本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物
技術領域：
，具體涉及一種用于亨廷頓病診斷的基因及其應用以及由其編碼的蛋白和蛋白的應用。
背景技術：
：亨廷頓病(Huntington'sdisease,HD)為一種遲發(fā)性神經退行性遺傳病，以舞蹈樣癥狀為典型表現的進行性加重的運動障礙、認知功能衰退及精神疾病癥狀為臨床特征，本病呈世界性分布，發(fā)生于所有的種族，人群患病率約為5/10萬，發(fā)病年齡一般為30～50歲，發(fā)病后15～20年死亡。該病主要侵害基底神經節(jié)和大腦皮質，具有高度的區(qū)域選擇性。基底神經節(jié)運動通路受損引發(fā)運動過度，即產生亨廷頓病的主要臨床癥狀—舞蹈樣動作；同時大腦皮層受損導致患者認知功能障礙，晚期亨廷頓病癥多見癡呆。目前，亨廷頓病的治療方法以經驗性對癥支持治療為主，對舞蹈樣癥狀的控制可采用丁苯那嗪或奧氮平等第2代抗精神病藥物；抑郁等精神癥狀的改善多借助抗抑郁藥；認知功能障礙則以心理療法加以干預。然而上述方法僅對善患者生活質量有一定作用，并不能延緩病程進展，許多大樣本系統(tǒng)性回顧研究也顯示，目前應用于臨床的各種藥物對亨廷頓病的治療效果并不明確。因此，如何另辟蹊徑，尋找更為有效并能從根本上阻遏疾病進展的治療方法，成為諸多研究探索的焦點。1993年，HD協作研究小組找到了HD基因，將其定位于4p16.3，并且揭示it15基因的不穩(wěn)定突變是HD的遺傳學基礎。HD發(fā)病是it15基因外顯子1的CAG三核苷酸重復序列的異常擴增，引發(fā)其編碼的亨廷頓蛋白(Huntington'sHtt)內多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)延長產生。健康人的兩個等位基因可含有6～25個CAG三聯體，而在HD患者中，突變的等位基因中卻含有36～120個CAG三聯體。It15基因CAG系列重復導致正常的野生型亨廷頓蛋白(WildHuntingtin,wHtt)缺失和異常的突變型亨廷頓蛋白(MutantHuntingtin,mHtt)的產生。迄今，HD研究取得令人矚目的成就，但發(fā)病機制仍然不清，尚無有效療法。因為亨廷頓病(HD)是一種單基因常染色體顯性遺傳性神經系統(tǒng)變性疾病，其致病基因是位于染色體4p16.3的it15基因，因此該病的基因診斷方法是運用PCR方法檢測ITl5基因中的CAG重復序列數，作為對HD進行確定診斷的主要根據，當其拷貝數目>40次時即具備完全外顯率。臨床上，亨廷頓病(HD)診斷的主要根據是：該病多在中年起病，具有三大臨床特征即舞蹈樣動作、精神異常、癡呆，陽性家族史，病情進行性發(fā)展。PET和MRI、fMRI檢查結果可助診。頭顱CT或MRI檢查可發(fā)現部分患者的尾狀核頭部、殼核以及大腦皮質萎縮，腦室擴大，尾狀核萎縮程度與疾病的嚴重程度有關。PET檢查發(fā)現患者腦內局部葡萄糖代謝率(localcerebralmetabolicrateofGlucose，LCMRGlu)在基底節(jié)明顯減少。也有研究提示，HD在臨床作出診斷的前幾年已出現基底節(jié)代謝異常。應用fMRI檢測能較早發(fā)現異常。然而，由于近來發(fā)現HD突變的不穩(wěn)定性、對HD缺乏有效的治療、中年起病、不同病因所致的相似表現等均使HD的臨床診斷復雜化。近年來，血清蛋白質組學理論與技術的出現為尋找包括神經退行性疾病在內的多種疾病有效的臨床生物學標志物提供了全新的方法。其中，同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技術為解決低豐度蛋白的定性、定量研究提供了有效方法。。技術實現要素：本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種可用于亨廷頓病(HD)診斷的分子標志物基因Pebp1。相比傳統(tǒng)的亨廷頓病(HD)的診斷方法，使用基因標志物來診斷亨廷頓病(HD)具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應的預防和治療措施，可應用于亨廷頓病的診斷和治療。本發(fā)明還提供了以后總用于亨廷頓病(HD)診斷的蛋白PEBP1蛋白，利用蛋白的表達水平來診斷亨廷頓病(HD)具有及時性、特異性和靈敏性。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于亨廷頓病診斷的基因，所述用于亨廷頓病診斷的基因為Pebp1基因，所述Pebp1基因的編碼序列為以下a、b、c中的任意一種：a、SEQIDNo.1所示的DNA序列；b、在嚴格條件下與所述a限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；c、與所述a或b限定的序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。進一步優(yōu)選的，與所述a或b限定的序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。在本發(fā)明的上下文中，“Pebp1基因”包括人Pebp1基因以及與人基因的任何功能等同的多核苷酸。Pebp1基因包括與目前國際公共核酸序列數據庫中Pebp1基因(NCBIGenebankaccessionNo.NM_002567.3)DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種權利要求1所述的用于亨廷頓病診斷的基因在制備亨廷頓病的檢測試劑盒或芯片中的應用。上述的應用，優(yōu)選的，所述檢測試劑盒包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列為SEQIDNO.3所示的序列，所述反向引物的序列為SEQIDNO.4所示的序列。上述的應用，優(yōu)選的，所述芯片包括固相載體及固定在固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針為用于檢測Pebp1基因轉錄水平的寡核苷酸探針。所述寡核苷酸探針的序列為SEQIDNO.7所示的序列，具體為：5’TGAGCCTGCAAGAAGTGGACGAGC3’。上述的應用，優(yōu)選的，包括檢測試劑盒包括為通過RT﹣PCR、實時定量PCR、免疫檢測、核酸雜交或芯片檢測Pebp1基因的表達水平以診斷亨廷頓病的產品。進一步，所述用RT﹣PCR診斷亨廷頓病的產品至少包括一對特異擴增Pebp1基因的引物；所述用實時定量PCR診斷亨廷頓病的產品至少包括一對特異擴增Pebp1基因的引物；所述用免疫檢測診斷亨廷頓病的產品包括：與PEBP1蛋白特異性結合的抗體；所述用核酸雜交診斷亨廷頓病的產品包括：與Pebp1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷亨廷頓病的產品包括：蛋白質芯片和基因芯片；其中，蛋白質芯片包括與PEBP1蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與Pebp1基因的核酸序列雜交的探針。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種上述的用于亨廷頓病診斷的基因在制備治療亨廷頓病藥物中的應用。所述的藥物包括含有Pebp1基因表達產物的抑制劑。進一步，所述抑制劑為抑制Pebp1基因表達產物活性的物質。上述的藥物還包括藥學上可接受的載體，這類載體包括但并不限于稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑，如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯毗咯烷酮；濕潤劑，如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑季鉸化合物；表面活性劑，如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇等。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種上述的用于亨廷頓病診斷的基因編碼的蛋白，所述蛋白為PEBP1蛋白，所述PEBP1蛋白的氨基酸序列為以下A、B、C中的任意一種：A、SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；B、將SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經過1～50個氨基酸殘基的取代和/或缺失和或添加且與SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白質；C、與SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性。更優(yōu)選地，與SEQIDNo.2所示的氨基酸序列至少約90至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構成的多肽。在本發(fā)明的上下文中，Pebp1基因表達產物包括人PEBP1蛋白以及人PEBP1蛋白的部分肽。所述蛋白的部分肽含有與亨廷頓病(HD)相關的功能域。“PEBP1蛋白”包括人PEBP1蛋白以及人PEBP1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人PEBP1蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與人Pebp1基因的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質。通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中氨基酸的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質的例子是PEBP1蛋白的融合蛋白。對于與PEBP1蛋白融合的肽或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留PEBP1蛋白的生物學活性即可。本發(fā)明的蛋白也包括對SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經過修飾的蛋白質仍然能夠保留PEBP1蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變的氨基酸數目通常是10個或者更少，例如7個或者更少，例如3個或者更少。一種上述的蛋白在制備檢測亨廷頓病的檢測試劑盒或芯片中的應用。上述的應用，優(yōu)選的，所述檢測試劑盒包括與PEBP1蛋白特異性結合的抗體。上述的應用，優(yōu)選的，所述芯片包括固相載體和固定在固相載體上與PEBP1蛋白特異性結合的抗體。進一步，所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述PEBP1蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾。例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2等。只要所述片段能夠保留與PEBP1蛋白的結合能力即可。用于蛋白質水平的抗體的制備是本領域技術人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種上述的用于亨廷頓病診斷的基因編碼的蛋白在制備治療亨廷頓病藥物中的應用。上述的應用，優(yōu)選的，所述藥物為針對PEBP1蛋白的單克隆抗體。上述的應用，優(yōu)選的，所述藥物為基于PEBP1抗原蛋白的疫苗。檢測樣本可以是病人的血液樣本或者其他體液樣本。其中體液樣本包括腦脊液。在本發(fā)明的上下文中，“診斷亨廷頓病(HD)”既包括判斷受試者是否已經患有亨廷頓病、也包括判斷受試者是否存在患有亨廷頓病(HD)的風險。在本發(fā)明的上下文中，“治療亨廷頓病(HD)”從疾病的狀態(tài)變化來分，可以包括疾病的緩解、疾病的完全治愈。從藥物發(fā)揮的作用不同，可以包括抑制mHtt聚合物的形成、保護線粒體功能、抑制乙酰膽堿降解、拮抗多巴胺受體或降低多巴胺活性以及增加腦內GABA含量和抑制谷氨酰胺釋放。與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明首次發(fā)現了Pebp1基因的表達水平與亨廷頓病(HD)相關，通過檢測受試者血液/腦脊液中的Pebp1基因的表達情況，可以判斷受試者是否患有亨廷頓病(HD)、或者判斷受試者是否存在患有亨廷頓病(HD)的風險，從而指導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治療方案。(2)本發(fā)明提供了一種由Pebp1基因編碼的PEBP1蛋白，通過檢測受試者血液/腦脊液中的PEBP1蛋白的表達情況，可以判斷受試者是否患有亨廷頓病(HD)、或者判斷受試者是否存在患有亨廷頓病(HD)的風險，從而指導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治療方案。(3)本發(fā)明發(fā)現了一種新的分子標記物基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，蛋白質組學技術檢測更及時、更特異、更靈敏，能夠實現亨廷頓病(HD)的早期診斷，從而降低亨廷頓病(HD)的死亡率。附圖說明為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。圖1為本發(fā)明實施例2中利用實時定量PCR檢測Pebp1基因在亨廷頓病(HD)患者血液中的表達情況。圖2為本發(fā)明實施例3中為利用免疫印跡檢測驗證PEBP1蛋白分別在亨廷頓病(HD)患者和正常人血液中的表達情況。圖3為本發(fā)明實施例3中為利用免疫印跡檢測驗證PEBP1蛋白分別在亨廷頓病(HD)患者和正常人血液中的蛋白表達量的平均值。具體實施方式以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1：基于iTRAQ技術的蛋白質組學方法篩選與亨廷頓病相關的蛋白標志物(1)樣品收集和分組1.1分別收集10例正常人血液和10例亨廷頓病患者血液樣本，于﹣80℃冰箱中儲存，上述所有標本的取得均通過倫理委員會的同意。1.2血清樣品的采集和分組取出10對受試者的血清樣品，4℃放置30min后12000g離心5min，取離心后的上清液于EP管仲。每EP管100μL分裝，﹣20℃保存。分別將10名亨廷頓病例組血清樣品混合和10名匹配正常人血清樣品混合，最終獲得1份亨廷頓病例組混合血清樣品和1份匹配正常人混合血清樣品。(2)白蛋白/IgG球蛋白去除。2.1取亨廷頓病例組混合血清樣品和正常人混合血清樣品各60μL，以結合緩沖液(BindingBuffer)10倍稀釋得到預處理樣本。2.2分離柱準備：2.2.1除去柱子上的蓋子，以紙吸去貯存緩沖液。2.2.2除去柱底部的尖咀，放入大小適合的收集管。2.2.3加入850μL結合緩沖液，讓其靠重力流過柱體。2.2.4將柱子放入一個新的大小適合的收集管中。2.3白蛋白/IgG去除：2.3.1加入2.1中預處理樣本，讓其靠重力流過分離柱。2.3.2以600μL結合緩沖液清洗分離柱。2.3.3再次以600μL結合緩沖液清洗分離柱，收集三次結合緩沖液過柱的洗脫組分，即為去除白蛋白/IgG后的蛋白樣本。(3)丙酮沉淀：3.1取100μg去除白蛋白/IgG后的蛋白樣本，按照體積比1∶4的比例緩慢加入預冷的丙酮溶液(丙酮的溫度為﹣20℃)，混勻后在﹣20℃靜置過夜。3.2在4℃，12000g離心30min，棄上清；沉淀用80％丙酮(﹣20℃)洗滌3次，12000g離心10min，棄上清，收集沉淀。3.3將沉淀真空離心干燥，置﹣80℃?zhèn)溆谩?4)Bradford法測定蛋白質濃度4.1以牛血清蛋白為標準品，配制1mg/ml標準蛋白溶液。4.2分別取0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL標準蛋白溶液用PBS(pH7.2)溶液定容至150μL得到溶液1、2、3、4、5、6、7。將溶液1～7加入到2850μL考馬斯亮藍G250溶液中，以考馬斯亮藍G250染色液為空白參比，595nm處測定吸光度A值，用A595為橫坐標，以標準蛋白濃度為縱坐標，繪制標準曲線。4.3測定樣品蛋白時，取5μL待測蛋白溶液(待測蛋白溶液的制備方法：以含6M尿素和2M硫脲的蛋白裂解液溶液3.3的沉淀，混合得到待測蛋白溶液)加入到2995μLG250溶液中，于595nm處測定吸光度值，根據測定的標準曲線計算蛋白濃度。(5)蛋白樣品酶解和標記5.1向100μg步驟3.3的沉淀(即蛋白樣品)加入20μL溶解液(DissolutionBuffer)，1μL變性劑(SDS)，2μL還原劑(iTRAQ試劑盒自帶)，混勻，60℃孵育1小時。5.2加入1μLmethanethiosulfonates(MMTs，iTRAQ試劑盒自帶)，進行半胱氨酸封閉，混勻后室溫孵育10分鐘。5.3加入2μg胰蛋白酶(蛋白∶胰酶＝50∶1)，混勻，37℃孵育12小時。5.4將5.3步驟孵育后的蛋白組分于﹣20℃低溫冷凍干中凍干，并用iTRAQ試劑盒中自帶的30μL0.5MTEAB(triethylammoniumrnonate)緩沖液充分溶解肽段樣品。5.5樣品標記：從﹣20℃分別取出iTRAQ同位素標記標簽，每個蛋白樣品對應一個試劑標簽。向其中分別加入70μL乙醇(iTRAQ試劑盒自帶)充分混勻加入各自對應的肽段樣品中，輕柔混勻并室溫孵育1小時。5.6標記反應結束后，將各組標記好的肽段樣品等量混合，加入10倍體積強陽離子交換BufferA(10mMKH2PO4，25％ACN，PH3.0)，并加入2μL甲酸調節(jié)體系pH＝3.0，于4℃，15000g離心5min，以除去不溶物得到上清液。(6)在線二維nano液相色譜分離混合蛋白酶解液：將步驟5.6得到的上清液(即肽段樣品)于室溫解凍后，震蕩混勻，并于4℃，15000g離心5分鐘，取適量上清于微量進樣瓶，自動進樣器進樣。第一維分離采用強陽離子交換柱(ZORBAXBIO﹣SCXII3.5μm,35×0.3mm，美國Agilent公司)；用NH4Cl進行洗脫，采用8個鹽梯度(分別為10mM、40mM、80mM、100mM、200mM、300mM、500mM、1000mM)。第二維采用C18(ZORBAX300SB﹣C183.5μm,150mm×75μm，Agilent)柱進行反相洗脫，流動相：A相為5％ACN/H2O混合體系(含0.1％FA)；B相為95％ACN/H2O混合體系(含0.1％FA)；反相分離梯度洗脫程序見下表1。表1：nano﹣HPLC流動相梯度編號時間(min)B相(％)流速(nL/min)100300250300315103004853530059080300698903007101030081200300(7)質譜鑒定7.1采用納升電噴霧離子源(NanoESI)，質譜參數設定如下：噴霧電壓1500V；離子源溫度150℃；干燥氣為高純氮氣(純度大于99.999％)，流量2L/min；質譜采集范圍70m/z﹣2500m/z，在350m/z﹣1200m/z范圍內選擇豐度最高的5個母離子做二級碎片掃描，采用動態(tài)排除，動態(tài)排除時間0.2min。7.2質譜數據采集：在DataAnalysis(DataAnalysis4.0版本，美國Agilent公司)中打開每個鹽梯度對應的數據文件，選擇proteinanalysis功能，將質譜數據以mgf文件格式導出；對所有的梯度進行分析，將所得的各個mgf文件合并為一個mgf文件。(8)蛋白質組學的生物學平行設置本實施例分別設置了雙份血清生物樣品的平行重復和儀器檢測的平行重復以保證亨廷頓病蛋白質組學實驗的穩(wěn)定性。生物學平行樣品為將取實驗方法中1.1.血清樣品的采集和分組步驟獲得的亨廷頓病例組混合血清樣品和配對照組混合血清樣品各分為2個樣品，在1.5蛋白樣品酶解和標記步驟中分別將2份亨廷頓病例組混合血清蛋白樣品利用iTRAQ標記試劑盒標記為116，117標記，兩份對照組混合血清蛋白樣品標記為114，115標記，建立血清蛋白樣品的生物學平行重復。儀器檢測的平行重復為對前處理完成后的樣品進行儀器檢測中，每份樣品檢測3次。(9)蛋白質組學數據檢索和差異蛋白的篩選質譜數據檢索使用mascot搜索引擎進行數據庫搜索，采用MS/MS方式，導入mgf數據文件，選擇相應數據庫及搜索參數，進行搜索；選擇數據庫選擇SwissProt(非冗余)數據庫；參數選擇肽片段分子質量容許誤差±0.1Da，二級質譜肽片段分子質量容許誤差±0.05Da，電荷數+2，+3，+4，酶解片段不完全。固定修飾，脲甲基半胱氨酸。可變修飾，氧化；數據以Excel形式導出進行后續(xù)分析。通過將116，117標簽標記的亨廷頓病例組樣本及114，115標簽標記的正常樣本進行兩兩比較，整理3組儀器平行重復結果和2份生物樣品平行重復結果。后續(xù)分析差異蛋白的入選標準：(1)在重復實驗任意一組中具有定量信息；(2)以三組數據蛋白質表達水平比值差異大于等于1.2倍或小于等于0.8倍(即Ratio>＝1.5或Ratio<＝0.8)的蛋白質為差異表達蛋白質。表2為基于iTRAQ技術的質譜分析檢測亨廷頓病(HD)患者與正常人血液中蛋白質差異表達情況，分析的部分在亨廷頓病人血清中表達升高的蛋白質。表2：在亨廷頓病人血清中表達升高的蛋白質統(tǒng)計表：經篩選分析發(fā)現，PEBP1蛋白(Ratio＝1.735)為差異表達蛋白。PEBP1蛋白的核苷酸序列為(SEQIDNO.1)：MPVDLSKWSGPLSLQEVDEQPQHPLHVTYAGAAVDELGKVLTPTQVKNRPTSISWDGLDSGKLYTLVLTDPDAPSRKDPKYREWHHFLVVNMKGNDISSGTVLSDYVGSGPPKGTGLHRYVWLVYEQDRPLKCDEPILSNRSGDHRGKFKVASFRKKYELRAPVAGTCYQAEWDDYVPKLYEQLSGK。與其對應的Pebp1基因的序列為(SEQIDNO.2)：實施例2：一種實施例1的用于亨廷頓病診斷的基因(Pebp1基因)在制備亨廷頓病的檢測試劑盒中的應用，根據蛋白質組學技術的檢測結果選擇Pebp1基因進行大樣本驗證。具體應用方法包括以下步驟：(1)樣本選擇：按照實施例1中的樣本收集方式選擇亨廷頓病患者血液和正常人血液各80例樣品的制備及質量分析。(2)樣品的制備：使用Invitrogen公司的提取試劑盒提取。具體步驟如下：2.1取收集在肝素或處理過的試管中的全血，放進無菌離心管中。2.2收集血細胞離心，小心地從樣品頂部吸走上清。2.3加1mL血細胞裂解液，小心吸放4次(4～5次均可實施)，重懸沉淀物。2.43000rpm離心5min。2.5重復步驟2.3、2.4兩次。2.6避開細胞沉淀物，小心吸走幾乎所有上清，只保留上100μL清液確認BME已經加到RNA裂解液中，然后加175μL裂解液到細胞中，吸放重懸并裂解細胞。2.7加350μLRNA稀釋液，顛倒混合3次(3～4次均可實施)。2.8置于70℃水浴中3min。2.9室溫下13000g離心10min。2.10取離心后的清亮裂解物上清轉移到一支無菌離心管中；2.11向澄清裂解液中加入200μL95％乙醇，用移液槍吸放3次(3～4次均可)以混合得到混合物。將此混合物轉移到離心柱裝配體中，13000rpm離心1min。2.12從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中的液體，將離心柱裝回到收集管上，確認一下RNAwashsolution已用乙醇稀釋，加600μLRNA洗滌液于離心柱裝配體，13000rpm離心1min，棄去收集管中的液體。2.13將離心柱裝回到收集管上，將新鮮制備的50μLDNase孵育混合物直接加到離心柱內的膜上，室溫下孵育15min，向離心柱中加入DNA酶終止緩沖液(確認已加入乙醇)，13000rpm離心1min。2.14加入600μLRNA洗滌液(已加入乙醇)，13000rpm離心1min。2.15清空收集管，向離心柱內加入250μLRNA洗滌液(已加入乙醇)，高速離心2min。2.16將離心柱從收集管上轉移到洗脫管上，向膜上加100μL無核酸酶水，將離心柱裝配體放進離心機并使洗脫管的蓋子朝外，13000rpm離心1min，丟棄離心柱，蓋好盛有RNA的洗脫管，存于﹣70℃。(3)RNA樣品的質量分析(Nanodrop2000分光光度計)使用分光光度計(Nanodrop2000分光光度計)檢測經步驟(2)處理后的樣品，測定得80位亨廷頓病患者RNA樣品的OD260/OD280為1.8～2.2。正常人RNA樣品的OD260/OD280為1.8～2.2。將上述提取的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測樣品質量，觀察80位亨廷頓病患者和80位正常人的28SrRNA和18SrRNA其主帶明顯、無降解、完整性指數合格、濃度達到進行逆轉錄實驗的要求。(4)逆轉錄：使用Invitrogen公司的反轉錄試劑盒進行操作。具體步驟如下：4.1取總RNA2μg進行逆轉錄，加入Oligo(dT)2μL，充分混勻；70℃水浴5min后立即冰浴2min(2～3min均可)。4.2構建25μL反應體系，其中包括逆轉錄緩沖液5μL，dNTP(2.5mM)5μL，RNasin40U/μL，逆轉錄酶M﹣MLV200U/μL，補無核酶水至25μL。4.342℃水浴60min后，95℃水浴5min以滅活M﹣MLV。4.4﹣20℃儲存?zhèn)溆谩?.5實時定量PCR擴增4.5.1擴增引物設計根據Pebp1基因、GAPDH基因設計擴增引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：Pebp1基因：正向引物為5’CTACACCTTGGTCCTGACAGA3’；反向引物為5’GAGCCCACATAATCGGAGAGG3’。GAPDH基因(擴增反應的內參照基因)：正向引物為5’CTCACCGGATGCACCAATGTT3’；反向引物為5’CGCGTTGCTCACAATGTTCAT3’。4.5.2按照表3配制反應體系其中，SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系購自QIAGEN公司。表3：PCR反應體系試劑體積正向引物1μL反向引物1μL2×SYBRGreenMix12.5μL體系模板2μL去離子水補足25μL(Pebp1基因和GAPDH基因都是一樣的反應體系)4.5.3PCR反應條件95℃10min，95℃15s，60℃60s×45個循環(huán)。以SYBRGreen作為熒光標記物，在Bio﹣RadCFX96熒光定量PCR儀上進行反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量。(5)統(tǒng)計學方法實驗采用3次重復實驗，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，使用SSPS11.5統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。(6)結果結果如圖1所示，與80例正常人血液相比，Pebp1基因在80例亨廷頓病患者血液中的表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義。證明通過檢測Pebp1基因的相對表達量，可檢測亨廷頓病。實施例3：免疫印跡檢測驗證PEBP1蛋白的差異表達，其應用方法包括以下步驟：(1)根據蛋白質組學技術的檢測結果選擇PEBP1蛋白進行大樣本驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇亨廷頓病患者血液和正常人血液各80例樣品的制備及質量分析。(2)免疫印跡樣品的制備每例標本中各取100μL血清，加入PBS溶液等比例稀釋，混勻后分別加入同等量的PMSF、PIC和DTT三種蛋白酶抑制劑，與25μLSDS﹣PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)混合后，于沸水中煮5min，至蛋白變性后﹣80℃存儲得到蛋白樣品。(3)血清總蛋白含量測定3.1標準曲線的制作：3.1.1低溫冰箱中取出BSA溶液，正常融化后稀釋成1mg/ml的溶液。3.1.2配制0.15mol/LNaCl溶液和PBS﹣Tween20(PBST)，備用。3.1.3取33支離心管(1.5ml)，3支一組，分別標記為0g/ml、0.5g/ml、1g/ml、2g/ml、4g/ml、8g/ml、16g/ml、24g/ml、32g/ml、48g/ml、64g/ml。3.1.4按照下表4中各組的濃度配制加入相應試劑。表4：標準曲線制作各組成分表3.4各離心管混勻后，25℃靜置5min，在752型分光光度儀上比色分析，記錄測試結果，制作分光光度值﹣濃度曲線。(4)檢測各組血清樣本的總蛋白含量4.1選取11支容積足量的離心管，分別加入900μL的G250考馬斯亮藍溶液，25℃放置20min后用于蛋白測定。4.2先取出其中1管，加入100μLl0.15mol/L的NaCl溶液，均勻混合后放置5min，用做空白對照，在完成標準曲線程序下加入空白管，選擇blank按鍵測量空白樣品光度值。4.3取另一支管加入0.15mol/LNaCl溶液92μL和步驟2中的蛋白樣品8μL，均勻混合后放置5min，選擇sample按鍵測量待檢血清樣品。4.4依據標準曲線和檢測的分光光度值，計算兩組間蛋白的相對含量，確定各組的上樣體積(各組間蛋白含量一定，體積不一樣)。4.5十二烷基硫酸鈉﹣聚丙烯酰胺凝膠(SDS﹣PAGE)電泳4.5.1凝膠制備：兩塊玻璃板清洗干凈，自然晾干，豎直夾緊于電泳架上。按照凝膠配制試劑盒要求配制12％的分離膠和5％的濃縮膠，分離膠加入TEMED后即刻混勻并灌入玻璃板間，上層緩慢均勻加入無水乙醇，等待10min左右，待乙醇與膠之間出現明顯折線，提示分離膠已凝固。4.5.2棄去上層乙醇，濃縮膠加入TEMED并混勻后，立即即灌入玻璃板上層，垂直插入電泳梳子，置于37℃烘箱中20min左右，待凝膠完全凝固。4.5.3凝膠后垂直拔出梳子，將玻璃板垂直安放于電泳槽中，加入足夠電泳液，準備上樣。(5)蛋白上樣根據上述蛋白定量結果，調整樣本蛋白濃度，以確定各組樣本的上樣體積。對照組(Control)和亨廷頓病人(HD)樣品組分別設置相鄰的兩個重復泳道，依次加入相應的蛋白標本，同時預留最初或者最后的一個泳道作為蛋白質分子量標準的上樣泳道。(6)蛋白電泳電泳時間2h，均為恒壓電泳，濃縮膠選擇80V，分離膠選擇100V，待溴酚藍剛好泳出分離膠，即停止電泳。(7)半干法轉膜7.1電泳完畢后緩慢撬開兩塊玻璃板，取出聚丙烯酰胺凝膠，參照彩色蛋白分子量標準和泳道寬度切取適當的凝膠寬度，準備轉膜。7.2根據凝膠大小，切取兩塊合適的超厚濾紙和一塊PVDF膜，其中確保濾紙長寬度大于凝膠，而小于PVDF膜，將濾紙和膜置于甲醇中浸泡濕潤。7.3半干法轉膜，上自下而上分別加入：超厚濾紙，PVDF膜，PAGE膠，超厚濾紙，進行恒壓轉膜，轉膜條件為：15V，50min。7.4轉膜完畢后，采用1×麗春紅染色液染膜2～3min，相機拍下麗春紅染膜照片，以備上樣均一性的控制；而后去離子水沖去PVDF膜上染液，剪去膜邊緣多余部分，準備孵育抗體。(8)封閉量取40ml的免疫印跡封閉液(含5％脫脂奶粉的TBST溶液)，置于小培養(yǎng)皿中，將PVDF膜加入其中，25℃封閉90min。(9)抗體孵育9.1用透明塑料薄膜封裝PVDF膜，留一側開口，以備加入抗體溶液。9.2采用免疫印跡—抗稀釋液配制兔源性抗人PEBP1蛋白抗體以1∶1000體積比稀釋于抗體孵育溶液(含1％BSA的TBST溶液)，加進塑料薄膜小袋中，并小心排出溶液中氣泡，封住開口，置于4℃震蕩過夜。9.3剪開塑料袋，取出PVDF膜，用PBST溶液洗滌3次，每次10min。9.4用上述同樣方法再次封裝PVDF膜。9.5采用免疫印跡二抗稀釋液配制辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗，稀釋1000倍后加進塑料薄膜小袋中，小心排出氣泡，封住開口，置37℃震蕩60min。9.6依照上述方法洗膜3次，每次10min。(10)免疫印跡條帶化學發(fā)光檢測將免疫印跡發(fā)光ECL增強液的A、B液等體積混合，避光暫存。暗室中將PVDF膜置于免疫印跡電化學發(fā)光成像儀(linxScienceInstruments)槽內合適位置，加入足量的A、B混合液，關閉發(fā)光槽，開始發(fā)光。發(fā)光成像儀獲得的圖片通過數據線導入電腦，利用QuantityOne軟件分析免疫印跡蛋白條帶進行計算分析和統(tǒng)計處理。圖2為免疫印跡實驗驗證PEBP1蛋白在亨廷頓病人和正常人血液樣品中表達水平的結果，圖3為80例PEBP1蛋白的表達量統(tǒng)計結果，從圖中可知：亨廷頓病人(HD)血液樣品中PEBP1蛋白水平顯著高于正常人樣品。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質和技術方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發(fā)明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案保護的范圍內。SEQUENCELISTING<110>湖南中能荊衛(wèi)生物科技有限公司<120>用于亨廷頓病診斷的基因及其應用以及由其編碼的蛋白和蛋白的應用<130>無<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1688<212>DNA<213>Human<400>1gcgcccttcattttcatttcttgaaacaacagccttgcaggccgagccgctgttcccgag60aactcggcagccacagggagcaggttgcatggacccaggagcgcgagaggccctgctctg120ccagcttcggccaatcagaggccagggagcggtgggcgtgacgtggggcggtgcgcgggg180ctgggcggcggctgaggcgcgtgctctcgcgtggtcgctgggtctgcgtcttcccgagcc240agtgtgctgagctctccgcgtcgcctctgtcgcccgcgcctggcctaccgcggcactccc300ggctgcacgctctgcttggcctcgccatgccggtggacctcagcaagtggtccgggccct360tgagcctgcaagaagtggacgagcagccgcagcacccgctgcatgtcacctacgccgggg420cggcggtggacgagctgggcaaagtgctgacgcccacccaggttaagaatagacccacca480gcatttcgtgggatggtcttgattcagggaagctctacaccttggtcctgacagacccgg540atgctcccagcaggaaggatcccaaatacagagaatggcatcatttcctggtggtcaaca600tgaagggcaatgacatcagcagtggcacagtcctctccgattatgtgggctcggggcctc660ccaagggcacaggcctccaccgctatgtctggctggtttacgagcaggacaggccgctaa720agtgtgacgagcccatcctcagcaaccgatctggagaccaccgtggcaaattcaaggtgg780cgtccttccgtaaaaagtatgagctcagggccccggtggctggcacgtgttaccaggccg840agtgggatgactatgtgcccaaactgtacgagcagctgtctgggaagtagggggttagct900tggggacctgaactgtcctggaggccccaagccatgttccccagttcagtgttgcatgta960taatagatttctcctcttcctgccccccttggcatgggtgagacctgaccagtcagatgg1020tagttgagggtgacttttcctgctgcctggcctttataattttactcactcactctgatt1080tatgttttgatcaaatttgaacttcattttggggggtattttggtactgtgatggggtca1140tcaaattattaatctgaaaatagcaacccagaatgtaaaaaagaaaaaactggggggaaa1200aagaccaggtctacagtgatagagcaaagcatcaaagaatctttaagggaggtttaaaaa1260aaaaaaaaaaaaaaaagattggttgcctctgcctttgtgatcctgagtccagaatggtac1320acaatgtgattttatggtgatgtcactcacctagacaaccagaggctggcattgaggcta1380acctccaacacagtgcatctcagatgcctcagtaggcatcagtatgtcactctggtccct1440ttaaagagcaatcctggaagaagcaggagggagggtggctttgctgttgttgggacatgg1500caatctagaccggtagcagcgctcgctgacagcttgggaggaaacctgagatctgtgttt1560tttaaattgatcgttcttcatgggggtaagaaaagctggtctggagttgctgaatgttgc1620attaattgtgctgtttgcttgtagttgaataaaaatagaaacctgaatgaaggaaaaaaa1680aaaaaaaa1688<210>2<211>187<212>PRT<213>Human<400>2MetProValAspLeuSerLysTrpSerGlyProLeuSerLeuGlnGlu151015ValAspGluGlnProGlnHisProLeuHisValThrTyrAlaGlyAla202530AlaValAspGluLeuGlyLysValLeuThrProThrGlnValLysAsn354045ArgProThrSerIleSerTrpAspGlyLeuAspSerGlyLysLeuTyr505560ThrLeuValLeuThrAspProAspAlaProSerArgLysAspProLys65707580TyrArgGluTrpHisHisPheLeuValValAsnMetLysGlyAsnAsp859095IleSerSerGlyThrValLeuSerAspTyrValGlySerGlyProPro100105110LysGlyThrGlyLeuHisArgTyrValTrpLeuValTyrGluGlnAsp115120125ArgProLeuLysCysAspGluProIleLeuSerAsnArgSerGlyAsp130135140HisArgGlyLysPheLysValAlaSerPheArgLysLysTyrGluLeu145150155160ArgAlaProValAlaGlyThrCysTyrGlnAlaGluTrpAspAspTyr165170175ValProLysLeuTyrGluGlnLeuSerGlyLys180185<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根據實驗要求而設計，做為Pebp1基因的正向引物。<400>3ctacaccttggtcctgacaga21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根據實驗要求而設計，做為Pebp1基因的反向引物。<400>4gagcccacataatcggagagg21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根據實驗要求而設計，做為GAPDH基因的正向引物。<400>5ctcaccggatgcaccaatgtt21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>根據實驗要求而設計，做為GAPDH基因的反向引物。<400>6cgcgttgctcacaatgttcat21<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>根據實驗要求而設計，做為用于檢測Pebp1基因轉錄水平的寡核苷酸探針。<400>7tgagcctgcaagaagtggacgagc24當前第1頁1 2 3