一種海膽抗菌肽及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種海膽抗菌肽及其制備方法，包括構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)菌株和培養(yǎng)分泌型重組酵母表達(dá)菌株兩步，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，分泌型重組酵母表達(dá)菌株將表達(dá)的海膽抗菌肽蛋白分泌到培養(yǎng)液中，抗菌肽的含量可以高達(dá)210mg/L，且對(duì)致病性鰻弧菌顯示出較好的抑制活性；而通過(guò)該方法生產(chǎn)的抗菌肽酵母制劑不需要提純，抑菌活性更強(qiáng)，可以直接在養(yǎng)殖水環(huán)境中使用，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種海膽抗菌肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海膽抗菌肽及其制備方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，抗生素、化學(xué)藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷出現(xiàn)，一些感染性疾病嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。抗菌肽是一類(lèi)具有抗菌活性，對(duì)真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及一些包膜病毒都表現(xiàn)出顯著活性，但對(duì)正常的哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞卻無(wú)明顯的毒副作用。
[0003]現(xiàn)有的海膽抗菌肽由于其在組織中含量低，很難利用分離提取的方法獲得大量天然抗菌肽，而人工合成多肽的成本高，同樣限制了抗菌肽的應(yīng)用，通過(guò)基因工程方法進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，成本低廉，更容易在生產(chǎn)上推廣，但現(xiàn)在分子克隆生產(chǎn)的海膽抗菌的表達(dá)量和活性都相對(duì)不高，因此提高重組表達(dá)的抗菌肽活性是解決抗菌肽大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種海膽抗菌肽，抗菌肽活性更強(qiáng)，同時(shí)提供上述海膽抗菌肽的制備方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]一種海膽抗菌肽，其氨基酸序列為:
[0007]Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp`[0008]Val Tyr Ser Cys Asp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys
[0009]Lys Asn Cys Cys His Arg Lys Phe Phe Gly Lys Tyr He Leu Lys
[0010]Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys0
[0011]上述一種海膽抗菌肽的制備方法，其制備方法如下:
[0012]1.構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)菌株:根據(jù)海膽抗菌肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)出海膽抗菌肽的基因序列，選用畢赤酵母的偏嗜密碼子，通過(guò)SOE法合成海膽抗菌肽的基因片段，所述基因全長(zhǎng)為ISObp ;將海膽抗菌肽的基因片段克隆入pPICZa -A質(zhì)粒，從而得到分泌型重組酵母的表達(dá)載體PPICZ a -A-SK，將表達(dá)載體pPICZ a -A-SK通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，構(gòu)建得到分泌型重組酵母表達(dá)菌株；
[0013]2.培養(yǎng)分泌型重組酵母表達(dá)菌株:將構(gòu)建得到的分泌型重組酵母表達(dá)菌株加入培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加培養(yǎng)基體積2%的甲醇，培養(yǎng)72h后，海膽抗菌肽即可獲得高效表達(dá)，分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為200-250r/min，培養(yǎng)溫度為28 — 31°C。
[0014]上述一種海膽抗菌肽的制備方法，其中，所述的培養(yǎng)基各組分按質(zhì)量百分比計(jì)的比例為:酵母粉0.2-3%、蛋白胨1-3%、葡萄糖1-2%、雙蒸水92-97.8%，所述培養(yǎng)基的PH值為
6.0。
[0015]上述一種海膽抗菌肽的制備方法，其中，所述的海膽抗菌肽的基因序列為:[0016]atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat
[0017]gtt act tct tgt gat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa
[0018]aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt ttt ggt aaa act att ttg aaa
[0019]get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaa tga
[0020]本發(fā)明的有益效果為:
[0021]1.在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,分泌型重組酵母表達(dá)菌株將表達(dá)的海膽抗菌肽蛋白分泌到培養(yǎng)液中，抗菌肽的含量可以高達(dá)210mg/L，且對(duì)致病性鰻弧菌顯示出較好的抑制活性；對(duì)抗菌肽進(jìn)行抑菌效果的研究，并將其抑菌效果與優(yōu)化前的海膽抗菌肽進(jìn)行對(duì)t匕，其抑菌圈直徑分別為1.1cm和1.3cm,比優(yōu)化前增加了 0.2cm，抑菌效率增加18.18%，而通過(guò)該方法生產(chǎn)的抗菌肽酵母制劑不需要提純，抑菌活性更強(qiáng)，可以直接在養(yǎng)殖水環(huán)境中使用，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低。
[0022]2.分泌型重組酵母表達(dá)菌株將表達(dá)的海膽抗菌肽在原來(lái)的天然海膽抗菌肽的成熟肽段后面加上6個(gè)賴(lài)氨酸，增強(qiáng)多肽C端的正電荷數(shù)，使抗菌肽更容易牢固的吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜的表面。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0024]實(shí)例一
[0025]一種海膽抗菌肽的制備方法，其制備過(guò)程如下:`[0026]1.構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)菌株:根據(jù)海膽抗菌肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)出海膽抗菌妝的基因序列，，所述的海膽抗菌妝的基因序列為:
[0027]atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat
[0028]gtt act tct tgt gat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa
[0029]aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt ttt ggt aaa act att ttg aaa
[0030]get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaa tga，選用畢赤酵母的偏嗜密碼子，通過(guò)SOE法合成海膽抗菌肽的基因片段，所述基因全長(zhǎng)為ISObp ；將海膽抗菌肽的基因片段克隆入pPICZ a -A質(zhì)粒，從而得到分泌型重組酵母的表達(dá)載體pPICZ a -A-SK，將表達(dá)載體pPICZ a -A-SK通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，構(gòu)建得到分泌型重組酵母表達(dá)菌株；
[0031]2.培養(yǎng)分泌型重組酵母表達(dá)菌株:將構(gòu)建得到的分泌型重組酵母表達(dá)菌株加A BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加培養(yǎng)基體積2%的甲醇，培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為200-250r/min,培養(yǎng)溫度為29°C，培養(yǎng)72h后，海膽抗菌肽即可獲得高效表達(dá)，分泌到發(fā)酵液中。
[0032]通過(guò)以上方法制得的海膽抗菌肽，其氨基酸序列為:
[0033]Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp Val Tyr SerCys Asp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys Lys Asn Cys Cys His Arg Lys PhePhe Gly Lys Tyr He Leu Lys Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys LysLys
[0034]在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,分泌型重組酵母表達(dá)菌株將表達(dá)的海膽抗菌肽蛋白分泌到培養(yǎng)液中，抗菌肽的含量可以高達(dá)210mg/L，且對(duì)致病性鰻弧菌顯示出較好的抑制活性；對(duì)抗菌肽進(jìn)行抑菌效果的研究，并將其抑菌效果與優(yōu)化前的海膽抗菌肽進(jìn)行對(duì)比，其抑菌圈直徑分別為1.1cm和1.3cm,比優(yōu)化前增加了 0.2cm，抑菌效率增加18.18%，而通過(guò)該方法生產(chǎn)的抗菌肽酵母制劑不需要提純，抑菌活性更強(qiáng)，可以直接在養(yǎng)殖水環(huán)境中使用，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低。分泌型重組酵母表達(dá)菌株將表達(dá)的海膽抗菌肽在原來(lái)的天然海膽抗菌肽的成熟肽段后面加上6個(gè)賴(lài)氨酸，增強(qiáng)多肽C端的正電荷數(shù)，使抗菌肽更容易牢固的吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜的表面 [0035]這里本發(fā)明的描述和應(yīng)用是說(shuō)明性的，并非想將本發(fā)明的范圍限制在上述實(shí)施例中，因此，本發(fā)明不受本實(shí)施例的限制，任何采用等效替換取得的技術(shù)方案均在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種海膽抗菌肽，其氨基酸序列為:
Met Trp Asn Pro Phe Arg Lys Leu Tyr Arg Lys Glu Cys Asn Asp Val Tyr Ser CysAsp Tyr Val Ser Gly Val Lys Tyr Cys Tyr Lys Lys Asn Cys Cys His Arg Lys Phe PheGly Lys Tyr He Leu Lys Ala Pro Glu Cys Tyr Val He Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys0
2.如權(quán)利要求1所示的一種海膽抗菌肽的制備方法，其制備方法如下: (1)構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)菌株:根據(jù)海膽抗菌肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)出海膽抗菌肽的基因序列，選用畢赤酵母的偏嗜密碼子，通過(guò)SOE法合成海膽抗菌肽的基因片段，所述基因全長(zhǎng)為ISObp ;將海膽抗菌肽的基因片段克隆入pPICZ a -A質(zhì)粒，從而得到分泌型重組酵母的表達(dá)載體pPICZa -A-SK，將表達(dá)載體pPICZa -A-SK通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，構(gòu)建得到分泌型重組酵母表達(dá)菌株； (2)培養(yǎng)分泌型重組酵母表達(dá)菌株:將構(gòu)建得到的分泌型重組酵母表達(dá)菌株加入培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加培養(yǎng)基體積2%的甲醇，培養(yǎng)72h后，海膽抗菌肽即可獲得高效表達(dá)，分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為200-250r/min，培養(yǎng)溫度為28 — 31°C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種海膽抗菌肽的制備方法，其特征為，所述的培養(yǎng)基各組分按質(zhì)量百分比計(jì)的比例為:酵母粉0.2-3%、蛋白胨1-3%、葡萄糖1-2%、雙蒸水92-97.8%，所述培養(yǎng)基的PH值為6.0。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種海膽抗菌肽的制備方法，其特征為，所述的海膽抗菌肽的基因序列為:
atg tgg aat cca ttt aga aaa ttg tat aga aaa gaa tgt aat gat gtt act tct tgtgat act gtt tct ggt gtt aaa act tgt act aaa aaa aat tgt tgt cat aga aaa ttt tttggt aaa act att ttg aaa get cca gaa tgt act gtt att tct aaa aaa aaa aaa aaa aaatga。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103641900SQ201310518822
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】遲恒, 丁善忠 申請(qǐng)人:遲恒