本發(fā)明涉及動物病原分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的豬的一種急性、熱性和高度接觸性呼吸道疾病，多呈流行性發(fā)生，臨床上以突發(fā)高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭甚至死亡為特征。一般是突然發(fā)病，很快感染全群，各個年齡、性別、品種的豬都易感，但很少導(dǎo)致豬的死亡。目前，歐、美、亞、非等世界各大洲均有本病的發(fā)生。SI是一種世界性的豬呼吸道傳染病，也是主要的豬免疫抑制病之一，在規(guī)?；B(yǎng)豬場中普遍存在，難以根除。由于SIV可損害呼吸道上皮細(xì)胞，容易繼發(fā)或混合感染豬繁殖與呼吸綜合征、副豬嗜血桿菌病、豬巴氏桿菌病、豬鏈球菌等呼吸系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致病情變得復(fù)雜，死亡率增高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來更大的危害。

盡管目前尚未在豬群內(nèi)檢測到該流感病毒的流行，但豬是人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的共同宿主，在流感病毒跨種傳播的過程中，可能在豬體內(nèi)發(fā)生基因重排，產(chǎn)生新的病毒株，造成新的流行。此外，人也可以感染豬流感病毒，因此快速準(zhǔn)確的診斷和監(jiān)測豬流感，具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)意義和公共衛(wèi)生學(xué)意義。

豬流感病毒屬于正黏病毒科，A型流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，能引起各種動物以及人類感染甚至死亡，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對人類健康也造成了嚴(yán)重的威脅。其基因組由PB2、PB1、PA、HA、NP、HA、NA、M、NS 8個片段組成，共編碼11種蛋白質(zhì)。A型流感病毒(Influenza virus A)為單股負(fù)鏈RNA病毒，依據(jù)其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差異，可分為17種HA亞型和10種NA亞型。

近些年，SIV對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，引起養(yǎng)豬業(yè)的普遍關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者建立了病毒分離、血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)、酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)、瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)等多種方法用于SIV的檢測。目前應(yīng)用最為廣泛的檢測方法為PCR檢測方法。實時熒光定量RT-PCR技術(shù)(real-time fluorescence quantitative PCR，QPCR)是在常規(guī)RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種較新的核酸檢測技術(shù)，具備快速、特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性和靈敏度更高的特點，具有實時性，2-3小時便能得出結(jié)果，且不需要PCR后處理，有效降低了過程的污染。

臍帶是哺乳類動物連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，由兩條動脈和一條靜脈構(gòu)成，是連接母體和子體的天然通道。臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，在胎盤屏障的作用下大分子物質(zhì)通常不能從母體進(jìn)入臍帶血中，因此健康仔豬臍帶血中不含有任何抗體，但病毒、內(nèi)毒素等小分子顆粒能夠透過胎盤屏障進(jìn)入臍帶血中，從而垂直傳播給仔豬。

豬臍帶血檢測技術(shù)具有采樣方便、安全省時、不影響生產(chǎn)等優(yōu)點。結(jié)合仔豬臍帶血檢測的優(yōu)勢，實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果可同時反映母豬、仔豬SIV帶毒狀況，可對豬群SIV感染和免疫情況進(jìn)行早期預(yù)警評判，進(jìn)一步有助于豬場做好豬流感的防控工作，降低養(yǎng)殖風(fēng)險。因此，研制一種檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR方法，并基于此方法開發(fā)檢測試劑盒非常有必要，且應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點，能同時反映母、仔豬SIV帶毒狀況，評估母豬疫苗的免疫效果，有益于對豬群SIV感染和免疫情況的早期預(yù)警評判，進(jìn)一步有助于豬場做好該疾病的防控工作。

基于上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：

上游擴(kuò)增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴(kuò)增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

特異性熒光探針：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:1。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.1～0.6μM。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)及說明書。

在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光RT-PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)液中還含有dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶和一些增強(qiáng)成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具體的增強(qiáng)成分根據(jù)實際需要進(jìn)行添加。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無DNA酶的ddH₂O；所述陽性對照為含有豬流感病毒M基因序列的克隆質(zhì)粒T-SIV-M，克隆質(zhì)粒T-SIV-M的終濃度為1×10⁵copies/μL～1×10⁷copies/μL。

合理的引物和熒光探針設(shè)計是成功應(yīng)用實時熒光RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測結(jié)果的判定。

豬流感病毒本身極易變異，而這種變異的分子生物學(xué)基礎(chǔ)主要是由病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的基因重排而造成，所以在這兩個基因序列中很難找出合適的保守基因用于豬流感多種亞型的實時熒光RT-PCR擴(kuò)增。豬流感病毒的基質(zhì)蛋白(M)基因相對保守并具有種群特異性，因此在M基因序列中找出一段保守型基因作為實時熒光RT-PCR擴(kuò)增的靶基因，并使其用于各個亞型豬流感病毒的快速診斷，并且選取M基因作為擴(kuò)增的模板能兼顧同亞型不同毒株之間的保守序列，保證了檢測方法的通用性。

本發(fā)明從豬流感病毒全長M基因上篩選出一段基因片段，該基因片段在豬流感病毒非常保守，大小為142bp，發(fā)明人針對該保守片段設(shè)計了多對引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明引物和探針的特異性強(qiáng)，能有效從臍帶血、血液與組織樣品中檢測到包括H1和H3亞型流行株在內(nèi)的A型豬流感病毒。

本發(fā)明所提供的擴(kuò)增引物對及TaqMan熒光探針可檢測不同來源的A型流感病毒，尤其適合檢測A型豬流感病毒。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬流感病毒M基因的核苷酸序列如下所示：

5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGAAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGT-3’，其為SEQ ID NO:4所示。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒T-SIV-M采用以下方法制備得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列擴(kuò)增豬流感病毒M基因序列，膠回收目的片段后與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為T-SIV-M。

克隆質(zhì)粒T-SIV-M的構(gòu)建步驟具體如下：

(1)用Invitrogen TRIzol提取H1N1亞型SIV的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作為特異性引物擴(kuò)增豬流感病毒M基因序列，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min；PCR產(chǎn)物于3％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；

(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用Omega DNA Gel Excraction Kit膠回收試劑盒回收，然后與pEASY-T1克隆載體進(jìn)行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含AMP、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h；挑選菌落用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送擎科生物測序，測序后進(jìn)行序列比對，正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為T-SIV-M。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，用于檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒時，反應(yīng)體系以20μL計為：

熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：15μL；

10μMSEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針：0.2μL～0.4μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：補(bǔ)足至20μL。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，用于檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒時，實時熒光RT-PCR的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。

在本發(fā)明中，實時熒光RT-PCR結(jié)果分析：在陰性對照檢測無Ct值，陽性對照檢測Ct值≤30時，則結(jié)果判定成立。

結(jié)果分析：檢測樣品有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，則判斷樣品為豬流感病毒感染陽性；若檢測樣品35<Ct值≤40，表明病毒載量低，標(biāo)注可疑，并進(jìn)行重復(fù)檢測，若重復(fù)檢測結(jié)果仍為35<Ct值≤40，則判斷樣品為豬流感病毒感染陰性；Ct值≤35，則判斷樣品為豬流感病毒陽性。

在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光RT-PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)液中還含有dNTPs、MgCl₂、反轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶的混合物。

在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值，對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，引物濃度過低會影響擴(kuò)增效率，引物濃度過高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且增加引物之間形成二聚體的機(jī)會，同樣特異性熒光探針濃度過低會引起特異性的熒光信號變?nèi)?，而濃度過高則會引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號從而干擾特異性熒光信號，待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度會影響RT-PCR擴(kuò)增的效率，應(yīng)根據(jù)目的基因的大小選擇合適的RNA模板濃度。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗，最終確定本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的實時熒光RT-PCR方法檢測豬流感病毒的擴(kuò)增效率接近100％，并可獲得最小的Ct值。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒試劑中的用途。

本發(fā)明將豬流感病毒的M基因和TaqMan探針相結(jié)合，在豬流感病毒的M基因選取保守區(qū)設(shè)計特異性引物和特異性探針，通過對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度以及特異性熒光探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR方法。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10¹copies/μL，可以從豬流感病毒感染臍帶血中檢測到最低10copies的豬流感病毒核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍。特異性試驗結(jié)果表明，該方法對豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典株和變異株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬乙型腦炎病毒等常見傳染病的病原體均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。重復(fù)性試驗結(jié)果表明，10⁷copies/μL濃度的陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.035，10³copies/μL濃度的陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.01，具有較好的重復(fù)性。

綜上所述，本發(fā)明建立的檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR方法和基于該方法建立的試劑盒具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)和重復(fù)性優(yōu)的特點，可以用于豬流感病毒感染的病原學(xué)研究、早期診斷，對豬流感病毒的快速診斷、綜合防控、病原凈化和早期治療具有重要意義。

本發(fā)明應(yīng)用實時熒光RT-PCR檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨立血液循環(huán)系統(tǒng)之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的，即不存在任何病原的相關(guān)基因片段，因此，可通過檢測“臍帶血”中是否存在豬流感病毒核酸來判斷無癥狀母豬的帶毒情況，亦可以預(yù)警仔豬感染豬流感病毒的風(fēng)險。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)實時熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物和探針進(jìn)行；(5)判定結(jié)果。

本發(fā)明還提供了一種臍帶血的采集方法，具體步驟如下：

(1)取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

(2)當(dāng)仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可；若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊、死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；

(3)臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；

(4)將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。

本發(fā)明臍帶血的采集方法克服現(xiàn)有常規(guī)采血技術(shù)的耗時長、采血困難、對豬只應(yīng)激大等問題，能夠快速、簡便地進(jìn)行臍帶血的采集。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術(shù)耗時長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測快速高效，不會造成樣品交叉污染，同時達(dá)到母仔豬同時監(jiān)測的目的。

(2)本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實現(xiàn)大通量樣品的檢測。

(3)本發(fā)明的檢測方法適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，同時還適用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。

(4)本發(fā)明運用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)，通過一個PCR反應(yīng)，就可以從臍帶血、血液與組織樣品中檢測出是否有豬流感病毒存在，快捷迅速、節(jié)約成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果圖，其中A圖為陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒10⁷copies/μl濃度的重復(fù)性檢測結(jié)果，B圖為陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒10³copies/μl濃度的重復(fù)性檢測結(jié)果；

圖4為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實施例1

1.臍帶血的采集

a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

b.當(dāng)仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；

注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；

c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；

d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。

提取臍帶血中RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA保存在-80℃，cDNA保存在-20℃，備用。

2.引物和熒光探針的設(shè)計和制備

在GenBank基因庫中查找50株A型SIV毒株的M基因序列，經(jīng)序列比對選取其保守區(qū)域，針對該保守片段設(shè)計了多對引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出一對特異性擴(kuò)增引物和一條特異性熒光探針，序列如下：上游擴(kuò)增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游擴(kuò)增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

特異性熒光探針：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因(SEQ ID NO:3)。

上述引物由華大基因合成并進(jìn)行標(biāo)記。

3.陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建與制備

(1)用Invitrogen Trizol方法提取A型SIV的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作為特異性引物擴(kuò)增豬流感病毒的M基因序列，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min；PCR產(chǎn)物于3％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；

(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用Omega DNA Gel Excraction Kit膠回收試劑盒回收，然后與pEASY-T1克隆載體進(jìn)行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含AMP、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h；挑選菌落用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送擎科生物測序，測序后進(jìn)行序列比對，正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為T-SIV-M。

克隆質(zhì)粒T-SIV-M用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ質(zhì)粒小提試劑盒提取，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。用Thermo Nanodrop2000超微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并記錄OD260和OD280的比值，然后按照公式換算為質(zhì)?？截悢?shù)，克隆質(zhì)粒T-SIV-M終濃度為1×10⁵copies/μl～1×10⁷copies/μl。

其中，豬流感病毒M基因片段的大小為142bp，核苷酸序列如下所示：

5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGAAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGT-3’(SEQ ID NO:4)。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將T-SIV-M克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其為：10⁸copies/μl-10⁰copies/μl，每個梯度重復(fù)三次進(jìn)行實時熒光定量PCR。根據(jù)實驗結(jié)果選取10⁸copies/μl–10²copies/μl7個點制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋梯度制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.28240，截距：39.00093，相關(guān)系數(shù)：-0.99917，擴(kuò)增效率：1.01676。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.98，斜率位于-3.1－-3.6之間，PCR擴(kuò)增效率E位于0.9－1.1之間。

5.檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒的組成：

(1)熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；

(2)擴(kuò)增引物組包括上游擴(kuò)增引物和下游擴(kuò)增引物：

上游擴(kuò)增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游擴(kuò)增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

(3)特異性熒光探針：

特異性熒光探針：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因(SEQ ID NO:3)；

本發(fā)明從豬流感病毒全長M基因上篩選出一段基因片段，該基因片段在豬流感病毒非常保守，大小為142bp，發(fā)明人針對該保守片段設(shè)計了多對引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明引物和探針的特異性強(qiáng)，能有效從臍帶血、血液與組織樣品中檢測到包括H1和H3亞型流行株在內(nèi)的A型豬流感病毒。

(4)陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒；

(5)陰性對照為無DNAase的ddH₂O；

(6)使用說明書。

6.用上述試劑盒檢測仔豬臍帶血中的豬流感病毒

(1)實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：為了得到擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，對影響實時熒光定量RT-PCR的4個因素(上游引物、下游引物、探針、模板)分別進(jìn)行單因子多水平的優(yōu)化試驗。熒光RT-PCR反應(yīng)的主要因素水平見表1。

表1實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)的因素與水平

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，確定熒光RT-PCR單個反應(yīng)體系(20μL)為：熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)15μL；10μM SEQ ID NO:1所示的上游引物：0.6μL，10μM SEQ ID NO:2所示的下游引物：0.6μL，10μM SEQ ID NO:3所示的熒光探針：0.4μL；待檢臍帶血中提取的RNA模板：2μL；使用ddH₂O補(bǔ)足至20μL。同時設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒：2μL，其余組分相同；陰性對照無DNA酶的ddH₂O：2μL，其余組分相同。

(2)實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)步驟：按照上述配比將各組分加入到0.2mL PCR擴(kuò)增管中，瞬時離心(3000rpm)10秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò)增：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。

7.結(jié)果分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：每次試驗的過程都要加入陽性對照及陰性對照。在陰性對照檢測無Ct值，陽性對照檢測Ct值≤30時，則結(jié)果判定成立。即陽性結(jié)果出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，并且制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，相關(guān)系數(shù)R²大于0.98，斜率位于-3.1－-3.6之間，PCR擴(kuò)增效率E位于0.9－1.1之間。

檢測樣品有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，則判斷樣品為豬流感病毒感染陽性；若檢測樣品35<Ct值≤40，表明病毒載量低，標(biāo)注可疑，并進(jìn)行重復(fù)檢測，若重復(fù)檢測結(jié)果仍為35<Ct值≤40，則判斷樣品為豬流感病毒感染陰性；Ct值≤35，則判斷樣品為豬流感病毒感染陽性。

實施例2靈敏性研究

以陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒評價本發(fā)明試劑盒的靈敏性，將T-SIV-M克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，檢測范圍為10⁸-10⁰copies/μl。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10¹copies/μl，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏性可以檢測到10個拷貝的病毒含量的樣品。靈敏性試驗結(jié)果見圖2。

實施例3重復(fù)性研究

選用陽性對照T-SIV-M克隆質(zhì)粒10⁷copies/μl和10³copies/μl 2個高低濃度梯度，對每個濃度的樣本做4個重復(fù)，結(jié)果10⁷copies/μl濃度Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.035，10³copies/μl濃度Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.01，具有較好的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表2和圖3。

表2熒光定量RT-PCR檢測豬流感病毒的重復(fù)性試驗

實施例4特異性研究

為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典株和變異株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬乙型腦炎病毒共9種病毒。

檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對仔豬臍帶血中的豬流感病毒進(jìn)行擴(kuò)增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴(kuò)增豬流感病毒，而不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測結(jié)果見圖4。

綜上可見，本發(fā)明設(shè)計的一對特異性引物和一條熒光探針以及構(gòu)成的實時熒光RT-PCR試劑盒可以快速鑒定仔豬臍帶血中的豬流感病毒，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、重復(fù)性優(yōu)，檢測結(jié)果真實可靠。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司

<120>一種檢測仔豬臍帶血中豬流感病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒及其用途

<130> FI160701-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

caatcttgtcacctctgact aa 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

actgctctatccatgttgtt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

cagtcctcgctcactgggca 20

<210> 4

<211> 142

<212> RNA

<213> SIV M基因序列

<400> 4

caatcttgtcacctctgactaagggaattttgggatttgtattcacgctcaccgtgccca 60

gtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccctaaatggaaatggggacc 120

cgaacaacatggatagagcagt 142