司購買，產品編號為C2730；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產品編號為M8284；α淀粉酶從Sigma公司購買，產品編號為10065；Avicel，微晶形纖維素，從Sigma公司購買，產品編號為11365。實驗例1體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖通過一個體外多酶催化體系將淀粉轉化為塔格糖(圖1)。這些關鍵酶包括：(1)α-葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC2.4.1.1)，從淀粉的非還原端加上1個磷酸鹽釋放出1-磷酸葡萄糖；(2)葡萄糖磷酸變位酶(PGM，EC5.4.2.2)，催化1-磷酸葡萄糖到6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸異構酶，將6-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸果糖；(4)6-磷酸塔格糖差向異構酶，將6-磷酸果糖轉化為塔格糖-6-磷酸；(5)6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉化為塔格糖和磷酸。在本發(fā)明中，α-葡聚糖磷酸化酶來源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的編號為TM1168；葡萄糖磷酸變位酶也來源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的編號為TM0769；葡萄糖磷酸異構酶來源于Clostridiumthermocellum，基因在KEGG上的編號為Cthe0217；6-磷酸塔格糖差向異構酶來自于Agrobacteriumfabrum，基因在KEGG上的編號為Atu3167；6-磷酸塔格糖磷酸酶來源于Archaeoglobusfulgidus，基因在KEGG上的編號為AF_0444，這些基因組DNA都可從ATCC的官方網站(www.atcc.org)上獲得。這五個基因分別用不同的引物從相應的基因組DNA中通過PCR獲取，并通過SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體((Novagen,Madison,WI)中，獲得相應的表達載體pET20b-TmαGP、pET20b-TmPGM、pET20b-CtPGI、pET20b-AtaT6E和pET20b-AfT6P。這五個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并進行蛋白質表達與純化。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進行催化反應，反應24個小時。根據保持時間的不同，HPLC可以用來區(qū)分反應液中的塔格糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖或6-磷酸葡萄糖；并且可以對塔格糖進行定量，塔格糖的濃度與HPLC中塔格糖特征峰的強度是成正比的；HPLC的流動相為5mM的稀硫酸。反應結束后，最終塔格糖(圖2)的終濃度是37g/L，轉化率為37％。實驗例2體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在20℃進行催化反應，反應24個小時。反應結束后，最終塔格糖的終濃度是16g/L，轉化率為16％。實驗例3體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在50℃進行催化反應，反應24個小時。反應結束后，最終塔格糖的終濃度是8g/L，轉化率為8％。實驗例4通過過程優(yōu)化和添加促進淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖由于淀粉是有分支鏈，單純采用α-葡聚糖磷酸化酶并不能完全將淀粉水解，因為α-葡聚糖磷酸化酶只會作用于α-1，4糖苷鍵，而分支鏈是以α-1，6糖苷鍵與主鏈連接的。這需要加入異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)水解α-1，6糖苷鍵。最后，淀粉被這兩種酶水解的最終產物是麥芽糖和葡萄糖，為了將這些最終產物轉化為塔格糖，還需要加入麥芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)。在本發(fā)明中，異淀粉酶來源于Sulfolobustokodaii，基因在KEGG上的編號為ST0928，該菌株的基因組DNA是德國Albert-Ludwigs-Freiburg的GeorgFuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶來源于Thermobifidafusca，基因在KEGG上的編號為Tfu1811，該菌株的基因組DNA是美國康奈爾大學的DavidWilson教授友情提供。葡聚糖轉移酶來源于Thermococcuslitoralis，基因在KEGG上的編號為OCC_10078，該菌株的基因組DNA可從ATCC的官方網站(www.atcc.org)上獲得。這三個基因分別用不同的引物從相應的基因組DNA中通過PCR獲取，并通過SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應的表達載體pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Ti4GT，這三個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質表達與純化。α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產品編號為M8284。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進行催化反應，反應40個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖(圖2)的終濃度為72g/L，轉化率達到了72％。實驗例5通過過程優(yōu)化和添加促進淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4，普魯蘭酶(pullulanase，EC3.2.1.41)從Sigma公司購買，產品編號為P1067；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產品編號為M8284。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的普魯蘭酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進行催化反應，反應40個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖的終濃度為73g/L，轉化率達到了73％。隨后在反應體系中加入少量的α淀粉酶促進殘渣淀粉的水解，提高塔格糖的產量，α淀粉酶的用量為0.1U/ml，繼續(xù)在37℃反應24小時，最終塔格糖(圖2)的終濃度為88g/L，轉化率達到了88％。實驗例6體外多酶催化將麥芽糊精轉化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；異淀粉酶、聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4，麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產品編號為M8284。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的麥芽糊精(ALDRICH公司產品，產品編號419672)，在37℃進行催化反應，反應40個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖的終濃度為78g/L，轉化率達到了78％。實驗例7體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖通過一個體外多酶催化體系將纖維素轉化為塔格糖的示意圖見圖3。纖維素酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1。纖維多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纖維二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是來源于Clostridiumthermocellum。這兩個基因分別用不同的引物從相應的基因組DNA(基因組DNA可從ATCC的官方網站(www.atcc.org/)上獲得)中通過PCR獲取，并通過SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應的表達載體pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。這兩個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質表達與純化。本實驗采用微晶形纖維素(Avicel)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(10U/ml)和纖維素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結合的纖維素酶的混合物。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產物是纖維二糖和纖維多糖。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在37℃進行催化反應，反應72個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖的終濃度是14g/L，轉化率為14％。實驗例8體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖纖維素酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶，6-磷酸塔格糖差向異構酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。本實驗采用重生的非晶形的纖維素(RegeneratedAmorphouscellulose(RAC)，這是Avicel經過濃磷酸處理后的產物)(Zhang,Y.H.P.,etal.(2006)."ATransitionfromCelluloseSwellingtoCelluloseDissolutionbyo-PhosphoricAcid:EvidencefromEnzymaticHydrolysisandSupramolecularStructure."Biomacromolecules7(2):644-648.)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(10U/ml)和該纖維素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結合的纖維素酶的混合物。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在37℃進行催化反應，反應72個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖的終濃度是35g/L，轉化率為35％。實驗例9體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖纖維素酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在25℃進行催化反應，反應24個小時。最終塔格糖的終濃度是29g/L，轉化率為29％。實驗例10體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖纖維素酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進行催化反應，反應24個小時。最終塔格糖的終濃度是9g/L，轉化率為9％。實驗例11體外多酶催化將纖維素轉化為塔格糖由于纖維素水解后的最終產物為葡萄糖，為了將其轉化為塔格糖，還需要加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸。纖維素酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4；纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，5U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，在37℃進行催化反應，反應72個小時。塔格糖的檢測方法同實驗例1，最終塔格糖的終濃度為68g/L，轉化率達到了68％。實驗例12體外多酶催化將蔗糖轉化為塔格糖通過一個體外多酶催化體系將蔗糖轉化為塔格糖的示意圖見圖4。蔗糖磷酸化酶是來源于ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumJW/SL-YS485，該基因所編碼的酶在NCBI數據庫的編號是WP_015312040.1。這個基因用引物從相應的基因組DNA中通過PCR獲取，并通過SimpleCloning(You,C.,etal.(2012),"SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應的表達載體pET20b-SP。這個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質表達與純化(QiP,YouC,ZhangYHP:One-PotEnzymaticConversionofSucrosetoSyntheticAmylosebyusingEnzymeCascades.ACSCatal.2014,4:1311-1317.)葡萄糖異構酶是來自于Sigma公司的產品，產品編號為G4166；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1。聚磷酸葡萄糖激酶來源于ThermobifidafuscaYX，基因在KEGG上的編號為Tfu1811；這個基因用引物從相應的基因組DNA中通過PCR獲取，這個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并通過SimpleCloning(You,C.,etal.(2012))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應的表達載體。這個質粒都轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質表達與純化(LiaoHH,MyungS,ZhangY-HP.2012.One-steppurificationandimmobilizationofthermophilicpolyphosphateglucokinasefromThermobifidafuscaYX:glucose-6-phosphategenerationwithoutATPAppl.Microbiol.Biotechnol.93:1109-1117)。葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構酶、6-磷酸塔格糖差向異構酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實驗例1。在一個0.75毫升的反應體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，300g/L蔗糖，5mM的二價鎂離子，30U/mL的蔗糖磷酸化酶，30U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，30U/mL的葡萄糖磷酸異構酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，30U/mL的葡萄糖異構酶，150U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，300mM聚磷酸鈉，在37℃進行催化反應，反應72個小時。最終塔格糖的終濃度為188g/L，轉化率達到了63％，HPLC圖如5所示。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3