專利名稱：治療基于毒性轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的疾病中使用的化合物的制作方法
CN 102933224 A書明說(shuō)1/23 頁(yè)治療基于毒性轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的疾病中使用的化合物發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及包含六肽的化合物，所述化合物用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG, CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的疾病，所述疾病分別諸如，例如，I型強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMl)、8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCA8)、2型強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良 (DM2)、脆性X關(guān)聯(lián)的震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征(FXTAS)、亨廷頓氏舞蹈病(HD)和弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)(FA)。
因此，本發(fā)明總體來(lái)說(shuō)可包括在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且更具體地，可包括在涉及預(yù)防和/ 或治療遺傳性基因病的領(lǐng)域。現(xiàn)有技術(shù)
DMl、或斯太納特氏病(DMl，0MIM#160900)是成人群體中肌營(yíng)養(yǎng)不良的最常見(jiàn)類型，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率是每8，000人中大約I名患者，并被歸類為罕見(jiàn)病。該病是神經(jīng)肌肉性疾病，具有主要影響肌肉的確定癥狀，諸如肌強(qiáng)直和肌無(wú)力，盡管該病的特征是多系統(tǒng)性的，影響心臟系統(tǒng)(心律失常)、視覺(jué)系統(tǒng)(白內(nèi)障)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(高胰島素血癥)和生殖系統(tǒng)(性腺功能減退癥)以及其他器官和系統(tǒng)。
在遺傳水平，DMl呈現(xiàn)常染色體顯性遺傳模式、高外顯率和可變表現(xiàn)度。該疾病的根源在于位于19ql3.2_ql3.3染色體區(qū)域的萎縮性肌強(qiáng)直病蛋白激酶基因(DMPK， Entrez#1760)的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中的動(dòng)態(tài)突變。所述突變由所述DMPK基因的外顯子15中CTG三核苷酸的重復(fù)的異常擴(kuò)增組成，其在健康群體中顯示5-35拷貝的可變數(shù)目， 而在患者中這一數(shù)目大于50。CTG三聯(lián)體的數(shù)目與癥狀的嚴(yán)重度和這些癥狀出現(xiàn)的年齡相關(guān)。因此，在重復(fù)數(shù)目在50和數(shù)百之間的情形中，稱其為成年發(fā)作型DM1，并且最初的臨床跡象通常出現(xiàn)在生命的第二個(gè)十年內(nèi)。在重復(fù)數(shù)目更大、甚至達(dá)到數(shù)千拷貝的情形中，該病理學(xué)從出生時(shí)以先天性DM(CDM或湯姆森病)的形式出現(xiàn)，這是該疾病的最嚴(yán)重的變體，具有諸如智力低下、呼吸系統(tǒng)病癥和肌肉分化問(wèn)題以及其他問(wèn)題的癥狀。
近年來(lái)，關(guān)于DMl的病理發(fā)生的分子機(jī)制提出了許多假設(shè)，并且RNA毒性功能獲得是其中具有最多共同意見(jiàn)的假設(shè)。根據(jù)該機(jī)制，攜帶CUG擴(kuò)增的RNA形成對(duì)表達(dá)它們的細(xì)胞有毒的發(fā)夾環(huán)，通過(guò)掩蔽確定轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)因子導(dǎo)致其可變剪接的變化以及其他變化。Mankodi等人(2000)在轉(zhuǎn)基因小鼠上的工作為這一假設(shè)提供了決定性支持。所述小鼠在異源mRNA中表達(dá)大約250個(gè)CUG三核苷酸重復(fù)，并發(fā)展DMl典型的肌強(qiáng)直和肌肉缺陷，這證明CUG擴(kuò)增自身發(fā)揮毒性效應(yīng)，而與其環(huán)境無(wú)關(guān)(Mankodi等人，2000)。隨后，在果蜆(Drosophila)中產(chǎn)生的其他模型證實(shí)CUG重復(fù)的毒性獨(dú)立于DMPK(Garcia-Lopez等人， 2008)。
因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)具有CUG擴(kuò)增的RNA可能對(duì)細(xì)胞有毒，一整套的科學(xué)證據(jù)支持以下假設(shè) 其他RNA中的這些擴(kuò)增、或相似擴(kuò)增可導(dǎo)致與DMl相似的遺傳性基因病理學(xué)。例如，在DM2 中，從ZNF9(鋅指蛋白9，Entrez#7555)基因轉(zhuǎn)錄的RNA的第一內(nèi)含子中CCUG四核苷酸的擴(kuò)增觸發(fā)與DMl非常相似的病理學(xué)(0MM#602668)。事實(shí)上，在現(xiàn)有技術(shù)中，已知存在在DMl3和DM2患者中均呈現(xiàn)改變的水平的與神經(jīng)功能相關(guān)的基因，這支持兩種疾病具有共同的病理發(fā)生機(jī)制的觀點(diǎn)。
另一方面，8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCA8，0MM#603680)是由SCA8基因的非編碼轉(zhuǎn)錄物中的CTG三聯(lián)體的擴(kuò)增引起的神經(jīng)退行性疾病。已觀察到該基因的雙向轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致具有CUG擴(kuò)增的RNA(非翻譯的)的表達(dá)，該RNA觸發(fā)與對(duì)DMl描述的那些相關(guān)的分子變化， 和具有CAG擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄物被翻譯成具有多谷氨酰胺的蛋白質(zhì)。
在核中，攜帶CUG擴(kuò)增的RNA折疊形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合和掩蔽 RNA-結(jié)合因子，形成大的核糖核蛋白包涵體。迄今，已公開(kāi)了 CUG重復(fù)干擾越來(lái)越多的核蛋白，其中包括轉(zhuǎn)錄因子和可變剪接因子?？勺兗艚右蜃影╤nRNP F和hnRNP H異源核核糖核蛋白，以及屬于MBNL1-3 (Muscleblind-樣蛋白)家族的蛋白。由于這一掩蔽，患者呈現(xiàn)數(shù)百種特異性轉(zhuǎn)錄物的可變加工，這導(dǎo)致產(chǎn)生術(shù)語(yǔ)“spliceopathy”,其中DMl是描述的第一個(gè)實(shí)例。還已提出不同微小RNA的活性可能被改變。
核蛋白的掩蔽阻止其在細(xì)胞中執(zhí)行它們的正常功能。已分離并表征了在體外 和體內(nèi)均能夠結(jié)合雙鏈CUG發(fā)夾環(huán)的數(shù)種蛋白。這些蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子諸如特異性蛋白 I (Spl)、視黃酸受體Y (RAR Y )和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物與轉(zhuǎn)錄激活物家族的成員STATl和STAT3。在培養(yǎng)的DMl細(xì)胞中，這些因子可經(jīng)受高達(dá)90%的掩蔽，這阻止它們激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低靶基因的表達(dá)。
在DMl中改變的其他轉(zhuǎn)錄因子是NKX2-5和MyoD。這些蛋白分別與心臟發(fā)育和傳導(dǎo)相關(guān)以及與成肌細(xì)胞的分化相關(guān)。NKX2-5的水平在患者中是增加的，而MyoD是降低的。 這些轉(zhuǎn)錄因子為什么下調(diào)的原因、以及它們與CUG發(fā)夾環(huán)的形成之間的關(guān)系是未知的。
迄今，多項(xiàng)研究已證明CUG重復(fù)影響許多基因的表達(dá)。使用小鼠微陣列，已檢測(cè)到至少175種肌肉轉(zhuǎn)錄物被擴(kuò)增的CUG轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)改變。此外，在MBNLl敲除小鼠中，至少 128種轉(zhuǎn)錄物也被下調(diào)，這表明MBNLl的掩蔽和隨后的功能喪失在疾病中起關(guān)鍵作用。
MBNLl敲除小鼠呈現(xiàn)虹彩型白內(nèi)障，在肌肉水平患有肌強(qiáng)直和組織學(xué)缺陷。MBNL2 敲除小鼠也發(fā)展DMl典型的肌強(qiáng)直(由于Clcn-I轉(zhuǎn)錄物的不正確加工)和其他肌肉變化。 此外，MBNLl在表達(dá)250個(gè)CTG重復(fù)的模型小鼠中的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了至少4種轉(zhuǎn)錄物(Sercal、 ClcnU Tnnt3和ZASP)加工中的缺陷、以及肌強(qiáng)直。在果蠅中，mb I突變體胚胎呈現(xiàn)肌節(jié)Z 帶結(jié)構(gòu)的缺乏、腹部的高收縮和轉(zhuǎn)錄物諸如ZASP、肌鈣蛋白T(tnT)和α-輔肌動(dòng)蛋白的可變加工的變化。同樣地，MBNLl在表達(dá)480個(gè)CTG重復(fù)的模型果蠅中的過(guò)表達(dá)抑制了重復(fù)引起的表型。所有這些結(jié)果使DMl的研究發(fā)生了重大變化；此后，Muscleblind(Mbl)蛋白被視為該疾病發(fā)展中的決定性因素。
雖然DM最初描述于1909年，但現(xiàn)在仍然沒(méi)有可用的有效療法。應(yīng)用的所有治療是姑息性的并且作用是抑制癥狀的發(fā)展，而無(wú)法阻止其發(fā)作或以確定性方式治療該疾病。目前，沒(méi)有能夠逆轉(zhuǎn)氯傳導(dǎo)缺乏來(lái)減輕肌強(qiáng)直的化合物。將抑制沖動(dòng)啟動(dòng)和傳播必需的鈉進(jìn)入的一些化合物，諸如mexityl、奎尼丁、苯妥英、普魯卡因胺或卡馬西平，施用給患者來(lái)治療這一癥狀。偶爾，所述分子反過(guò)來(lái)被用于治療心律失常；因此，鑒于它們因?yàn)閷?duì)心臟功能的作用帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選避免使用它們作為抗肌強(qiáng)直劑。此外，這些治療中的許多治療降低肌肉強(qiáng)度。已在患者中測(cè)試了另一鈉通道阻斷劑，硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)，并且它看起來(lái)成功減輕了肌強(qiáng)直和心臟問(wèn)題，而沒(méi)有增強(qiáng)肌無(wú)力。DHEAS是一種類固醇激素，它豐富地存4在于血清中，且其水平隨年齡而下降。在患有DMl的患者中，這一激素被降低高達(dá)60%。此外，DHEAS的有效劑量非常高；由于這一原因，它必須通過(guò)靜脈內(nèi)路徑施用，這使得不利于用作長(zhǎng)期治療物。在一些情形中，與DHEAS聯(lián)合施用肌酸酐來(lái)增加肌肉強(qiáng)度。然而，雖然用肌酸酐在患者中的最初臨床試驗(yàn)顯示可信的結(jié)果，但隨后的研究不是同樣陽(yáng)性的。測(cè)試的用于治療肌強(qiáng)直的其他藥物包括三環(huán)抗抑郁劑、苯并二氮卓類、鈣離子拮抗劑、牛磺酸或潑尼松，并且具有矛盾的結(jié)果。
基于以上描述的疾病的作用機(jī)制,該作用機(jī)制提出Muscleblind蛋白的掩蔽和隨后的功能喪失作為該疾病的主要觸發(fā)因素，已形成了尋找抑制MBNLl和具有CUG重復(fù)的發(fā)夾環(huán)之間的相互作用的分子的策略。因此，鑒定了能夠體外抑制所述相互作用的化合物。具有序列((Quin/Pip)-(Asn/Pro)-Cys-Lys)的分子能夠改變MBNLl與重復(fù)的結(jié)合。此外,抗生素噴他脒和新霉素B，以及溴化乙錠和噻唑橙(thiazole orange)、抑制MBNLl與CUG重復(fù)的結(jié)合。另外，噴他脒逆轉(zhuǎn)了培養(yǎng)的HeLA細(xì)胞中IR和TNNT2轉(zhuǎn)錄物的剪接缺陷，并使含有 MBNLl的核包涵體的形成降低21%。在DMl模型小鼠中，噴他脒還改善了 Clcn-I和Sercal 的剪接，盡管是離散地且沒(méi)有明顯的劑量響應(yīng)。因此，噴他脒是在體外鑒定的在體內(nèi)具有對(duì) CUG重復(fù)的潛在治療效應(yīng)的分子的第一個(gè)實(shí)例。然而，該分子可能影響MBNLl的其他靶轉(zhuǎn)錄物在不存在重復(fù)下的加工，這可能危及其長(zhǎng)期治療價(jià)值?，F(xiàn)有技術(shù)中還基 CTG和/或 CUG重復(fù)的三維結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)了祀標(biāo)是T-T或U-U非配對(duì)(unpairing)的分子。雖然能夠結(jié)合 G-G、C-C或A-A的小分子是已經(jīng)知曉的，迄今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)以選擇性方式結(jié)合T-T或U-U的化合物。因此，已顯示與其他序列相比，由三氨基三嗪(其與T-T和U-U相互作用)加吖啶(嵌入劑)形成的配體以特異性方式與CTG和CUG重復(fù)結(jié)合并具有高親和力。
此外，現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了能夠與CUG和CAG重復(fù)結(jié)合和在兩種情形下均抑制 RNA-MBNLI復(fù)合物形成的化合物Hoechst 33258的五聚體的設(shè)計(jì)。該分子至少在小鼠成肌細(xì)胞中是穿透性的和無(wú)毒的。與此類似，還開(kāi)發(fā)了對(duì)具有兩個(gè)富含嘧啶的內(nèi)部非配對(duì)的RNA 分子具有高親和力的配體，內(nèi)部非配對(duì)諸如DM2中由CCUG重復(fù)形成的那些。該化合物由與類肽骨架結(jié)合的三個(gè)6’ -N-5-己炔酸卡那霉素A模塊組成并被四個(gè)間隔子單體隔開(kāi)。將間隔子的數(shù)目從四減到二導(dǎo)致該分子變?yōu)閷?duì)CUG重復(fù)比對(duì)CCUG具有更高的親和力的配體。
現(xiàn)有技術(shù)中存在的這些策略或化合物使得釋放MBNL1、從而逆轉(zhuǎn)剪接缺陷是可能的。此外，當(dāng)核包涵體被分散時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中將有更多的游離DMPK轉(zhuǎn)錄物待翻譯。然而，突變體RNA的重新分布可能具有新的毒性效應(yīng)。雖然心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中CUG和MBNLl的聚集體的形成沒(méi)有在小鼠中造成缺陷，但是其他蛋白可能短期或長(zhǎng)期地受到影響。此外，干擾MBNLl和CUG之間的結(jié)合的那些分子還可能抑制MBNLl和核中的其他靶轉(zhuǎn)錄物之間的結(jié)合，如對(duì)噴他脒所發(fā)現(xiàn)的，或干擾具有與MBNLl相似的RNA結(jié)合機(jī)制的其他蛋白。最后，基于MBNLl的任何治療方法都具有以下限制不是CUG重復(fù)的所有毒性都是由于MBNLl的掩蔽。
大多數(shù)神經(jīng)肌肉疾病的根源在于單基因的突變并因此是開(kāi)發(fā)基因治療的良好候選對(duì)象。然而，在DMl的情況下，涉及的組織主要是有絲分裂后的，這對(duì)于大多數(shù)病毒載體是不利因素。從這一點(diǎn)考慮，已提出使用諸如反義寡核苷酸(ASO)的分子可能是有利的。反義寡核苷酸不提供基因的副本，而是相反，調(diào)節(jié)現(xiàn)有基因的產(chǎn)物。目前，基于這一策略的幾種分子已經(jīng)處于臨床階段。一個(gè)實(shí)例是Duchenne’ s肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD，0MM#300377)的情形，對(duì)于此，AVI Biopharma公司在美國(guó)有兩種分子處于臨床前階段,其中的一個(gè)在英國(guó)已經(jīng)處于lb/2臨床階段(www. avibio. com)。ASO在表達(dá)250個(gè)CTG重復(fù)的模型小鼠、以及在 MBNLl敲除小鼠中的使用是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且已研究了其對(duì)Clcn-I轉(zhuǎn)錄物外顯子7a 的剪接的效應(yīng)。在兩種模型中，脛骨前肌中的單次注射重新獲得了 Clcn-I轉(zhuǎn)錄物的正常剪接模式持續(xù)至少三周，逆轉(zhuǎn)了肌強(qiáng)直。然而由于患者中加工被改變的信使的大數(shù)目，應(yīng)將具有不同靶標(biāo)的多種ASO組合以有效治療不同的癥狀。
組合使用ASO的一個(gè)替代方案是使用在DMPK轉(zhuǎn)錄物水平起作用的反義寡核苷酸以消除毒性來(lái)源。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)進(jìn)行旨在使用特異性ASO抑制培養(yǎng)的患者細(xì)胞中 DMPK的表達(dá)的測(cè)定。然而，這一方法不能區(qū)分突變體轉(zhuǎn)錄物和野生型轉(zhuǎn)錄物。鑒于DMPK在心臟功能和胰島素代謝中的重要作用，降低DMPK的總表達(dá)可能是同等地致病的?，F(xiàn)有技術(shù)中的幾項(xiàng)工作使用由CAG重復(fù)(CAG7或CAG25)構(gòu)成的ASO來(lái)將它們的效應(yīng)優(yōu)選地指向具有長(zhǎng)的CUG重復(fù)的轉(zhuǎn)錄物。在培養(yǎng)的成肌細(xì)胞和DMl模型小鼠二者中，這些寡核苷酸除了特異地使突變體轉(zhuǎn)錄物的水平降低高達(dá)50%之外，還逆轉(zhuǎn)Clcn-I的剪接缺陷，可能是由于短CAG重復(fù)序列和毒性RNA之間的結(jié)合促進(jìn)了不含非配對(duì)的異源雙鏈體的形成；這阻止了嘧啶非配對(duì)是其結(jié)合必需的結(jié)構(gòu)元件的蛋白 的掩蔽，諸如MBNLl。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中已知的分子的主要作用機(jī)制是抑制具有CUG重復(fù)的發(fā)夾環(huán)施加的對(duì)MBNL蛋白的掩蔽從而阻止發(fā)夾環(huán)和MBNL蛋白之間的相互作用，而不是對(duì)發(fā)夾環(huán)的去結(jié)構(gòu)化(destructuration)發(fā)揮直接效應(yīng)
相反，本發(fā)明集中于從化學(xué)庫(kù)中篩選藥物以鑒定具有治療病因?qū)W是基于包含CUG 或CCUG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的相應(yīng)生物活性的化合物，所述疾病諸如，例如 DMU DM2和SCA8。本發(fā)明的化合物是基于比現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些機(jī)制更有效的機(jī)制，因?yàn)楦鶕?jù)最可能的作用機(jī)制，由具有CUG重復(fù)的毒性片段構(gòu)成的雙鏈發(fā)夾環(huán)被結(jié)合和去結(jié)構(gòu)化，或具有擴(kuò)增的RNA保持單鏈構(gòu)型，從而阻止MBNLl和其結(jié)合可能導(dǎo)致或加劇病理表型的任何其他分子的異常結(jié)合。此外，因?yàn)樗鼈儾桓?jìng)爭(zhēng)MBNLl和與該蛋白的天然靶標(biāo)結(jié)構(gòu)非常相似的CUG發(fā)夾環(huán)之間的異常結(jié)合，所以預(yù)期它們不會(huì)干擾細(xì)胞中MBNLl-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物。 在本發(fā)明中，使用果蜆作為CTG重復(fù)的毒性模型(Garcia-Lopez等人,2008),在其中測(cè)定本發(fā)明的化合物并確定它們對(duì)CTG重復(fù)的毒性的作用機(jī)制。在DMl脊椎動(dòng)物模型中驗(yàn)證它們的效力。
發(fā)明描述
在本發(fā)明中，我們進(jìn)行了鑒定具有預(yù)防或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG、CGG、 CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的治療潛能的化合物的方法，所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA，所述方法包含體內(nèi)篩選六肽化合物文庫(kù)，優(yōu)選地在疾病的果蠅模型中篩選，和選擇那些逆轉(zhuǎn)病理狀況的化合物。
待用于尋找潛在治療劑的分子的大小是要考慮的重要方面，這是因?yàn)樘叩姆肿恿繒?huì)限制細(xì)胞對(duì)化合物的吸收。優(yōu)化分子以產(chǎn)生更具活性的化合物通常伴隨著其最終大小的增加。然而，大于1000的分子量通過(guò)降低分子的生物利用度降低其治療潛能，這使得必須從小化合物開(kāi)始。因此，目前商業(yè)化的藥物中有80%具有低于450的分子量。氨基酸的平均分子量是約13 a。因此，六肽的近似大小在SlODa左右。篩選由氨基酸數(shù)目大于6形成的肽文庫(kù)將導(dǎo)致過(guò)大的分子。另一方面，雖然存在二、三、四和五肽的集合，但是增加形成分子的氨基酸的數(shù)目導(dǎo)致解卷積(deconvolution)過(guò)程中更大量的所限定的肽，從而增加發(fā)現(xiàn)活性化合物的概率。
(Garcia-Lopez等人，2008)中描述的果蠅模型表達(dá)480個(gè)CTG重復(fù)(CTG (480))， 導(dǎo)致在成熟蛹階段的致死表型，觀察到該模型所展現(xiàn)的表型響應(yīng)于Mbl的水平并對(duì)化合物修飾易感，這使得該模型適合于系統(tǒng)尋找具有預(yù)防或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG、 CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的治療潛能的化合物，所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2、FXTAS, HD 和 FA。
本發(fā)明開(kāi)始于以位置掃描方式篩選組合肽化合物文庫(kù)。該化合物文庫(kù)由120個(gè)小瓶構(gòu)成，每個(gè)小瓶由在特定位置共有單個(gè)氨基酸而在所有剩余位置不同的六肽混合物組成。因此，當(dāng)檢測(cè)到陽(yáng)性小瓶時(shí)，在給定位置鑒定了活性氨基酸。測(cè)定的每個(gè)位置(小瓶)的活性最強(qiáng)的氨基酸的組合稱為解卷積。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，為了延長(zhǎng)肽在體內(nèi)的平均壽命，本發(fā)明中使用的化合物文庫(kù)的肽由天然氨基酸的D-立體異構(gòu)體構(gòu)成，其不被腸蛋白酶識(shí)別且較不易于降解。
因此，本發(fā)明涉及包含在果蠅和小鼠中具有預(yù)防或治療病因?qū)W是基于包含CUG、 CCUG, CGG、CAG或AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的經(jīng)驗(yàn)證的體內(nèi)治療潛能的六肽的化合物，所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2、FXTAS, HD和FA。本發(fā)明的化合物的作用機(jī)制比現(xiàn)有技術(shù)中已知的化合物發(fā)揮的作用機(jī)制更加有效，這是因?yàn)樗鼈兡軌蚪Y(jié)合由具有所述重復(fù)的毒性片段形成的雙鏈發(fā)夾環(huán)并將其去結(jié)構(gòu)化，或維持具有擴(kuò)增的RNA處于單鏈構(gòu)象，從而阻止MBNL和任何其他分子的異常結(jié)合或掩蔽，MBNL和任何其他分子與CUG發(fā)夾環(huán)的結(jié)合還可導(dǎo)致或加劇病理表型。
更具體地，本發(fā)明測(cè)定了包含具有式(I) (A-B-C-D-E-F)的肽或其藥學(xué)上可接受的立體異構(gòu)體、混合物、鹽或模擬肽的化合物。下面，我們限定了可能是式I的位置A至F 中的每個(gè)位置的一部分的氨基酸，用三字母代碼和常規(guī)用于表示天然氨基酸的立體異構(gòu)體的小寫代碼兩者來(lái)表示所述氨基酸
· A可以是氨基酸cys (C)或pro (p)，
· B可以是氨基酸pro (p)或gin (q)，
· C 是氨基酸 tyr (y)，
· D可以是氨基酸ala (a)或thr⑴，
· E可以是氨基酸gin (q)或trp (w);和
· F 是氨基酸 glu(e)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為本發(fā)明的肽的一部分的氨基酸是D-氨基酸，其不被腸蛋白酶識(shí)別且較不易于降解。然而，如實(shí)施例中所示，由L-氨基酸構(gòu)成的肽也是有活性的。
在本發(fā)明中，模擬肽應(yīng)理解為意指特征在于與具有式(I)的肽的序列互補(bǔ)、同源和/或等同的序列的肽有機(jī)分子。本發(fā)明的化合物還包含具有通式I的肽的有功能的互補(bǔ)、同源和/或等同的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包含與具有通式I的肽的序列具有至少80%同一性或同源性的同源序列。此外，本發(fā)明的化合物可包含為具有式 I的肽的化學(xué)類似物、衍生的環(huán)狀肽、二聚體和/或多聚體的肽。
如本發(fā)明中所展示的，包含前述肽的化合物可用于預(yù)防或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG, CGG、CAG或AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病，所述疾病諸如，例如DM1、CN 102933224 A書明說(shuō)6/23 頁(yè)SCA8、DM2、FXTAS, HD和FA。測(cè)試了對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID NO :1至16的六肽對(duì)所述疾病的治療，且六肽plO(SEQ ID NO 10)是特別優(yōu)選的，原因是它在前述果蠅模型中在腦和肌肉兩者中均逆轉(zhuǎn)了毒性，兩種情況下均以劑量依賴性方式。此外，具有包含處于其逆-反 (retro-inverse)構(gòu)型的plO序列的肽的內(nèi)源表達(dá)在模型果蠅的眼和肌肉中逆轉(zhuǎn)了表型， 從而證實(shí)了 PlO和其衍生物對(duì)CTG重復(fù)的毒性的效應(yīng)。丙氨酸掃描的結(jié)果以及轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生證實(shí)，PlO序列中的所有氨基酸對(duì)于其活性是必需的，且活性在于其殘基的側(cè)鏈。plO 在體外結(jié)合CUG重復(fù)，展開(kāi)發(fā)夾環(huán)。這一鍵合依賴于肽序列，且在重復(fù)數(shù)目增加時(shí)更大。在 DMl模型小鼠中肌內(nèi)注射plO逆轉(zhuǎn)肌肉轉(zhuǎn)錄物的剪接缺陷，以及組織學(xué)水平的缺陷。這一效應(yīng)是系統(tǒng)性的，且在單次注射后保持至少4周。
盡管如上所提及的，plO由于是測(cè)試的那些化合物中最有效的而成為本發(fā)明的優(yōu)選化合物，但是本發(fā)明還證實(shí)包括在式I內(nèi)的其他化合物，諸如，例如，P11、p5、P12和P15， 在毒性CUG轉(zhuǎn)錄物存在下也展現(xiàn)不同程度的特異性和效力(參見(jiàn)實(shí)施例16和圖29)。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及包含具有式I的六肽、或其模擬肽的化合物，所述化合物將用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG, CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病，所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。
本發(fā)明的第二方面涉及所述化合物用于制備設(shè)計(jì)用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的藥物組合物的用途， 所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2FXTAS、HD和FA。
本發(fā)明中公開(kāi)的化合物可用作人類患者或動(dòng)物中的活性成分，且可根據(jù)蓋倫開(kāi)發(fā) (galenic development)的現(xiàn)有技術(shù)中的知識(shí)制備成制劑和/或施用。因此,本發(fā)明的第三方面涉及包含至少一種本發(fā)明的肽聯(lián)合至少另一種活性成分的藥物組合物。該組合物還可伴隨活性成分包含至少一種賦形劑作為無(wú)活性物質(zhì)，例如，該賦形劑促進(jìn)所述活性成分在體內(nèi)的吸收或促進(jìn)其活化。
所述賦形劑可以設(shè)計(jì)為用于保持組合物的粘合成分，諸如，例如淀粉、糖類或纖維素；填充劑，諸如，例如植物纖維素、磷酸氫鈣、紅花；崩解劑；潤(rùn)滑劑，諸如，例如滑石、 娃月父或留族脂肪；包衣劑；甜味劑；調(diào)味劑；著色劑；等等。
所述組合物可通過(guò)用于使活性成分到達(dá)其治療靶標(biāo)的任何施用路徑施用，例如， 通過(guò)消化路徑(口服、舌下、胃腸的或直腸的)、胃腸外路徑(皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi))、呼吸路徑或體表路徑(topical route)ο
本發(fā)明的另一方面涉及預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和 AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的方法，所述疾病諸如，例如DM1、SCA8、DM2、FXTAS, HD和FA，所述方法包含向患者施用治療有效量的包含至少一種本發(fā)明的六肽的藥物組合物。在本發(fā)明中，“治療有效量”應(yīng)理解為意指能夠預(yù)防或治療與病因?qū)W是基于包含CUG、 CCUG、CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病相關(guān)的病理狀況的量，所述疾病諸如，例如:DM1、SCA8、DM2 和 SCA8。
在本發(fā)明中，在DMl的果蠅模型中在大于40 μ M和低于250 μ M、優(yōu)選地70. 4μ M的 Pio濃度下觀察到了陽(yáng)性結(jié)果。
附圖描述
圖I.-位置掃描策略。8
(B)OU 02…06代表20種可能的天然氨基酸的D-立體異構(gòu)體占據(jù)的指定位置，X 指20種天然氨基酸的D-立體異構(gòu)體中的19種的等摩爾混合物(半胱氨酸在X中被省去， 但是在指定位置中沒(méi)有省去)。6個(gè)位置乘以20種可能的氨基酸得到120種組合，每種組合代表化合物文庫(kù)中的一個(gè)小瓶。
(A)鑒定到陽(yáng)性小瓶后，我們研究了哪些氨基酸占據(jù)了每個(gè)小瓶中的指定位置。產(chǎn)生具有指定序列的肽的陽(yáng)性氨基酸的組合稱為解卷積。
實(shí)施例I包括對(duì)從圖I獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖2.-初步篩選和解卷積的結(jié)果。
(A)化合物文庫(kù)的篩選和隨后的統(tǒng)計(jì)分析揭示了總共28個(gè)陽(yáng)性小瓶(P-值 〈O. 05)，其數(shù)字代碼顯示在每幅圖的X-軸。其中，選擇示出的10個(gè)氨基酸(對(duì)應(yīng)于具有最大活性的小瓶)進(jìn)行解卷積。01XXXXX、X02XXXX、XX03XXX、XXX04XX、XXXX05X 和 XXXXX06 分別代表在位置1、2、3、4、5和6具有指定氨基酸的小瓶。
(B)解卷積得到12種指定的六肽。
圖的Y軸顯示了初步篩選中獲得的P-值的倒數(shù)作為活性量度。
實(shí)施例I包括對(duì)從圖2獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖3. -DM的果蠅模型中的plO劑量響應(yīng)測(cè)定。Y軸代表果蠅模型存活率的增加，X軸代表PlO 濃度(μ M)。plO 在 80 和 125 μ M之間最有效地抑制 103Y_Gal4/+; UAS-CTG (480) /+ 果蠅中的致死表型。這一趨勢(shì)在濃度增加至250 μ M后喪失。增加的存活率值對(duì)應(yīng)于([處理的出生雌性]-[對(duì)照出生雌性]/n) XlOO。
實(shí)施例I包括對(duì)從圖3獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖4.-野生型個(gè)體中plO毒性的研究。
(A、B)該圖顯示當(dāng)將DMSO施用于自制食物中具有OrR基因型(野生基因型)的胚胎㈧或LI幼蟲(chóng)⑶時(shí)對(duì)DMSO的劑量響應(yīng)行為。Y軸代表成蟲(chóng)數(shù)目，X軸代表DMSO的％。
(C)該圖證明plO在OrR個(gè)體中沒(méi)有毒性，因?yàn)檫_(dá)到蛹和成蟲(chóng)階段的LI幼蟲(chóng)的數(shù)目在任何濃度下都沒(méi)有與對(duì)照不同。每個(gè)測(cè)定以每個(gè)重復(fù)50個(gè)體進(jìn)行三個(gè)重復(fù)(每種濃度共150個(gè)體)。Y軸代表個(gè)體數(shù)目，X軸代表plO濃度(μ M)。在每組的三個(gè)柱中，左側(cè)柱代表幼蟲(chóng)數(shù)目，中間柱代表蛹數(shù)目，右側(cè)柱代表成蟲(chóng)數(shù)目。
實(shí)施例2包括對(duì)從圖4獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖5.-丙氨酸掃描。
該圖證明用丙氨酸置換肽plO的任何殘基導(dǎo)致活性的損失。將肽施用于食物中的 103Y-Gal4+/+ ； UAS-CTG (480) /+幼蟲(chóng)。Y軸代表雌性數(shù)目，X軸代表測(cè)定的本發(fā)明的六肽左側(cè)柱對(duì)應(yīng)于對(duì)照(O. 1%DMS0)，且接下來(lái)的柱從左至右對(duì)應(yīng)于plO肽和包含丙氨酸置換的具有以下序列的肽ppyawa、ppyaae、ppaawe、pay awe > apyawe。條顯示平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。 *指示P-值〈O. 05。
實(shí)施例3包括對(duì)從圖5獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖6.-肽plO抑制CTG(480)在間接飛行肌(IFM)中的毒性。
該圖從左至右顯示正常果蠅(A)、表達(dá)CTG(480)的果蠅(B)和用肽plO 口服治療的在他(3-6&14控制下表達(dá)(^6(480)的果蠅(C)的IFM的1.5-μπι橫切片。用肽治療的果蜆具有比用DMSO處理的對(duì)照更大的肌肉組(muscular package)。圖像是在IOx放大率下9米集的。
實(shí)施例4包括對(duì)從圖6獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖7. -IFM對(duì)肽plO的劑量響應(yīng)。
用O. 12%DMS0(對(duì)照)⑷和用不同濃度的肽 plO 62. 5 μ M(B) ,125 μ M(C)、 250 μ M(D)和 500 μ M(E)處理的 Mhc_Gal4/+;UAS-(CTG)480/+果蠅的 IFM 的橫切片。(F) 的Y軸顯示相對(duì)肌肉區(qū)域(μπι)。此外，(F)顯示獲得的結(jié)果，其中第一個(gè)柱對(duì)應(yīng)于DMS0，接下來(lái)的柱從左至右對(duì)應(yīng)于以下PlO濃度62.5“] 、1254]\1、25(^]\1和500 μ Μ。在62. 5 μ M 和250μΜ之間，肽plO導(dǎo)致與對(duì)照果蠅(F)相比肌肉區(qū)域的顯著增加，以及纖維損失的降低(Α中的箭頭)。在500 μ M，IFM的區(qū)域小于對(duì)照果蠅中的。圖中的條顯示平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。*指示P-值〈O. 05，_指示P-值〈O. 0001。
實(shí)施例4包括對(duì)從圖7獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖8. -plO降低果蠅中包含毒性CUG重復(fù)的核糖核聚集體(病灶)的數(shù)目并從中釋放 Mbl。
該圖顯示用plO進(jìn)行治療在測(cè)試的所有plO濃度(X軸)下顯著降低包含CUG 重復(fù)的核糖核聚集體(病灶)的數(shù)目(Y軸)(A)。此外，顯示通過(guò)免疫熒光(灰色)在用 DMSO (O. 12% ;對(duì)照)(B)或ρ10(250μΜ) (C)處理的果蠅的IFM中Mbl的檢測(cè)。口服施用plO 導(dǎo)致Mbl細(xì)胞內(nèi)分布的變化，從以聚集體形式分布(見(jiàn)箭頭)(B)變?yōu)橐苑稚⑿问椒植?C)。 核的染色用DAPI進(jìn)行。*意指p〈0. 05和**p〈0. 0005。這些結(jié)果顯示體內(nèi)治療(在果蠅模型中)和口服攝取化合物(PlO)后對(duì)降低DMl患者特征性的最明顯的分子表型中的兩個(gè)分子表型的高水平效力。
圖9.-為在果蠅中的內(nèi)源表達(dá)設(shè)計(jì)的肽PlO的衍生物。
SEQ ID NO :17_19的肽(pl7_pl9)的序列以降序顯示。顯示了初始蛋氨酸、三間隔子甘氨酸和肽Pio的直接(一)或逆-反(一)序列。
實(shí)施例5包括對(duì)從圖9獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。


圖10.-包含plO的L-氨基酸肽借助Gal4/UAS系統(tǒng)的內(nèi)源表達(dá)抑制CTG (480)引起的眼睛粗糙。
UAS-pl8和pl9在19。C和21。C下抑制CTG (480)在眼中的毒性，導(dǎo)致比對(duì)照果蠅粗糙度降低的表型和更大的眼睛(B、E對(duì)比C、F)。增加溫度后，這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)，UAS-plS 和P19變成該重復(fù)的效應(yīng)增強(qiáng)物(25° C;H對(duì)比I)。UAS-pl8自身在25° C下不產(chǎn)生粗糙的眼睛(G)。圖(A)顯示野生的眼睛。(D)使用CTG(480)和MBNLl之間的相互作用作為陽(yáng)性對(duì)照。圖像(A-F)在掃描電子顯微鏡下采集。圖像(G-I)在放大鏡下采集。
實(shí)施例5包括對(duì)從圖10獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖11.-共表達(dá)(CTG)480和plO序列的不同變體對(duì)眼睛表型的抑制的定量。
對(duì)GMR-Gal4UAS_CTG(480)/UAS-p 19果蠅的背-腹軸中眼睛的長(zhǎng)度的定量顯示對(duì)照果蠅中眼睛大小的顯著增加(GMR-Gal4 UAS-CTG(480)/+ ；p-值〈O. 05，T-檢驗(yàn))。這一效應(yīng)在將溫度從19° C增加至21° C后更大。Y軸顯示相對(duì)于無(wú)肽對(duì)照的眼睛的相對(duì)大小，X軸從左至右顯示對(duì)照柱、19° C下UAS-pl9的柱和21° C下UAS_pl9的柱。
實(shí)施例5包括對(duì)從圖11獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖12.包含plO的L-氨基酸肽借助Gal4/UAS系統(tǒng)在IFM中的內(nèi)源表達(dá)。在Mhc啟動(dòng)子控制下表達(dá)CTG(480) (A)或同時(shí)表達(dá)CTG(480)和pl8(B)的果蠅的胸部橫切片 (1.5μπι)。ρ18的存在導(dǎo)致肌肉大小的增加(C)。圖C在Y軸顯示肌肉區(qū)域，X軸在左側(cè)柱中代表作為陰性對(duì)照的UAS-GFP的效應(yīng)和在右側(cè)柱中代表UAS-pl8的效應(yīng)。
實(shí)施例5包括對(duì)從圖12獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖13.-肽plO對(duì)CTG(480)毒性的可能作用機(jī)制。
plO可能影響重復(fù)的表達(dá)(A)、使Mbl從RNA發(fā)夾環(huán)上轉(zhuǎn)移(B)、毒性發(fā)夾環(huán)的去穩(wěn)定(C)或作用于重復(fù)的下游(D)。然而，如圖中和以下的實(shí)施例中所示，PlO最可能的作用機(jī)制是基于毒性發(fā)夾環(huán)的去穩(wěn)定(C)。
實(shí)施例6包括對(duì)從圖13獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖14. plO的表達(dá)對(duì)螢光素酶報(bào)告蛋白的表達(dá)的效應(yīng)。
與暴露于相同量的DMS0(0. 12%)的果蠅相比，用plO處理沒(méi)有顯著影響Gal4/UAS 系統(tǒng)誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)。然而，DMSO自身影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。條顯示平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。**指示P-值〈O. 01。Y軸顯示螢光素酶化 3)4軸從左至右顯示0%01^0、0. 1%DMS0和 250μΜ的plO的效應(yīng)。
實(shí)施例7包括對(duì)從圖14獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖15. -P 10 對(duì) CTG (480)表達(dá)的效應(yīng)。
(A)瓊脂糖凝膠顯示用O. 12%DMS0 (對(duì)照)(左側(cè)柱)或用不同濃度的plO (第二 柱62· 5μΜ，第三柱125μΜ，第四柱250μΜ、第五柱500μΜ)的 Mhc_Gal4/+ ； UAS-CTG (480)/+果蠅中借助SV40終止子區(qū)域的半定量RT-PCR擴(kuò)增的CUG (480)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。Rp49基因轉(zhuǎn)錄物用作cDNA模板加載對(duì)照。用ImageJ程序定量條帶的強(qiáng)度未揭示任何情形下的顯著改變(α =0. 05，T-檢驗(yàn))。
(B).條顯示㈧中獲得的結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。DMSO(對(duì)照)(左側(cè)柱) 或以不同濃度施用的PlO (第二柱62. 5μΜ、第三柱125μΜ、第四柱250μΜ、第五柱 500 μ Μ)。
實(shí)施例7包括對(duì)從圖15獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖16. -plO與Muscleblind的第一個(gè)鋒指部分比對(duì)。
按照降序，顯示了以下對(duì)應(yīng)于黑腹果蜆(Drosophila melanogaster)(第一行)、 秀Hll隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)(第二行)、原雞(Gallusgallus)(第三行)、斑馬魚(yú)(Danio Rerio)(第四行)和智人(Homo Sapiens)(第五、第六和第七行三種人類旁系同源物)的Muscleblind的第一個(gè)鋅指的序列。plO的反向序列(最后一行)與對(duì)該蛋白與RNA結(jié)合關(guān)鍵的區(qū)域比對(duì)。保守氨基酸以黑色顯示。
實(shí)施例8包括對(duì)從圖16獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖17.-大腸桿菌(E. coli)中MblZF(Mbl鋅指)蛋白的獲得。
(A)MblZF在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中的表達(dá)。A. I.:用IPTG誘導(dǎo)之前；S :細(xì)胞裂解物的上清液(可溶級(jí)分)；P:細(xì)胞裂解物的沉淀(不溶級(jí)分)。該蛋白的大部分發(fā)現(xiàn)于可溶級(jí)分(S)，如箭頭所示的。
(B)通過(guò)FPLC以咪唑梯度純化MblZF蛋白的實(shí)例。加入級(jí)分10至14以獲得蛋白貯液(C)。星號(hào)*1和*2顯示通過(guò)質(zhì)譜測(cè)序以確認(rèn)MblZF身份的條帶(*1)。條帶*2證明是大腸桿菌50S蛋白，從而排除了其是MblZF降解產(chǎn)物的可能性。
實(shí)施例9包括對(duì)從圖17獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析
圖18. -Muscleblind蛋白的鋅指的CD(圓二色性)光譜。
⑷人類MBNLl蛋白(2μΜ)呈現(xiàn)為203nm的顯著的峰和220nm的弱峰，這指示 MBNL1ZF(第一對(duì)鋅指)除了小部分的α螺旋形式外不具有二級(jí)結(jié)構(gòu)(與B中的模式相比)。MblZF具有相似模式的行為，具有205nm的顯著的峰和222nm的弱峰(C)。(D)MblZF 在通過(guò)分子排阻柱時(shí)作為單峰洗脫。與分子量標(biāo)準(zhǔn)的模式相比，洗脫體積符合單體形式的 MblZF的大小。
實(shí)施例9包括對(duì)從圖18獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖19.-熒光偏振測(cè)定圖。
熒光偏振測(cè)定由以下組成用熒光團(tuán)(在本發(fā)明情形下為與羧基熒光素偶聯(lián)的 CUG重復(fù)；A)標(biāo)記小分子，使得當(dāng)熒光團(tuán)與具有更大分子量的分子(諸如MblZF蛋白)結(jié)合時(shí)，其旋轉(zhuǎn)速率被改變(B)。旋轉(zhuǎn)速率的變化可通過(guò)用垂直和水平平面的偏振光束激發(fā)分子并測(cè)量發(fā)射熒光的偏振方向來(lái)檢測(cè)。如果小型的分子(PlO)能夠抑制MblZF和 FAM-CUG23 (與羧基熒光素?zé)晒鈭F(tuán)偶聯(lián)的23個(gè)CUG重復(fù))之間的結(jié)合，熒光RNA將再次增加其旋轉(zhuǎn)速率，降低其偏振(C)。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖19獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖20.-MblZF 和 plO 結(jié)合 CUG 重復(fù)。
MblZF導(dǎo)致FAM-CUG23偏振的增加，這通過(guò)兩種分子之間的結(jié)合產(chǎn)生。如果它與未標(biāo)記的CUG23RNA競(jìng)爭(zhēng)，則該結(jié)合是可逆的(A)，并與MblZF的量成正比(B)。plO也導(dǎo)致 FAM-CUG23的偏振的增加(C)。由于該肽的小尺寸，這一增加很小，并且在增加肽的濃度后沒(méi)有顯著改變(D)。plO沒(méi)有逆轉(zhuǎn)MblZF對(duì)FAM- (CUG) 23的效應(yīng)。*指示p-值〈O. 05 (T-檢驗(yàn))。圖A和C的Y軸顯示相對(duì)偏振，圖B和D的Y軸顯示偏振的增加。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖20獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖21.-借助凝膠阻滯測(cè)定研究MblZF與FAM- (CUG) 23的結(jié)合。
MblZF結(jié)合FAM-CUG23，導(dǎo)致復(fù)合物在孔中的保留。對(duì)于固定的蛋白濃度，這在測(cè)定的所有RNA濃度下發(fā)生(A)。FAM- (CUG) 23和MblZF之間的結(jié)合是特異性的，原因是其可與未標(biāo)記的CUG23RNA (FAM-(CUG) 23: CUG23比例1:100 ;圖8，泳道3)競(jìng)爭(zhēng)，并且如果在與 FAM-(CUG) 23孵育前通過(guò)加熱使蛋白變性，則不發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)(圖B，泳道4)。以和MblZF相同濃度使用的膠原α -3蛋白不與RNA結(jié)合(圖B，泳道5) (*1 :通過(guò)加熱變性的MblZF，*2 :與膠原^-3孵育)。MblZF還與更小的RNA (FAM-(CUG) 4)結(jié)合，形成保留在凝膠孔中的復(fù)合物(C)。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖21獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖22. -MblZF的組氨酸尾不影響其與FAM-(CUG) 23的結(jié)合。
(A)顯示用TEV蛋白酶消化以消除MblZF蛋白的6組氨酸的凝膠。使消化產(chǎn)物 (MblZFAHis)通過(guò)Nickel親和柱以保留組氨酸和消除TEV，因?yàn)楹笳吲cMblZF·3具有不同的洗脫(B)。(C)純化后的結(jié)果。(D) MblZF"His結(jié)合FAM-(CUG) 23且此結(jié)合與蛋白濃度成正比。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖22獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖23. -MblZF/FAM-(CUG) 23復(fù)合物不向陽(yáng)極遷移。
(A)在所用的電泳條件下，MblZF蛋白幾乎沒(méi)有進(jìn)入凝膠(銀染，圖A左側(cè))。如果蛋白和RNA-蛋白復(fù)合物兩者均在孔置于中部的水平凝膠上電泳，則僅觀察到向陰極遷移的蛋白。如果電泳緩沖液的pH在MblZF的Ip之上增加一個(gè)點(diǎn)，則蛋白繼續(xù)向陰極遷移 (B)。MblZF"His蛋白也不進(jìn)入凝膠(B)。通過(guò)用FA交聯(lián)固定RNA-蛋白復(fù)合物且將其在變性凝膠(其中SDS賦予蛋白負(fù)電荷)上分離沒(méi)有改變MblZF的行為(C)。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖23獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖24.-plO結(jié)合CUG重復(fù)而不改變MblZF。
(A)plO(lmM)可結(jié)合FAM-(CUG) 23RNA(60nM)。(B)這一結(jié)合與肽的量成正比并從飛ΟΟμΜ檢測(cè)。PlO(ImM)以較低親和力結(jié)合短型重復(fù)(FAM-(CUG) 4，60nM) (C)。肽與 FAM-(CUG) 23的結(jié)合不干擾與MblZF蛋白的相互作用(D)，至少在這一測(cè)定中不顯著干擾。
實(shí)施例10包括對(duì)從圖24獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖25.-肽plO的特異性。
(A)丙氨酸掃描的五種肽(左側(cè)的第一管是對(duì)照，且接下來(lái)的五個(gè)對(duì)應(yīng)于以下妝ppyawa、ppyaae、ppaawe、payawe 和 apyawe) (2. 5mM)沒(méi)有一個(gè)顯著結(jié)合 FAM-(CUG) 23RNA(60nM)，由此證明對(duì)plO描述的相互作用是特異的。(B)plO(lmM)可結(jié)合雙鏈(ds)和單鏈(88)1 嫩和0嫩(601^)兩者。(C)顯示(B)中所示的實(shí)驗(yàn)中使用的核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖。
實(shí)施例11包括對(duì)從圖25獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖26. -P 10以較高親和力結(jié)合DMPK-CUG4。
(Α)ρ10(5μΜ)的色氨酸的熒光消光實(shí)驗(yàn)。將肽與不同核酸(2. 5 μ Μ、5 μ Μ、 7· 5 μ Μ、10 μ M 和 12. 5 μ Μ)孵育。突光消光率(fluorescence extinctionrate) (Y 軸代表相對(duì)熒光)測(cè)量為在將351nm處的熒光發(fā)射值關(guān)于每個(gè)濃度點(diǎn)的游離肽表示后獲得的直線的斜率。對(duì)于每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行至少兩次測(cè)量。在所有情形中，所述消光率對(duì)于DMPK-CUG4較大， 而對(duì)于CAG · CUG4不顯著⑶。
實(shí)施例11包括對(duì)從圖26獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖27. -plO降低CUG重復(fù)的組裝。
MblZF (A, I μ M^P I. 5 μ Μ)和 ρ10(Β，0· I μ Μ、0· 5 μ Μ、I μ Μ、10 μ M和 20 μ Μ) 二者均改變CUG(60) (I μ Μ)的圓二色性(CD)光譜，與蛋白或肽濃度成正比地將RNA的發(fā)射峰降低至 265nm。然而，當(dāng)將RNA與MblZF和plO聯(lián)合孵育時(shí)，無(wú)論加入順序如何，都不能逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)(C)。這一改變不是由RNA的降解引起的，同時(shí)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)(D)且在將CUG60與具有序列ppyawa(E,0. 5 μ M和I μ Μ)和payawe (F, I μ Μ)的丙氨酸掃描六肽孵育時(shí)也不發(fā)生。
實(shí)施例12包括對(duì)從圖27獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖28.-plO打開(kāi)由CUG重復(fù)形成的發(fā)夾環(huán)。
相對(duì)于游離RNA發(fā)射的熒光，在MblZF(0. I μ Μ、I μ Μ、2 μ M和5 μ M) (A)或 ρ10(0· 1μΜ、1μΜ、2μΜ、5μΜ和 100 μ Μ) (B)存在下(CUG)23RNA(lyM)中的 2-氨基嘌呤發(fā)射的熒光(Y軸)的測(cè)量，熒光測(cè)量為相對(duì)熒光單位(RFU)。plO導(dǎo)致100 μ M下2-ΑΡ熒光的2. 9-增加,這指示向單鏈的改變。當(dāng)將RNA與DMS0、或與具有序列ppyawa和payawe 的丙氨酸掃描肽(C)孵育時(shí)未觀察到這一效應(yīng)。
實(shí)施例12包括對(duì)從圖28獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖29.-本發(fā)明的幾種肽(plO、pll、p5、pl2和pl5)去結(jié)構(gòu)化或打開(kāi)CUG重復(fù)形成的發(fā)夾環(huán)的比較測(cè)定。
該圖說(shuō)明使用2-氨基嘌呤測(cè)定(與上圖相同)來(lái)測(cè)定從組合肽文庫(kù)的解卷積獲得的除PlO以外的4種肽(pll、p5、pl2和pl5)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明對(duì)肽獲得的活性(表I) 和CUG23探針去結(jié)構(gòu)化二級(jí)結(jié)構(gòu)并變成單鏈的能力之間的相關(guān)性。所有情形中使用的濃度是ΙΟΟμΜφΝΑ比plO的比例為1:100)，其中plO顯示陽(yáng)性響應(yīng)(上圖)。因此，這一實(shí)驗(yàn)證明，雖然PlO因?yàn)榛钚宰顝?qiáng)而是優(yōu)選的肽，但是表I中的其余肽，特別是pll、p5、pl2和 pl5也呈現(xiàn)可觀的特異性和效力水平。
實(shí)施例16包括對(duì)從圖29獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖30.-本發(fā)明的肽(特別是plO)結(jié)合不同于CUG重復(fù)的重復(fù)，諸如，例如，AAG、 CGG、CCUG和CAG形成的發(fā)夾環(huán)的測(cè)定。
該圖說(shuō)明了測(cè)試plO和其結(jié)合不同于CUG重復(fù)、但是也參與其中已描述了具有重復(fù)擴(kuò)增的RNA的毒性的疾病的重復(fù)的能力的實(shí)驗(yàn)。使用了色氨酸消光測(cè)定，使用(I)不同 RNA 濃度(5 μ Μ、7· 5 μ M 和 10 μ Μ)的 plO+AAG、CGG、CCUG 和 CAG。AAG 用作參考重復(fù)(對(duì)照)，原因是已公開(kāi)其不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。另一方面，(2)顯示相同實(shí)驗(yàn)，但使用丙氨酸掃描后獲得的肽之一(ppyawa)并顯示在使用的最高RNA濃度(10 μ M)下獲得的結(jié)果。
實(shí)施例16包括對(duì)從圖30獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖31.-組織病理學(xué)分析實(shí)施例。
FVB小鼠中肌內(nèi)注射0. 2%DMS0 (A)或0. 5 μ g的plO (B)產(chǎn)生小面積的粘液水腫，但在兩種情形中都幾乎沒(méi)有任何相關(guān)的炎癥反應(yīng)。
實(shí)施例13包括對(duì)從圖31獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖32. -plO逆轉(zhuǎn)DMl模型小鼠中的Sercal和Tnnt3剪接缺陷。
肌內(nèi)注射2%DMS0(-)或10μ gplO⑴增加2和4周p/i時(shí)Sercal轉(zhuǎn)錄物外顯子 22的包含百分比(B、C和D)和注射后1、2和4周(p/i ;A、B和C)胎兒Tnnt3的外顯子F 的排除百分比。肽PlO沒(méi)有改變FVB或HSAsk小鼠中這些轉(zhuǎn)錄物的加工，并且也沒(méi)有影響對(duì)照Capzb轉(zhuǎn)錄物(A-C)。圖(A-C)顯示進(jìn)行的25個(gè)循環(huán)的RT-PCR的結(jié)果。水平線以從左到右的順序連接同一動(dòng)物的左肢(注射具有2%DMS0的血清)和右肢(注射10 μ g的肽)。 (D)中的條對(duì)應(yīng)于平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤差。P-值使用T-檢驗(yàn)確定。
實(shí)施例14包括對(duì)從圖32獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖33. -plO對(duì)Sercal可變剪接的系統(tǒng)效應(yīng)。
10 μ gplO注射4周后FVB和HSAsk小鼠中外顯子22 (Y軸)的包含百分比是100%。 這一值在兩條腿都注射2%DMS0的HSAlk動(dòng)物中是16. 8%土 10. 5。在處理的HSAlk動(dòng)物中，包含百分比顯示在注射PlO的腿中是55. 1%±4. 9，在同一動(dòng)物的左腿(注射具有2%DMS0的血清)中是 31.5%±9.8。
實(shí)施例14包括對(duì)從圖33獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
圖34. -plO減少具有中央核的肌肉細(xì)胞的數(shù)目。
用蘇木精伊紅染色的脛骨前肌的冷凍切片顯示HSAik動(dòng)物中中央核的存在(A)，而它們?cè)贔VB動(dòng)物中被置于細(xì)胞的外周(C)。plO顯著降低注射0. 5 μ g和10 μ g經(jīng)過(guò)4周后 HSAle小鼠中具有中央核的纖維的百分比(B和D)。(I)指示對(duì)照為注射0. 2%DMS0的動(dòng)物。(2)指示對(duì)照為注射2%DMS0的動(dòng)物。
實(shí)施例15包括對(duì)從圖34獲得的結(jié)論的詳細(xì)解釋，以及對(duì)其更深入的分析。
下面我們顯示了本發(fā)明中進(jìn)行的實(shí)施例以說(shuō)明所實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，所述實(shí)施例不意圖限制本發(fā)明的范圍。
圖35. -P 10在DMl模型小鼠中肌肉水平的組織學(xué)缺陷。
該圖代表在疾病的小鼠模型中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中檢測(cè)了骨骼肌切片中Clcn-I蛋白的定位。Clcn-I是具有DMl的患者的肌肉組織中在剪接水平發(fā)生改變的基因之一(A)。 觀察到施用PlO導(dǎo)致在膜水平蛋白恢復(fù)到正常水平(B)。肌內(nèi)注射plO在小鼠的后肢在肌肉水平進(jìn)行。這一結(jié)果擴(kuò)大了在體內(nèi)DMl模型中用plO進(jìn)行治療以改善在該人類病理學(xué)中以異常模式表現(xiàn)的細(xì)胞和功能方面的能力(已在圖32-34中觀察到)。實(shí)施例
實(shí)施例I.組合六肽化合物文庫(kù)的篩選
每個(gè)化合物文庫(kù)小瓶包括在指定位置共有單個(gè)氨基酸而在其余位置不同的250 萬(wàn)種肽的混合物(圖1A)。因此，由可占據(jù)6個(gè)位置的20種氨基酸定義的6個(gè)位置的組合導(dǎo)致構(gòu)成化合物文庫(kù)的120個(gè)小瓶，加在一起總共5000萬(wàn)種不同的序列。位置掃描組合化合物文庫(kù)的使用是基于以下原理與其他位置獨(dú)立地測(cè)定分子的每個(gè)位置，使得可以為六肽的六個(gè)位置中的每一個(gè)位置定義最佳候選氨基酸。因此，通過(guò)讀取篩選結(jié)果，獲得了每個(gè)位置的活性最強(qiáng)的氨基酸。隨后，基于它們的組合，合成了具有確定序列的肽(這稱為解卷積)(圖1B)，并再次測(cè)定這些分子。
以80 μ M的濃度對(duì)由處于103Y_Gal4控制下480CTG表達(dá)導(dǎo)致的蛹中的致死表型測(cè)定構(gòu)成化合物文庫(kù)的120個(gè)小瓶。結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析揭示總共28個(gè)陽(yáng)性小瓶(p〈0. 05 ；占全部的23. 3%)，其中的每一個(gè)代表特定位置的活性氨基酸。因此，對(duì)于六肽的位置01、02、 03,04,05和06，分別獲得了總共六、三、六、四、二和七種活性氨基酸(圖2A)。為了進(jìn)行解卷積，基于生物測(cè)定中的活性程度選擇這28種氨基酸中的10種(圖2A)。最后，在可能的組合中，選擇16種序列來(lái)進(jìn)行定義的六肽的合成(圖2B)。這16種肽的選擇是基于相似位置的活性氨基酸的物理和化學(xué)性質(zhì)之間的冗余性標(biāo)準(zhǔn)。
測(cè)定在最高可能濃度下作為溶解它們的DMSO的百分比的函數(shù)的16種定義的六肽。與80μΜ的DMSO濃度的對(duì)照相比，plO顯示出生的雌性數(shù)目的顯著增加。表I指示本發(fā)明的肽的活性。*指示P-值〈O. 05。指示對(duì)照管和處理管中均沒(méi)有雌性出生。
表I
命名/序列濃度處理出生/15
對(duì)照出生pi /SEQ ID NO: I80 μΜO，p2 / SEQ ID NO: 280 μΜp3/SEQ ID NO: 380 μΜ0.8p4/SEQ ID NO: 462 μ Mp5 /SEQ ID NO: 525 μΜ2.0p6 / SEQ ID NO: 625 μΜp7 / SEQ ID NO: 780 μ M1.4p8 / SEQ ID NO: 857 μΜ0.9p9/SEQ ID NO: 980 μΜ2.0piO/SEQIDNO: 10'80 μΜ4.0*pi I /SEQ ID NO: 1180 μΜ0.8pI2/SEQIDNO: 1280 μΜ3.0pi3 /SEQ ID NO; 1380 μΜ0.8pl4/SEQ ID NO: 1440 μΜ1.8pl5/SEQIDNO: 1540 μΜ0.5pI6/SEQIDNO: 1638.5 μΜ0.4
為了證實(shí)plO的效應(yīng)，將plO在以下濃度下進(jìn)行劑量響應(yīng)測(cè)定20μΜ、40μΜ、 80 μ Μ、125 μ Μ、250 μ M (圖3)。PlO在20 μ M和40 μ M未顯示任何活性，而活性在80 μ M (導(dǎo)致雌性數(shù)目為對(duì)照的I. 43倍)和125μΜ(雌性數(shù)目為對(duì)照的I. 47倍)增加。借助非線性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析揭示對(duì)于這一表型，PlO的半有效劑量(ED50)是70. 4 μ Μ。在250 μ M下， 肽的活性降低，可能是用于較高濃度下肽的毒性效應(yīng)。
實(shí)施例2. PlO的毒件研究
為了分析plO的毒性，在自制營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中研究了其對(duì)具有野生型基因型(OrR) 的果蠅的效應(yīng)。由于未知果蠅在此食物中可耐受的DMSO的最大值，所以進(jìn)行了第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)由使個(gè)體從胚胎期或從LI幼蟲(chóng)期經(jīng)受增加濃度的該溶劑組成。自制食物中對(duì) DMSO的耐受性顯示為對(duì)來(lái)來(lái)自供應(yīng)商Sigma的即用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基確定的耐受性的3_4倍大的量級(jí)(O. 3-0. 4%對(duì)比O. 1%，圖4)。對(duì)于從胚胎期用DMSO處理的個(gè)體獲得的存活結(jié)果顯示非常高的變異性(圖4A)，很可能是由于選擇的胚胎中未受精的卵的存在。從幼蟲(chóng)期處理的個(gè)體顯示均一性大得多的行為(圖4B)。因此，決定以增加濃度的PlO飼喂LI幼蟲(chóng)并計(jì)數(shù)到達(dá)蛹和成蟲(chóng)期的個(gè)體。PlO在所測(cè)定的任何濃度下在任何階段中都不具有毒性(67.5μΜ、 125 μ Μ、250 μ Μ、500 μ M和ImM ；η :每種情形下為150個(gè)；圖4C);因此，圖3中顯示的情形可能是基因型依賴性的毒性效應(yīng)。
實(shí)施例3.肽序列中每種氨基酸的相關(guān)性研究
為了確定每個(gè)PlO殘基對(duì)于其對(duì)CTG(480)的活性的貢獻(xiàn)，進(jìn)行了丙氨酸掃描實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)是基于將肽的每個(gè)氨基酸置換為丙氨酸并保持其他氨基酸不變。丙氨酸是小氨基酸，且一般而言活性不是很強(qiáng)；這也是為什么使用丙氨酸進(jìn)行這種類型的研究的原因。 因?yàn)槊總€(gè)丙氨酸置換檢查了個(gè)體氨基酸的貢獻(xiàn)，所以另一方面這一實(shí)驗(yàn)使得(在置換增加分子效力的事件中)評(píng)估Pio是否對(duì)優(yōu)化敏感、或(在置換降低其活性的事件中)確定哪個(gè)氨基酸對(duì)于其功能是重要的成為可能。Pio的序列允許5次置換；為此，合成了 5種新的六肽，對(duì)其就103Y-Gal4 ;UAS_CTG (480)/+果蠅和商購(gòu)食物中的致死表型進(jìn)行測(cè)定。它們均顯示比原始分子更低的活性，這指示PlO序列中的所有氨基酸對(duì)于該肽在此功能測(cè)定中的最終活性是必需的(圖5)。
實(shí)施例4.在其他組織中驗(yàn)證PlO的活性。PlO改善了 CTG(480)在間接飛行肌中引起的組織學(xué)缺陷
因?yàn)镈Ml特征性的主要癥狀影響肌肉，所以決定研究PlO對(duì)模型果蠅中的這一組織的效應(yīng)。處于肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子(Mhc-Gal4系)控制下的CTG(480)表達(dá)導(dǎo)致間接飛行肌(IFM)中組織學(xué)水平的缺陷，包括肌肉纖維的損失和進(jìn)行性變性。這些缺陷影響組織的功能，阻止果蠅飛行。使用Benzer開(kāi)發(fā)的落入圓筒(falling into the cylinder)的方法(Benzer，1973)在自制營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中關(guān)于不能飛行表型對(duì)肽plO進(jìn)行測(cè)定。與用DMSO 的對(duì)照(η 55)相比，未觀察到果蠅飛行能力的改變(測(cè)定濃度62·5μΜ和125μΜ;η :分別為117和77)。然而，3-4日齡的模型果蠅胸部的橫切片的顯微鏡分析揭示在組織學(xué)水平肌肉的改善(圖6)。因?yàn)楣壍娘w行能力對(duì)于IFM肌節(jié)的結(jié)構(gòu)和代謝變化非常敏感，所以后者可能是觀察到的組織學(xué)改善沒(méi)有產(chǎn)生功能改善的原因。
為了證實(shí)這一觀察以及定量所觀察到的效應(yīng)，在以下濃度下對(duì)plO進(jìn)行劑量效應(yīng)測(cè)定62.54 1、1254 11、25(^1和500 μ Μ，并在10日齡果蠅中進(jìn)行半薄組織學(xué)切片(圖 7Α-Ε)。對(duì)處理的果蠅中肌肉區(qū)域的定量揭示顯著的劑量依賴性改善(圖7F)。這些結(jié)果還證明PlO的效應(yīng)獨(dú)立于組織特異性因素，因?yàn)閜lO在腦和肌肉二者中都有活性。然而，在 500 μ M下，肌肉顯示降低的大小和果蠅的存活力下降。
實(shí)施例5.包含DlO的L-氨基酸肽的內(nèi)源表汰抑制CTG重復(fù)引起的表型
plO的施用抑制CTG(480)引起的至少部分表型。因?yàn)樵诒景l(fā)明初步進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中PlO是添加到食物中的，難以確定有多少分子最終到達(dá)細(xì)胞。為了能夠精確控制PlO的施用和確保與CUG(480)轉(zhuǎn)錄物在相同的時(shí)間存在于相同的組織，使用Gal4/UAS系統(tǒng)產(chǎn)生能夠以內(nèi)源和受控方式表達(dá)PlO的轉(zhuǎn)基因果蠅。
因此，用SEQ ID NO :17_19 (pl7_pl9)設(shè)計(jì)了三種不同的轉(zhuǎn)基因，它們編碼不同的肽，全部基于對(duì)應(yīng)于PlO的序列SEQ ID NO :10(圖9)，考慮果蠅中的密碼子使用偏好(即在同義位點(diǎn)偏愛(ài)使用G且特別是C ；Powell&Moriyama, 1997)和向序列SEQ ID NO 10添加初始的蛋氨酸以及三個(gè)間隔甘氨酸。此外，在ATC起始密碼子上游添加包括Kozak序列的果蠅act5C基因5’ UTR端的21個(gè)核苷酸以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
pl7含有SEQ ID NO : 10的肽的直接序列。如以上所討論的，六肽化合物文庫(kù)中的肽包括D-氨基酸。氨基酸的D-形式(右旋物)是L-形式(左旋物)的立體異構(gòu)體和并且在細(xì)胞中僅有L-氨基酸合成和摻入蛋白。因此，如果PIO的側(cè)鏈布置對(duì)其功能是重要的，那么當(dāng)由果蠅從L-aa合成pl7時(shí)，功能將丟失。為此，決定產(chǎn)生構(gòu)建體pl8，其中SEQ ID NO: 10的肽序列被倒置，產(chǎn)生逆-反肽(Chorev&Goodman, 1995 ；P. M. Fischer, 2003)。同時(shí),在產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因時(shí)，文獻(xiàn)中描述的最小構(gòu)建體編碼具有多于20個(gè)氨基酸的肽，這比肽pl7 和Pl8(其僅具有十個(gè)氨基酸)的大小的兩倍更大。為此，產(chǎn)生了 pl9，其組合了肽pl7和 P18的構(gòu)建體，產(chǎn)生具有19個(gè)氨基酸的肽。將這三種構(gòu)建體顯微注射到果蠅胚胎種系的前體中，得到每個(gè)轉(zhuǎn)基因10個(gè)轉(zhuǎn)基因果蠅系。
將獲得的轉(zhuǎn)基因果蠅與本發(fā)明過(guò)程中產(chǎn)生的GMR-Gal4UAS_CTG (480) /CyO和 Mhc-Gal4 UAS-CTG (480) /TM6b重組果蠅系雜交，其分別指導(dǎo)CTG重復(fù)在眼睛和肌肉中的表達(dá)。與 sev-Gal4UAS-CTG (480) /+ 果蠅的情形相同，成體GMR-Ga14UAS-CTG (480) /UAS-GFP 果蠅呈現(xiàn)強(qiáng)烈的粗糙眼睛表型。CTG(480)和pl8或pl9(但不是pl7)在19° C和21° C的共表達(dá)導(dǎo)致果蠅具有比對(duì)照個(gè)體的那些粗糙明顯降低的眼睛(圖11 ;圖10B-C和E-F)。這些結(jié)果證實(shí)含有逆_反布置的PlO序列的L-氨基酸肽能夠抑制重復(fù)觸發(fā)的表型，并且表明盡管肽pl8和pl9的短尺寸，它們被翻譯并具有活性，因?yàn)槠浔磉_(dá)改變了 CTG(480)的毒性。 然而，在25° C和在29° C發(fā)生了相反的現(xiàn)象。在25° C，pl8或pl9的內(nèi)源表達(dá)增強(qiáng)了 CTG重復(fù)的毒性，產(chǎn)生尺寸更小的眼睛，具有色素沉著喪失和小眼的異常融合(圖10H-I)。 在29。C，GMR-Gal4UAS-CTG(480)/Cy0和UAS_pl8或UAS_pl9果蠅之間的雜交沒(méi)有產(chǎn)生不具有CyO平衡器的后代，這指示plO降低GMR-Gal4 UAS-CTG (480)個(gè)體在所述溫度下的存活力。值得注意的是P18和pl9本身在25° C和29° C的表達(dá)不產(chǎn)生任何表型(圖10G)。 鑒于溫度的變化以不同方式影響CTG(480)轉(zhuǎn)基因和肽pl7-pl9的表達(dá)，因?yàn)楹笳卟迦牖蚪M的不同區(qū)域，所以肽的量和必須達(dá)到的重復(fù)的量之間可能存在關(guān)聯(lián)，然后PlO變得有毒性。
顯著地，測(cè)定的所有攜帶pl8轉(zhuǎn)基因(UAS-plS)的系(即5種)和三個(gè)攜帶pl9 轉(zhuǎn)基因(UAS-pl9)的系中的一個(gè)改變了 GMR-Gal4UAS-CTG(480)果蠅的表型，而測(cè)定的構(gòu)建體pl7(UAS-pl7)的五個(gè)系中沒(méi)有一個(gè)做到。這指示PlO氨基酸側(cè)鏈的方向在其活性中起關(guān)鍵作用。
Mhc_Gal4系中CTG(480)和pl8或pl9在25° C的共表達(dá)還抑制新孵化的成蟲(chóng)中 IFM的組織學(xué)缺陷，增加了肌肉組的大小(圖12)。這證實(shí)了 plO對(duì)CTG(480)的效應(yīng)。再次地，僅有那些攜帶P18和pl9轉(zhuǎn)基因的系改變了表型。
實(shí)施例6. PlO作用機(jī)制的研究
體內(nèi)獲得的結(jié)果證明了 plO對(duì)CTG重復(fù)的毒性的效應(yīng)。此外，圖13顯示概括plO 如何可以發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)的幾種假設(shè)。在第一方面，PlO可能通過(guò)干擾Gal4/UAS系統(tǒng)或降低毒性RNA的穩(wěn)定性影響CUG (480)轉(zhuǎn)錄物的水平(圖13A)。另一方面，plO可能結(jié)合 CUG重復(fù)，由此釋放掩蔽的核因子，諸如Mbl。這樣，所述蛋白能夠再次執(zhí)行其正常功能(圖 13B)。plO還可能結(jié)合CUG重復(fù)，防止這些折疊形成毒性雙鏈發(fā)夾環(huán)(圖13C)。最后，plO可能作用于位于重復(fù)引起的改變的下游的其他蛋白或轉(zhuǎn)錄物，抑制例如Mbl的拮抗劑并因此補(bǔ)償這些蛋白的功能缺失(圖13D)。
為了研究提出的每種假設(shè)，決定在分子水平和體外進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，下文詳細(xì)解釋了這些實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例7. PlO不影響CTG(480)的表汰水平
為了研究plO是否影響CTG(480)的表達(dá)，使用了兩種不同的策略。在第一方面， 向Mhc-Gal4/+;UAS-螢光素酶/+果蠅飼喂自制營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中250 μ M的肽。plO導(dǎo)致光發(fā)射水平的略微降低。然而，這一差異相對(duì)于用DMSO的對(duì)照并不顯著(α=0.05，Τ_檢驗(yàn)；圖 14)，這證明該肽不以非特異性方式影響Gal4/UAS系統(tǒng)。然而，對(duì)照果蠅的DMSO自身在食物中的存在導(dǎo)致螢光素酶蛋白水平的增加。這些結(jié)果表明，溶劑可能影響該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)， 可能是由于描述為抑制位置依賴性上色的效應(yīng)。
在第二方面，借助RT-PCR確定了 plO是否特異地影響CUG(480)轉(zhuǎn)錄物的水平，從用不同濃度的PlO飼喂Mhc-Gal4/+;UAS-CTG/+果蠅開(kāi)始。定量PCR反應(yīng)中獲得的條帶的強(qiáng)度之后，未在任何濃度檢測(cè)到CUG (480)水平的顯著差異(圖15)，這證明plO不影響轉(zhuǎn)錄物的量。
實(shí)施例8d10和Mbl之間的序列相似件研究
借助生物計(jì)算機(jī)分析，使用MEGA序列比較程序(www. megasoftware, net),發(fā)現(xiàn) plO的氨基酸與Muscleblind蛋白的第一鋅指的保守序列的反向部分比對(duì),第一鋅指是該蛋白借以結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域(圖16)。在這一比對(duì)中，plO的色氨酸與Mbl的苯丙氨酸(一種也是芳香、非極性和疏水的氨基酸)位置一致，其介導(dǎo)該蛋白與CUG重復(fù)的結(jié)合。鑒于此相似性，決定研究該肽對(duì)Mbl與毒性RNA結(jié)合的效應(yīng)。
實(shí)施例9. Mbl鐸指的表汰和純化
為了驗(yàn)證該肽是否能夠與Mbl競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合重復(fù)，決定進(jìn)行RNA和蛋白之間的體外結(jié)合測(cè)定。為了進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)，必須表達(dá)和純化Mbl蛋白。出于多種原因，僅使用了對(duì)應(yīng)于Mbl 的鋅指的部分(MblZF，氨基酸1-98)。在第一方面，果蠅中存在7種不同的Mbl同種型。除了 MblD同種型以外，它們?nèi)抗灿泻袃蓚€(gè)鋅指(Nt端)的區(qū)域并在Ct序列上不同。另一方面，MBNLl和Mbl的鋅指均足以結(jié)合其靶序列。
在衍生載體中克隆pET_15b商購(gòu)載體期間，將MblZF蛋白與6組氨酸融合以便于其純化，以及與TEV(Tobacco Etch Virus，煙草蝕紋病毒)蛋白酶裂解位點(diǎn)融合。為了發(fā)現(xiàn) MblZF在大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)的最優(yōu)條件，測(cè)定了不同因素的組合。在第一方面，我們從三種不同的細(xì)菌菌株起始。菌株BL21(DE3)是為基于T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)設(shè)計(jì)的菌株。該菌株足以表達(dá)非毒性重組蛋白。如果待表達(dá)的蛋白有毒性，大腸桿菌BL21pLys(DE3) 菌株具有組成型表達(dá)低水平T7溶菌酶的優(yōu)點(diǎn)，T7溶菌酶通過(guò)抑制T7 RNA聚合酶的水平降低重組基因的基線表達(dá)。最后，菌株BL2 IpLys (DE3) Codon+含有編碼用于人類密碼子的 tRNA而細(xì)菌中的水平非常低的基因。在第二方面，鋅指結(jié)構(gòu)域是在其半胱氨酸和組氨酸殘基之間結(jié)合鋅離子的一個(gè)原子的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。鋅金屬對(duì)于此類結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性是關(guān)鍵的，因?yàn)樵诓淮嬖阡\金屬時(shí)，鋅指展開(kāi)并失去結(jié)合其靶標(biāo)的能力。為此，在貫穿MblZF蛋白的表達(dá)使用的所有培養(yǎng)基中測(cè)定了兩種不同濃度的ZnCl2 (50 μ M和100 μ Μ)。此外，具有鋅指的蛋白往往是非常難溶且不穩(wěn)定的分子。為此，我們測(cè)定兩種不同的誘導(dǎo)溫度，30° C和1916° C。在測(cè)試的所有組合中，我們?cè)谑褂镁闎L21(DE3)、50yM濃度2冗12和16° C的誘導(dǎo)溫度以及ImM IPTG時(shí)成功獲得了高比例的可溶MblZF (圖17A)。
通過(guò)親和層析在FPLC系統(tǒng)中進(jìn)行純化過(guò)程，貫穿純化過(guò)程保持培養(yǎng)基中鋅的存在。蛋白的洗脫峰發(fā)生在大約300mM咪唑處(圖17B)。獲得的總蛋白濃度是2. 73mg/ ml(198yM;圖17C)，這意味著1.4mg蛋白/I培養(yǎng)基的收率。在隨后的純化循環(huán)中，該值未以顯著方式改變。
為了驗(yàn)證純化的蛋白在純化后處于其天然構(gòu)象，分析了其圓二色性(⑶)光譜。圓二色性是基于分子對(duì)右和左圓偏振光束的差異吸收的電子吸收光譜技術(shù)。因?yàn)椴煌牡鞍拙哂胁煌膱A二色性光譜，該技術(shù)使得能夠通過(guò)與理論光譜進(jìn)行比較來(lái)鑒定不同分子的構(gòu)象(圖18B)。在磷酸緩沖液中獲得的MblZF圓二色性光譜與對(duì)于MBNLl的鋅指所描述的光譜相似，具有203nm的顯著峰,這表示缺乏結(jié)構(gòu),和220nm的弱峰,這指示α螺旋(圖 18Α)。在MblZF的情形下，這一模式是保守的，盡管值略微向右改變(圖18C)。最后，為了確定MblZF是作為在溶液中的單體發(fā)現(xiàn)還是形成復(fù)合物，我們進(jìn)行了分子排阻層析(圖18D)。 分子排阻層析是分子按其分子量的函數(shù)分離的柱層析方法。獲得的MblZF排阻體積對(duì)應(yīng)于 13. 4KDa的分子量，等于單體形式的蛋白大小。層析圖揭示單一洗脫峰，這證明MblZF在溶液中沒(méi)有與自身形成復(fù)合物，至少在測(cè)定條件下如此。
實(shí)施例10.在體外DlO結(jié)合CUG重復(fù)伯不與MblZF競(jìng)每
在體外研究蛋白和核酸之間的相互作用的不同技術(shù)中，熒光偏振(FP)測(cè)定由于其快速性和靈敏性而是突出的。該技術(shù)基于懸浮液中熒光分子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的變化。因此， 當(dāng)偏振光束激發(fā)與小分子偶聯(lián)的熒光團(tuán)時(shí)，后者經(jīng)歷比光的發(fā)射所需的時(shí)間更快的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散，這造成分子在熒光發(fā)射時(shí)的隨機(jī)排列(解偏振)。然而，當(dāng)介質(zhì)的粘度或分子體積變化時(shí)，分子的旋轉(zhuǎn)變得更慢，增加了發(fā)射光的偏振。因此，通過(guò)測(cè)量分子的偏振變化，可以檢測(cè)后者和添加到介質(zhì)中的另一分子之間的結(jié)合(圖19)。在本發(fā)明中，這些分子是plO、MblZF 和與羧基熒光素?zé)晒鈭F(tuán)偶聯(lián)的23CUG重復(fù)(FAM-(CUG) 23)。
為了準(zhǔn)備FP實(shí)驗(yàn)，第一方面測(cè)定了 FAM-(CUG)23RNA的兩種不同濃度(6nM和 60nM)。在兩種情形中，檢測(cè)RNA并觀察到加入MblZF后熒光偏振值的顯著增加(p-值 〈O. 0001)，這指示發(fā)生了結(jié)合。為了減少探針和蛋白的使用，決定在6nM FAM-(CUG) 23濃度進(jìn)行。觀察到的MblZF和FAM-(CUG) 23之間的相互作用與蛋白的量成正比(圖20B)。結(jié)合曲線的統(tǒng)計(jì)分析得到900nM的理論IC50。為了核實(shí)此結(jié)合的特異性，進(jìn)行了與未標(biāo)記的 RNA (CUG) 23 (相對(duì)于FAM- (CUG) 23為1:10、1:100和1:200)的競(jìng)爭(zhēng)研究。在所有情形中，觀察到在測(cè)定的所有未標(biāo)記的探針濃度下的競(jìng)爭(zhēng)(圖20A)。plO還導(dǎo)致FAM-(CUG) 23的偏振的略微增加(P-值0.0176 ;圖20D)。然而，加入增加量的plO沒(méi)有產(chǎn)生結(jié)合曲線，可能是由于PlO的小尺寸(圖20D)。plO和MblZF向FAM-(CUG) 23的共加入導(dǎo)致比單獨(dú)加入MblZ 所導(dǎo)致的RNA偏振的更大增加(P-值0. 0158 ;圖20C)。該結(jié)果指示兩種分子均可結(jié)合RNA 而不干擾另一個(gè)的結(jié)合。然而，共加入MblZF和plO后偏振值的增加低于兩者單獨(dú)導(dǎo)致的增加之和(AmP(Mbl) 99. 5 ； AmP(p88) 21. 75 ； ΔmP(Mbl+p88) :108· 25)，這不排除部分競(jìng)爭(zhēng)的存在。
FP測(cè)定中P10引起的RNA變化很小，可能是由于該分子的低分子量(低于900Da)。 為此，決定用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)來(lái)補(bǔ)充該研究。這些測(cè)定是基于穩(wěn)定的蛋白-核酸復(fù)合物和它們的單獨(dú)組分之間電泳遷移率的差異。因?yàn)镕AM- (CUG) 23RNA是可用的，決定制備熒光凝膠阻滯測(cè)定。確定檢測(cè)的RNA的最優(yōu)量之后(60nM ;圖21A)，研究了后者和MblZF之間的結(jié)合。 所述結(jié)合引起凝膠中對(duì)應(yīng)于游離RNA的條帶強(qiáng)度的降低和凝膠孔內(nèi)部信號(hào)的出現(xiàn)(結(jié)合的 RNA)。然而，沒(méi)有觀察到凝膠中的阻滯條帶，這指示所有結(jié)合后形成的復(fù)合物保留在孔中。 當(dāng)結(jié)合與未標(biāo)記的(CUG)23探針(1:100)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，孔內(nèi)部的信號(hào)降低，這證明相互作用的特異性。此外，當(dāng)將熒光RNA與熱變性的MblZF蛋白孵育時(shí)，未發(fā)生結(jié)合，當(dāng)在FAM-(CUG) 23 和與MblZF濃度相同的不同的蛋白(膠原α 3)之間進(jìn)行反應(yīng)時(shí)也沒(méi)發(fā)生，再次證實(shí)結(jié)合的特異性(圖21Β)。
為了排除FAM-(CUG) 23可能結(jié)合MblZF的6_組氨酸標(biāo)簽的可能性，借助用TEV 蛋白酶消化除去6-組氨酸標(biāo)簽(圖22A-C)。沒(méi)有組氨酸的MblZF蛋白(MblZF"His)保持 RNA-結(jié)合能力(圖22D)。
MblZF和FAM-(CUG) 23之間形成的復(fù)合物在孔中的保留可能是由RNA和蛋白之間形成大型聚集體引起的。為了降低所述復(fù)合物的大小，我們使用了具有4CUG重復(fù)的 RNA(FAM-(CUG) 4) 0MBNLI的鋅指可結(jié)合最低由4個(gè)三聯(lián)體形成的CUG重復(fù)，條件是通過(guò)向序列的中部加入4個(gè)非互補(bǔ)核苷酸來(lái)促進(jìn)環(huán)的形成。如圖21C所示，MblZF結(jié)合FAM-(CUG)4， 但形成的復(fù)合物同樣保留在孔中。
MblZF的等電點(diǎn)(Ip)是9. 5。我們的測(cè)定中使用的電泳緩沖液的pH是8. 5，這意味著凝膠中MblZF的總電荷是正的。阻滯凝膠是非變性凝膠；因此，介質(zhì)中不存在向分子賦予負(fù)電荷以使其向陽(yáng)極遷移的SDS。一般而言，這在凝膠阻滯測(cè)定中通常不是缺點(diǎn)，因?yàn)?RNA具有負(fù)電荷并能夠在電泳過(guò)程中拖曳復(fù)合物。然而，決定通過(guò)使復(fù)合物在孔置于中央的水平2. 5%瓊脂糖凝膠中電泳并用考馬斯染色來(lái)驗(yàn)證FAM- (CUG) 23是否能夠移動(dòng)MblZF (圖 23A)。在該實(shí)驗(yàn)中，MblZF蛋白單獨(dú)向負(fù)極遷移，與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的方向相反。當(dāng)將MblZF 與FAM-CUG(23)孵育時(shí)，向負(fù)極遷移的蛋白(可能未結(jié)合的蛋白)的量降低，但是朝向凝膠陽(yáng)極側(cè)仍然沒(méi)有出現(xiàn)信號(hào)，甚至當(dāng)在大于MblZF的Ip的pH 10. 5進(jìn)行電泳時(shí)也如此(圖 23B)。
為了賦予必需的負(fù)電荷，通過(guò)用甲醛(FA)交聯(lián)固定FAM-(CUG)23_MblZF復(fù)合物， 并在聚丙烯酰胺凝膠中在變性條件下對(duì)反應(yīng)進(jìn)行電泳(在SDS存在下；圖23C)，或可選地， 通過(guò)加入Serva Blue G，其賦予蛋白電荷而不將蛋白變性。在任何情形下，都沒(méi)有復(fù)合物穿透到凝膠內(nèi)部。
為了確定plO是否可以結(jié)合CUG RNA分子，決定在肽和FAM-(CUG) 23之間進(jìn)行相似的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。PlO結(jié)合RNA，部分復(fù)合物保留在孔中，如對(duì)于MblZF所描述的。然而， 在這一情形中，在凝膠內(nèi)部觀察到阻滯條帶(圖24A)。plO在高肽濃度(500 μ M和更高，圖 24Β)下結(jié)合FAM-(CUG)23，這指示兩種分子之間的低親和力，至少在測(cè)定條件下如此。減小重復(fù)的大小后該親和力降低(FAM-(CUG)4，圖24C)。為了確定plO是否可以與MblZF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA，將兩者都在FAM-(CUG) 23存在下孵育。plO不阻止MblZF的結(jié)合，因?yàn)樵谶@一情形中所有RNA都保留在孔中(圖24D)。這可能是由于蛋白和肽之間的協(xié)同效應(yīng)或，如果兩者結(jié)合不同的RNA位點(diǎn)，由于加成效應(yīng)。
實(shí)施例11.D10以比其他序列更高的親和力結(jié)合CUG重復(fù)
為了研究在PlO和CUG重復(fù)之間觀察到的結(jié)合的特異性，進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在第一方面，測(cè)定了丙氨酸掃描過(guò)程中產(chǎn)生的五種六肽。其中沒(méi)有一個(gè)顯著結(jié)合FAM-(CUG) 23 (圖 25A)，這證明所有plO殘基對(duì)于與RNA的相互作用是必需的。有意思的是，這些肽沒(méi)有抑制 CTG(480)轉(zhuǎn)基因在果蠅中的毒性，這指示plO結(jié)合CUG重復(fù)的能力是其體內(nèi)活性必需的。在第二方面，我們研究了 PlO對(duì)雙鏈的和單鏈的、用羧基熒光素(FAM)熒光標(biāo)記的其他RNA和 DNA序列的作用(圖25C)。所述分子包括(I)來(lái)自DMPK基因的3’UTR區(qū)域的由19nt構(gòu)成的單鏈RNA(ssRNA)，⑵與DMPK的單鏈序列融合的由4CUG重復(fù)構(gòu)成的RNA (ds+ssRNA)，(3)能夠形成完美雙鏈發(fā)夾環(huán)的包括4CAG · CUG重復(fù)的RNA(dsRNA)，(4)由4CTG重復(fù)構(gòu)成的DNA(dsDNA)和(5)對(duì)應(yīng)于DMPK基因的3’UTR區(qū)域的相同19nt的DNA。plO在所有情形中均結(jié)合(圖25B)。此外，具有序列(GUC)4(人類MBNLl蛋白的鋅指不與其結(jié)合)的未標(biāo)記的突變的RNA和tRNA改變plO和FAM- (CTG) 23之間的結(jié)合?？傊@些數(shù)據(jù)表明plO與 RNA的結(jié)合是序列特異性的(因?yàn)槠渌娘@示不同的行為)，并且該肽可以結(jié)合不止一種類型的核酸。
然而，plO以不同的親和力結(jié)合所研究的每個(gè)序列是可能的。由于凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的肽-RNA和肽-DNA復(fù)合物保留在孔中，所以無(wú)法確定每種相互作用的解離常數(shù)(Kd)。 為了定量PlO和所述核酸之間的結(jié)合以及在所有情形中排除肽結(jié)合羧基熒光素的可能性， 決定準(zhǔn)備PlO序列中存在的色氨酸的固有熒光消光實(shí)驗(yàn)。色氨酸具有在280nm波長(zhǎng)的最大吸收和在300和350nm之間的最大發(fā)射峰(取決于溶劑極性)。當(dāng)包含該殘基的蛋白的構(gòu)象被例如結(jié)合另一分子改變時(shí)，該殘基的熒光也改變。因此，將增加量的DMPK-CUG4、DMPK和 CAG .CUG4RNA分子、以及CTG4和DMPK DNA與固定量的plO (5 μ Μ)孵育，并在351nm測(cè)量肽的熒光發(fā)射的變化。在所有情形中，信號(hào)與介質(zhì)中加入的RNA或DNA的量成正比地下降，這證實(shí)了先前觀察到的結(jié)合。然而，每種濃度點(diǎn)發(fā)射的熒光相對(duì)于游離肽的熒光的直線表示導(dǎo)致具有不同斜率的直線，這指示對(duì)于不同的核酸熒光消光率(且因此結(jié)合親和力)是不同的(圖 26)。DMPK-CUG4 分子(-0. 034±0. 003)的曲線斜率顯著大于 CTG4 (-0. 019±0· 005) 和 DMPK(RNA -0. 024±0. 003 和 DNA -0. 028±0. 002)的曲線斜率(P-值〈O. 01)。然而， 對(duì)于CAG *CUG RNA(-0. 028±0. 003)，這一差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p-值>0. I ;圖26B)。 DMPK-CUG4分子含有在DMPK環(huán)境中的CUG重復(fù)?？傊?，這表明肽的部分上存在靶標(biāo)結(jié)合選擇性；因此，其在體內(nèi)優(yōu)選地結(jié)合毒性RNA是可能的。
實(shí)施例12. PlO引起CUG重復(fù)的構(gòu)象改變
為了研究plO誘導(dǎo)的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能變化，第一方面我們使用具有未標(biāo)記的 CUG重復(fù)(CUG60)的RNA進(jìn)行了圓二色性(CD)實(shí)驗(yàn)。核酸的圓二色性由構(gòu)成其序列的堿基的堆疊引起。因此，當(dāng)分子結(jié)合RNA時(shí)，影響其結(jié)構(gòu)，因此在其CD光譜中檢測(cè)到變化。將 CUG60RNA(lyM)與MblZF蛋白(111|1和1.5111)孵育降低了后者發(fā)射的信號(hào)強(qiáng)度，雖然它沒(méi)有改變光譜中的峰波長(zhǎng)(圖27A)，這指示MblZF的結(jié)合影響RNA堿基的組裝。當(dāng)我們將 RNA與增加濃度的SEQ ID NO :10的肽(O. I μ M、0. 5 μ M、I μ M、10 μ M和20 μ M)孵育時(shí)，觀察到相似的效應(yīng)(圖27Β)。在讀數(shù)期間，將RNA保持在10° C的二色儀(dichrograph)內(nèi)部的比色杯中。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的3個(gè)小時(shí)期間，RNA可能已被降解；這可能解釋了觀察到的信號(hào)強(qiáng)度的降低。為了排除這一可能性，在O和3h時(shí)間測(cè)量了 CUG60 RNA的CD光譜，并在所有時(shí)間下將CUG60 RNA保持在10° C。3小時(shí)時(shí)，CUG60的光譜未顯示相對(duì)于O時(shí)獲得的光譜的任何變化，這證明觀察到的效應(yīng)是特異性的(圖27D)。此外，丙氨酸掃描肽p29. I (O. 5 μ M和I μ M)和ρ29. 4(1 μ Μ)沒(méi)有改變RNA光譜(圖27Ε和27F)，由此證實(shí)結(jié)合特異性。最后， 當(dāng)將MblZF (O. 5 μ Μ)添加至IJ RNA,然后添加plO (O. 5 μ M)時(shí)，或反之亦然，沒(méi)有觀察到CD信號(hào)的增加，這表明它們中的一個(gè)在RNA中產(chǎn)生的變化不是被另一個(gè)的隨后加入可逆轉(zhuǎn)的。
這些結(jié)果證明plO降低RNA堿基的堆疊，并因此影響該分子的二級(jí)構(gòu)象。為了證實(shí)所述變化是否導(dǎo)致發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的喪失，使用包括23CUG重復(fù)的RNA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其中鳥(niǎo)嘌呤已被置換為其類似物2-氨基嘌呤(2-ΑΡ-(CUG) 23)。當(dāng)2-ΑΡ處于單鏈環(huán)境時(shí)，其發(fā)射375nm的熒光。然而，當(dāng)該分子形成雙螺旋的一部分時(shí)，所述發(fā)射被顯著熄滅。在CD和 Trp-FQ實(shí)驗(yàn)中已檢測(cè)到結(jié)合的低濃度MblZF和plO下(RNA:蛋白彡1:5)，它們沒(méi)有一個(gè)引起2-AP的熒光變化(圖28A-B)。然而，在將plO的濃度增加至100 μ M(RNA:肽1:100)后， 2ΑΡ- (CUG) 23RNA經(jīng)歷構(gòu)象變化，從雙鏈變成單鏈，該分子的熒光發(fā)射具有2. 9-倍增加(圖 28Β)。為了證實(shí)這一效應(yīng)的特異性,進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn),將丙氨酸掃描肽(payawe和ppyawa) 以與PlO相同的濃度(IOOyM)與2-AP-(CUG) 23RNA孵育。這些肽沒(méi)有一個(gè)引起熒光發(fā)射的改變；DMS0本身也沒(méi)有(圖28C)。因此，這些結(jié)果表明plO能夠使CUG重復(fù)形成的雙鏈去穩(wěn)定化，并證實(shí)MblZF和肽以不同的方式結(jié)合RNA。
實(shí)施例13.在DMl小鼠模型中驗(yàn)丨正PlO的效應(yīng)。plO在哺乳動(dòng)物中的毒性研究
為了研究plO在哺乳動(dòng)物中可能的毒性效應(yīng)并為隨后的測(cè)定建立最大耐受劑量， 將該肽施用給來(lái)自FVB野生型株系的小鼠。由于腸壁對(duì)肽的低吸收，決定在4-5周齡動(dòng)物的脛骨前肌中進(jìn)行肌內(nèi)注射，使用四種不同的劑量(O. 5 μ g、I μ g>10y g和100 μ g),每種劑量共6只小鼠(3只雌性和3只雄性)。注射后4周，處死動(dòng)物并進(jìn)行目測(cè)尸檢，聯(lián)合進(jìn)行肌肉的組織形態(tài)學(xué)研究和血液測(cè)試(圖31)。作為對(duì)照，使用注射相同量的DMSO(對(duì)于 O. 5- μ g和I- μ g劑量為O. 2%，對(duì)于10- μ g和100- μ g劑量為2%)的動(dòng)物。
處理動(dòng)物的目測(cè)尸檢和肌肉的組織學(xué)分析未揭示相對(duì)于DMSO對(duì)照的顯著差異。 在一些情形中，觀察到輕微的粘液水腫(液體積累)跡象，并且偶爾觀察到輕度炎癥，可能是由注射本身引起的(圖31)。然而，血液測(cè)試確實(shí)顯示處理動(dòng)物和對(duì)照之間的差異。我們測(cè)量了作為腎活性的標(biāo)志物的血液中膽酸、尿素和肌酸酐的量。肌酸磷酸激酶(CPK)用作骨骼肌和心臟損失標(biāo)志物，堿性磷酸酶(AP)、Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(GGT)和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)用作肝損失標(biāo)志物。所有動(dòng)物(包括對(duì)照)顯示相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)值的高尿素和AP 值。此外，經(jīng)受2%DMS0的對(duì)照動(dòng)物顯示異常高的GPT和CPK值。這可能是由于DMSO的毒性或由于注射本身造成的。然而，ΙΟ-yg和100-yg劑量甚至顯示比對(duì)照更高的血液尿素和GPT值。尿素是蛋白代謝的最終結(jié)果。其在肝中形成并在尿中消除。如果腎不能正確行使功能，尿素在血液中積累。GPT是在肝中以高濃度存在而在腎、心臟和肌肉中以較低濃度存在的酶。當(dāng)這些器官中存在損傷時(shí)，該酶被釋放到血液中并在測(cè)試中顯示是高的。此外， 值得注意的是用100-μ g劑量處理的小鼠中有兩只小鼠在注射后(p/i)大約11天死亡，這證實(shí)了當(dāng)PlO超出閾值后的毒性。可以在這兩只動(dòng)物臨死前從其中一只抽血。該小鼠呈現(xiàn)極高的血液尿素、肌酸酐、CPK和GGT值(例如，CPK值為標(biāo)準(zhǔn)值上限的28倍大并且為DMSO 對(duì)照的15倍大)。
實(shí)施例14. PlO逆轉(zhuǎn)HSAlb小鼠中Sercal和Tnnt3轉(zhuǎn)錄物的翦接缺陷
plO抑制CTG(480)在果蠅CNS、肌肉和眼睛中的效應(yīng)并在體外結(jié)合CUG重復(fù)。為了驗(yàn)證這些結(jié)果在DMl哺乳動(dòng)物模型中的相關(guān)性，決定在HSAik小鼠中測(cè)定plO。這些小鼠在異源轉(zhuǎn)錄物人類骨骼肌動(dòng)蛋白(HSA)中表達(dá)250CUG重復(fù)并再現(xiàn)DMl的大多數(shù)癥狀，包括轉(zhuǎn)錄物可變剪接的缺陷?；颊吆虷SAik小鼠二者中剪接改變的最明顯的實(shí)例之一是Ca+2-依賴性ATP酶Sercal轉(zhuǎn)錄物的外顯子22的剪接改變。在健康群體中，所述外顯子在胎兒形式中被排除并包括在成體中。然而，在患者和HSAik小鼠二者中，外顯子22在整個(gè)生命中被排除，并因此在成年個(gè)體中維持胎兒模式。Tnnt3蛋白發(fā)現(xiàn)于骨骼肌中快速抽搐的肌肉纖維的肌節(jié)中。其轉(zhuǎn)錄物經(jīng)歷所謂的胎兒外顯子F的可變剪接。在健康群體中，所述外顯子在成年個(gè)體中是不存在的，而在DMl患者和HSAik小鼠中，胎兒外顯子被維持。
為了確定plO是否可以逆轉(zhuǎn)HSAik小鼠中Sercal和Tnnt3的剪接缺陷，施用該肽的兩個(gè)劑量的肌內(nèi)注射0. 5 μ g和10 μ g。注射后I周、2周和4周處死處理的動(dòng)物，并解剖右腿(注射plO)和左腿(對(duì)于O. 5- μ g劑量，注射于鹽水血清中的O. 2%DMS0,對(duì)于10- μ g 劑量，注射于鹽水血清中的2%DMS0) 二者的脛骨前肌。作為對(duì)照，我們使用在兩條腿中以相似方式注射的FVB動(dòng)物和HSAsk動(dòng)物(其表達(dá)人類骨骼肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄物中的5CUG重復(fù))以及在兩個(gè)肢體中注射具有DMSO的血清的HSAlk小鼠。
用O. 5 μ g處理的動(dòng)物的Sercal和Tnnt3轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR分析分別未揭示在測(cè)定的任何時(shí)間外顯子22和胎兒F的包括的顯著變化(凝膠未顯示)。然而，在5只注射IOyg 的動(dòng)物中的兩只動(dòng)物中，PlO逆轉(zhuǎn)了兩種情形下的剪接缺陷(圖32A-C)。鑒于對(duì)Tnnt3轉(zhuǎn)錄物獲得的復(fù)雜條帶模式，我們無(wú)法精確定量PlO誘導(dǎo)的胎兒外顯子F的排除百分比的增加。在Sercal的情形下，plO使外顯子22的包含百分比增加I. 3%(I周p/i，p-值>0. 05)、 25. 9%(2 周 p/i, P-值〈O. 05)和 38. 3%(4 周 p/i, p-值〈O. 01)(圖 R40D)。最后，plO 沒(méi)有影響Capzb基因的肌肉轉(zhuǎn)錄物的剪接，該轉(zhuǎn)錄物因?yàn)槠浼庸ぴ谀Ｐ虷SA^小鼠中不改變而用作特異性對(duì)照(圖32A-C)。
對(duì)4周p/i時(shí)同一動(dòng)物右腿(注射plO)和左腿(注射血清和2%DMS0)中Sercal 轉(zhuǎn)錄物的加工的分析揭示，在未處理的肢體中，外顯子22的包含百分比大于兩條腿中注射 DMSO的HSAlk動(dòng)物顯示的百分比(圖33)。這指示通過(guò)血液到達(dá)左側(cè)肢體的脛骨前肌的plO 的量足以以系統(tǒng)方式部分逆轉(zhuǎn)剪接缺陷。
實(shí)施例15. PlO逆轉(zhuǎn)HSAlb小鼠的肌肉中的組織學(xué)缺陷
DMl和HSAik動(dòng)物的主要組織學(xué)水平特征是肌肉纖維中存在中央核。在這些動(dòng)物的脛骨前肌中注射O. 5 μ g和10 μ g與用DMSO處理的HSAik動(dòng)物相比顯著降低具有中央核的細(xì)胞的百分比，而其在FVB小鼠中不產(chǎn)生任何變化(圖34)。在注射后4周這一效應(yīng)更加顯著，這指示它是一個(gè)緩慢的過(guò)程。
總之，在模型小鼠中獲得的結(jié)果驗(yàn)證了 plO在哺乳動(dòng)物中的治療潛能，打開(kāi)了尋求DMl和DM2和SCA8的治療的新的研究途徑。
實(shí)施例16.本發(fā)明的幾種肽(pl0、pll、p5、pl2和pl5)在去結(jié)構(gòu)化或打開(kāi)由不同于⑶G重復(fù)的重復(fù)諸如AAG (對(duì)照)、CGG、CCUG和CAG形成的發(fā)夾環(huán)中的比較測(cè)定
如圖29中可觀察到的，在這一實(shí)施例中，我們使用2-氨基嘌呤測(cè)定來(lái)測(cè)定plO之外的4種肽(pll、p5、pl2和pl5)，所述肽是從本發(fā)明中解釋的組合肽文庫(kù)的解卷積獲得的。 結(jié)果指示對(duì)肽(表I)獲得的活性和CUG23探針去結(jié)構(gòu)化二級(jí)結(jié)構(gòu)并變成單鏈的能力之間的相關(guān)性。所有情形下使用的濃度均是100 μ M。因此，該實(shí)驗(yàn)證明，盡管plO由于活性最強(qiáng)而是優(yōu)選的肽，表I的其余肽，特別是pll、p5、pl2和ρ15，也呈現(xiàn)顯著水平的特異性和效力。
另一方面，如圖30中所表示的，本發(fā)明的肽(特別是plO)對(duì)由不同于CUG重復(fù)的重復(fù)，諸如，例如AAG、CGG、CCUG和CAG.形成的發(fā)夾環(huán)具有不同的結(jié)合親和力。在這一實(shí)施例中，我們測(cè)試了 PlO和其結(jié)合不同于CUG重復(fù)、但是也參與其中已描述了具有長(zhǎng)重復(fù)的 RNA的毒性的疾病的重復(fù)的能力。使用了色氨酸消光測(cè)定，一方面使用plO+AAG、CGG、CCUG 和CAG(AAG用作對(duì)照，因?yàn)槠洳恍纬啥?jí)結(jié)構(gòu))，并且，另一方面，相同的實(shí)驗(yàn)使用丙氨酸掃描后獲得的無(wú)活性肽之一(PPyawa)。結(jié)果指示plO呈現(xiàn)與對(duì)DMPK-CUG4 (在其結(jié)合p 10中是高度特異的)先前觀察到的水平相似的結(jié)合其他類型重復(fù)序列的水平(圖26)。這一結(jié)合在分別參與FXTAS和DM2疾病的CGG和CCUG重復(fù)的存在下更大。使用了三個(gè)測(cè)定點(diǎn)(3 種不同的探針濃度)，每個(gè)兩次測(cè)量。將結(jié)果對(duì)PlO單獨(dú)提供的信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。與丙氨酸掃描肽之一(ppyawa)(無(wú)活性)相比，plO的結(jié)果顯示對(duì)不同RNA重復(fù)存在的完全不同的響應(yīng)。 PlO在幾乎所有類型重復(fù)存在下顯示的強(qiáng)度的降低在使用肽ppyawa時(shí)顯著地改變了方向 (強(qiáng)度增加)。強(qiáng)度的這一增加而不是降低，也指示探針的結(jié)合類型，這表明PlO的效力與和不同類型的重復(fù)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)的相互作用密切相關(guān)。顯示了一個(gè)測(cè)定點(diǎn)(ΙΟμΜ的探針)。結(jié)果顯示為非標(biāo)準(zhǔn)化的以能夠包括測(cè)試的肽的初始值。
參考書目
· Garcia-Lopezj A.，Monferrerj L，Garcia-Alcoverj I.，Vicente-Crespoj Μ.，A Ivarez-Abrilj M. C. , Mrteroj R. D. (2008). Genetic andchemical modifiers of a CUG toxicity model in Drosophila. PLoS One, 3, el595.
· Mankodij A.，Logigianj E.，Callahan, L，McClain, C.，White, R.，Henderson, D.， et al. (2000). Myotonic dystrophy in transgenic miceexpressing an expanded CUG repeat. Science, 289，1769-177權(quán)利要求
1.包含具有式I的六肽的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或立體異構(gòu)體 A-B-C-D-E-F (I) 其中 A可以是氨基酸c或P中的任一個(gè)， B可以是氨基酸P或q中的任一個(gè)， C是氨基酸y， D可以是氨基酸a或t中的任一個(gè)， E可以是氨基酸q或w中的任一個(gè)，和 F是氨基酸e。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化合物，選自下組SEQID NO: I至SEQ IDNO: 190
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的化合物，所述化合物由具有序列SEQIDN0:10的六肽組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的化合物，所述化合物由選自以下的六肽組成SEQIDNO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12 和 SEQ ID NO:15。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4所述的化合物，特征在于形成式I的部分的氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的化合物，所述化合物包含處于直接或逆-反構(gòu)型的具有式I的六肽。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的化合物，用作藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6中的任一項(xiàng)所述的化合物，所述化合物用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG, CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病，所述疾病包括在由以下形成的組中DMI、SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。
9.至少一種根據(jù)權(quán)利要求I至6的化合物用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物設(shè)計(jì)為用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG, CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病，所述疾病包括在由以下形成的組中DM1、SCA8、DM2、FXTAS, HD和FA。
10.包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求I至6的化合物的藥物組合物。
11.用于預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG,CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病的方法，所述疾病包括在由以下形成的組中DM1、SCA8、DM2、FXTAS, HD和FA，所述方法包含向患者施用治療有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求I至6的化合物、或根據(jù)權(quán)利要求10的組合物。
全文摘要
治療基于毒性轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的疾病中使用的化合物。本發(fā)明涉及為了預(yù)防和/或治療病因?qū)W是基于包含CUG、CCUG、CGG、CAG和AAG重復(fù)的毒性轉(zhuǎn)錄物的存在的疾病而設(shè)計(jì)的肽分子，具體地六肽，所述疾病優(yōu)選地為DM1SCA8、DM2、FXTAS、HD和FA。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102933224SQ201180026071
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者魯本達(dá)里奧·阿泰羅阿萊浦茲, 安巴羅·加西亞洛佩茲, 瑪利亞帝爾瑪·奧塞斯卡拉塔尤德, 瑪利亞貝亞特里斯·拉木西特羅伊西, 恩里克·佩雷斯帕亞, 曼紐爾·佩雷斯阿朗索 申請(qǐng)人:瓦倫西亞大學(xué), 瓦倫西亞菲利普親王研究中心社會(huì)基金會(huì), 科研理事會(huì)