專(zhuān)利名稱(chēng)：：形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞桿菌新基因產(chǎn)物以及據(jù)此改進(jìn)的生物技術(shù)生產(chǎn)方法形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞桿菌新基因產(chǎn)物以及據(jù)此改進(jìn)的生物技術(shù)生產(chǎn)方法
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：本發(fā)明涉及了5種或4種來(lái)自地衣芽胞桿菌(Sa"7/w//cAemybrm^)的新基因及其基因產(chǎn)物，以及充分相似的基因和蛋白，其能在體內(nèi)參與聚氨基酸的形成、修飾和/或降解，并可用于該目的，以及，據(jù)此改進(jìn)的使用微生物的生物技術(shù)生產(chǎn)方法，該方法的特點(diǎn)為這些基因的失活或激活。本發(fā)明屬于生物
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，具體來(lái)說(shuō)是通過(guò)對(duì)能夠形成所需適當(dāng)產(chǎn)物的微生物進(jìn)行發(fā)酵，來(lái)制備該適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。這包括了例如低分子量化合物如膳食補(bǔ)劑或藥用相關(guān)化合物的制備，或由于其多樣性而具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用的蛋白的制備。在第一種情況下，利用或修改相關(guān)微生物的代謝性質(zhì)以制備適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物；在第二種情況下，使用能夠表達(dá)所需蛋白的基因的細(xì)胞。因此在兩種情況下，大部分都涉及到遺傳修飾的生物(GMO)。微生物發(fā)酵存在廣泛的現(xiàn)有技術(shù)，特別是在工業(yè)規(guī)模上；它的范圍從通過(guò)發(fā)酵罐的技術(shù)設(shè)計(jì)對(duì)相關(guān)菌株的形成速度和營(yíng)養(yǎng)利用進(jìn)行最適化，直到從相關(guān)細(xì)胞本身和/或發(fā)酵培養(yǎng)基中分離有價(jià)值的產(chǎn)物。遺傳的和微生物的、以及過(guò)程工程和生物化學(xué)方法都可應(yīng)用于此。本發(fā)明的目的是對(duì)該工藝中所用微生物的通常性質(zhì)進(jìn)行改良，這些性質(zhì)損害了實(shí)際的發(fā)酵步驟，特別是在所用菌株的遺傳性質(zhì)的水平上。對(duì)于工業(yè)生物技術(shù)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，相關(guān)的微生物培養(yǎng)在發(fā)酵罐中，所述發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)適合于它們的代謝性質(zhì)。在培養(yǎng)過(guò)程中，它們對(duì)提供的底物進(jìn)行代謝，然后除了實(shí)際產(chǎn)物之外通常還形成大量的其它物質(zhì)，這些物質(zhì)一般來(lái)說(shuō)是不需要的，并且/或正如后文中將要解釋的那樣，可能導(dǎo)致發(fā)酵或隨后的過(guò)程中的困難。一般來(lái)說(shuō)，發(fā)酵是非常復(fù)雜的過(guò)程，其中有大量不同的參數(shù)必須被調(diào)節(jié)或監(jiān)測(cè)。因此，例如，常常涉及需氧過(guò)程，意味著在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中必須給所用的微生物供應(yīng)足夠的氧氣(控制通氣速度)。其它這樣的參數(shù)的例子是反應(yīng)器的幾何形狀、營(yíng)養(yǎng)基的組成、pH或C02生成速度的持續(xù)變化。對(duì)于經(jīng)濟(jì)學(xué)和過(guò)程管理本身而言都特別重要的參數(shù)是必需的能量輸入，例如通過(guò)攪拌系統(tǒng)確保反應(yīng)器中的內(nèi)容物盡可能完全混合。此外，除了底物的分配之外，還需要保證生物體足夠的氧氣供應(yīng)。在完成發(fā)酵之后，除了除去作為生產(chǎn)者的生物體之外，一般還必需將所需的有價(jià)值的產(chǎn)物從所謂的發(fā)酵罐料漿中純化和/或濃縮。隨后的工藝可以包括例如各種層析和/或過(guò)濾步驟。因此，除了有價(jià)值產(chǎn)物的含量之外，對(duì)整個(gè)后續(xù)工藝的成功也具有決定性的是發(fā)酵罐料漿的生物物理性質(zhì)，特別是其在發(fā)酵完成后的即時(shí)粘度。其性質(zhì)也受所選微生物代謝活性的影響，也可能有不希望的效應(yīng)發(fā)生。這包括例如在發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的粘度經(jīng)常增加。這減弱了混合，從而削弱了反應(yīng)器內(nèi)部的物質(zhì)運(yùn)輸和氧氣供應(yīng)。其它的困難大多數(shù)在隨后的過(guò)程中發(fā)生，因?yàn)樵黾拥恼扯葘?duì)于例如過(guò)濾過(guò)程的效率具有相當(dāng)大的損害。已經(jīng)知道具體來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生粘液的芽胞桿菌屬菌種基本上由聚-Y-谷氨酸(PGA)和/或-天冬氨酸組成，意味著聚氨基酸通過(guò)相關(guān)的Y肽鍵鏈接。在對(duì)枯草芽孢桿菌(&d〃M犯^7^)的科學(xué)研究中，主要有3種基因ywsC、ywtA和ywtB以及由它們衍生的基因產(chǎn)物與聚谷氨酸的產(chǎn)生有關(guān)；ywtD基因的產(chǎn)物參與了降解。通用的基因標(biāo)記符號(hào)"ywt"與通常用于同樣功能的縮寫(xiě)"cap"和"pgs"具有同樣的意義。對(duì)此將在下面解釋。M.Ashiuchi等的論文""Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofpolygamma-glutamatesynthetasecomplexofBacillussubtilis"(2001)，Eur.J.Biochem.，vo1268，p5321-5328，描述了來(lái)自枯草芽孢桿菌的PgsBCA(聚-Y-谷氨酸合成酶復(fù)合物BCA)酶復(fù)合物，其由3種亞基PgsB、PgsC和PgsA構(gòu)成。根據(jù)該論文，該復(fù)合物是一種非典型的酰胺連接酶，可以將谷氨酸的D和L對(duì)映體二者都轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的聚合物。根據(jù)該論文，其中描述的基因破壞實(shí)驗(yàn)將作為證據(jù)，表明在枯草芽孢桿菌中，該復(fù)合物是唯一一個(gè)催化該反應(yīng)的酶復(fù)合物。Y.Umshibata等在論文"CharacterizationoftheBacillussubtilisywsCgene,involvedingamma-polyglutamicacidproduction"(2002),J.Bacteriol.，vol.184，337-343p中證實(shí)，其中通過(guò)ywsC、ywtA禾口ywtB三種基因的缺失突變，枯草芽孢桿菌中負(fù)責(zé)PGA生成的三種基因產(chǎn)物由這三種基因編碼。它們?cè)谠撐⑸镏幸赃@個(gè)順序與隨后的基因ywtC—起形成了相連的操縱子。T.Suzuki禾口Y.Tahara論文"CharacterizationoftheBacillussubtilisywtDgene，whoseproductisinvolvedingamma-polyglutamicaciddegradation"(2003)，J.Bacteriol.,vo1185,p2379-2382中，揭示了一個(gè)事實(shí)，即與PGA代謝相關(guān)的另一種基因位于枯草芽孢桿菌基因組ywtC自身操縱子中ywtC基因的下游。該基因編碼能夠水解PGA的DL-肽鏈內(nèi)切酶，因此可以被稱(chēng)為Y-DL-谷氨酰水解酶。此夕卜，M.Ashiuchi禾卩H.Misono的文章"Biochemistryandmoleculargeneticsofpoly-gamma-glutamatesynthesis",Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,vol59，p9-14，還提供了關(guān)于這些酶的最近的調(diào)查情況。與pgsB、pgsC和pgsA同源并在炭疽芽胞桿菌中編碼PGA合成酶復(fù)合物的基因在此被稱(chēng)為capB、capC和capA。按照該文章，位于下游的基因在炭疽芽胞桿菌中被稱(chēng)為dep(指"D-PGA分解酶")，在枯草芽孢桿菌中被稱(chēng)為pgdS(指"PGA分解酶)。在本
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的目前狀態(tài)中，這些酶的活性已經(jīng)被積極使用，主要用于制備聚-Y-谷氨酸作為原料用于例如化妝品中，盡管到目前為止它們的準(zhǔn)確DNA序列和氨基酸序列還未知，一特別是對(duì)于地衣芽胞桿菌而言。因此，例如，專(zhuān)利申請(qǐng)JP08308590A公開(kāi)了通過(guò)對(duì)PGA產(chǎn)生菌本身、即芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌、進(jìn)行發(fā)酵制備PGA;其中也描述了從培養(yǎng)基中分離該原料。根據(jù)專(zhuān)利申請(qǐng)WO02/055671Al，枯草芽孢桿菌chunkookjang變禾中(B.subtilisvar.chunkookjang)代表了特別適合用于此目的的微生物。因此，在某些發(fā)酵中對(duì)于GLA作為發(fā)酵產(chǎn)生的有價(jià)值產(chǎn)物是有興趣的。但是，在所有其它發(fā)酵中，興趣在于制備其它有價(jià)值的產(chǎn)品；就此而論，聚氨基酸的形成，由于上述的原因，意味著是副反應(yīng)?？刂朴纱诵纬啥鸬陌l(fā)酵培養(yǎng)基粘度增加的典型方法是增加攪拌速度。但是，這對(duì)能量輸入有影響。此外，被發(fā)酵的微生物因此被暴露在增加的剪切力中，這種力對(duì)它們而言代表了相當(dāng)大的應(yīng)力效應(yīng)。最后，即便如此，非常高的粘度也不能克服，因此必需提前終止發(fā)酵，即便不然的話(huà)，生產(chǎn)還可以繼續(xù)。作為大量發(fā)酵過(guò)程的副反應(yīng)，粘液的形成因此可能由于多種原因而對(duì)發(fā)酵的總體結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。就不管營(yíng)養(yǎng)基粘度的增加、而仍能持續(xù)發(fā)酵過(guò)程而言，常規(guī)的方法僅可能被表明是不夠的，特別是因?yàn)樗鼈儾淮硪蚬P(guān)系的控制。因此，更迫切的問(wèn)題是在微生物的發(fā)酵過(guò)程中，盡可能抑制不需要的粘液形成，特別是由聚-Y-氨基酸例如聚-Y谷氨酸產(chǎn)生的粘液。特別希望能夠發(fā)現(xiàn)代表因果關(guān)系的控制的解決方法。該問(wèn)題的另一個(gè)方面是提供相關(guān)的基因，用于GLA合成的基因產(chǎn)物的正性利用，并用于其降解和/或修飾。下面參與聚氨基酸的形成或降解的每一個(gè)蛋白，都代表了每種情況下對(duì)于該問(wèn)題在原則上具有同等價(jià)值的部分解決方法-YwsC(CapB，PgsB)，由核苷酸序列ywsC編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO.l中顯示的核苷酸序列有至少80%的同一性；-YwsC'(YwsC的截短變體)，由核苷酸序列ywsC'編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0.3中顯示的核苷酸序列有至少83%的同一性；-YwtA(CapC，PgsC)，由核苷酸序列ywtA編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0.5中顯示的核苷酸序列有至少82%的同一性；-YwtB(CapA,PgdA)，由核苷酸序列ywtB編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0.7中顯示的核苷酸序列有至少72。/。的同一性；以及-YwtD(Dep,PgdS)，由核苷酸序列ywtD編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO.9中顯示的核苷酸序列有至少67%的同一性。從諸如Urushibata等的上述論文中顯然可見(jiàn)，參與GLA形成的4種或3種基因在枯草芽孢桿菌中順續(xù)出現(xiàn)在同一個(gè)操縱子上。ywtD直接位于其下游。這些組分在體內(nèi)以復(fù)合物的形式一起發(fā)揮作用，下游組分作用于由此形成的聚氨基酸，預(yù)計(jì)所述的這種組織方式也將會(huì)在許多其它微生物中被發(fā)現(xiàn)，特別是芽孢桿菌屬中。因此，除了共同的生物化學(xué)功能之外，在遺傳水平上也存在產(chǎn)生本發(fā)明的統(tǒng)一性的特點(diǎn)。其它的部分解決方法由相關(guān)的核酸ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB和ywtD所代表，以及在此基礎(chǔ)上，使用相關(guān)的核酸在微生物發(fā)酵過(guò)程中減少聚氨基酸引起的粘液形成，并用作相應(yīng)的微生物發(fā)酵的方法。按照本發(fā)明，在遺傳水平上減少粘液的形成中，ywsC、ywsC、ywtA或ywtB中至少一種基因被功能上失活，和/或ywtD的活性提高。此外，可以正性使用這些基因或衍生的基因產(chǎn)物用于聚Y谷氨酸的制備、修飾或降解。本發(fā)明原則上可用于所有可發(fā)酵的微生物，特別是芽孢桿菌屬的微生物，使得這些微生物被用于發(fā)酵生產(chǎn)聚氨基酸之外的有價(jià)值產(chǎn)品，特別是藥物相關(guān)的低分子量化合物或蛋白，在遺傳水平上防止了聚氨基酸、特別是GLA的形成，或者將其立即再次降解。另一方面，這對(duì)培養(yǎng)基的粘度、另外對(duì)混合能力、氧氣輸入和能量消耗都有有利的影響，并且另一方面所需產(chǎn)品的后續(xù)加工也得到了相當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)。此外，大多數(shù)使用的原料，例如N源，不被轉(zhuǎn)化成不需要的產(chǎn)物，所以可以預(yù)期得到較高的總發(fā)酵產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述基因現(xiàn)在可用于GLA合成基因產(chǎn)物的正性使用，或用于其降解和/或修飾，特別是使用衍生的蛋白YwsC、YwsC'、YwtA、YwtB和/或YwtD，它們通過(guò)生物技術(shù)方法產(chǎn)生，并被導(dǎo)入產(chǎn)生它們的細(xì)胞中，或在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物中獨(dú)立地作為催化劑。第一種部分解決方案展示了蛋白YwsC(CapB,PgsB)，它參與聚氨基酸的形成，并由核苷酸序列ywsC編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO.l顯示的核苷酸序列具有至少80%的同一性。該特異性酶通過(guò)分析地衣芽孢桿菌DSM13的基因組獲得(參見(jiàn)實(shí)施例l)。該蛋白可以通過(guò)本申請(qǐng)SEQIDNO.l和2中的核苷酸和氨基酸序列復(fù)制(參見(jiàn)實(shí)施例l)。與介紹中提到的文獻(xiàn)信息相一致，這采取了聚Y谷氨酸合成酶復(fù)合物的亞基的形式。在本
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中目前已知的并且與其最相似的蛋白，被發(fā)現(xiàn)是來(lái)自枯草芽孢桿菌的同源YwsC，它已登記在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,USA)中，登記號(hào)AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性為75.4%，氨基酸水平上的同一性為86.1%(參見(jiàn)實(shí)施例2)。這些顯著的一致不僅表明了同樣的生物化學(xué)功能，而且表明在權(quán)利要求范圍內(nèi)存在大量具有同樣功能的相關(guān)蛋白，它們同樣包含在本申請(qǐng)?zhí)岢龅谋Ｗo(hù)范圍內(nèi)。下面的實(shí)施方式將指定給該第一種部分解決方法-任何相應(yīng)的蛋白YwsC，編碼它的核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.1中顯示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。這是因?yàn)閺男蛄型恍缘脑黾拥贸龅慕Y(jié)論是，功能和相互可替代性的同一性在遺傳水平上增加。-任何參與聚氨基酸形成的蛋白YwsC(CapB,PgsB)，其氨基酸序列與SEQIDNO.2中顯示的氨基酸序列有至少91%的同一性，隨著優(yōu)選性增加，至少有92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。對(duì)于本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)，"至少X%"的表示形式意味著"X。/。到100%，包括極端值X和100，以及它們之間的所有整數(shù)和非整數(shù)百分?jǐn)?shù)"。從地衣芽孢桿菌DSM13獲得的特異性蛋白在每種情況下都是最優(yōu)選的，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)中被具體描述，并且100%可復(fù)制。第二種部分解決方法展示了蛋白YwsC'(作為YwsC截?cái)嗟淖凅w)，其參與了聚氨基酸的形成，為其編碼的核苷酸序列ywsC'，與SEQIDN0.3中顯示的核苷酸序列至少有83%的同一性。這種特異性酶通過(guò)分析地衣芽孢桿菌DSM13的基因組獲得(參見(jiàn)實(shí)施例1)。該蛋白通過(guò)本申請(qǐng)中SEQIDNO.3和4中顯示的核苷酸和氨基酸序列可被重制(參見(jiàn)實(shí)施例l)。正如在實(shí)施例1中另外解釋的那樣，圖6顯示，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的YwsC序列之間的比較表明，地衣芽孢桿菌的YwsC的前16個(gè)氨基酸，對(duì)于它作為聚Y谷氨酸合成酶復(fù)合物的亞基C的功能來(lái)說(shuō)是不重要的。本發(fā)明因此也可以用該截短變體來(lái)實(shí)行。本申請(qǐng)中提到的"5種或4種基因"，意即按照本發(fā)明，ywsC和ywsC，被當(dāng)作兩種基因，衍生的蛋白被當(dāng)作兩種蛋白。另一方面，可能可以假定這兩種"基因"不是在每種情況下都出現(xiàn)在相關(guān)生物體的體內(nèi)，而是在每種情況下只出現(xiàn)其中一種，因此也可能出現(xiàn)只有一種相應(yīng)的基因產(chǎn)物YwsC或YwsC'。因此，第一和第二種部分解決方法在某種程度上代表了同樣的主題內(nèi)容的兩個(gè)方面。但是，因?yàn)榘被崴缴系牟煌?，分開(kāi)成兩種部分解決方法是有道理的。在本
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中目前已知的、與其最相似的蛋白再一次被發(fā)現(xiàn)是枯草芽孢桿菌同源體YwsC，其已登記在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登記號(hào)AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性為78.5%;氨基酸水平上的同一性為89.6%(參見(jiàn)實(shí)施例2)。根據(jù)上面的陳述，下面的實(shí)施方式被指定為第二種部分解決方法-任何相應(yīng)的蛋白YwsC'，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.3中顯示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。-任何參與聚氨基酸形成的蛋白YwsC'(YwsC的截短變體)，其氨基酸序列與SEQIDNO.4中顯示的氨基酸序列至少有94%的同一性，隨著優(yōu)選性增加，至少有95%、96%、97%、98%、99%,并優(yōu)選100%的同一性。從地衣芽孢桿菌DSM13獲得的特異性蛋白在每種情況下是最優(yōu)選的，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)中被具體描述，并且可100%復(fù)制。第三種部分解決方法展示了蛋白YwtA(CapC，PgsC)，其參與聚氨基酸的形成為其編碼的核苷酸序列ywtA，與SEQIDNO.5中顯示的核苷酸序列有至少82%的同一性。這種特異性酶通過(guò)分析地衣芽孢桿菌DSM13的基因組獲得(參見(jiàn)實(shí)施例l)。該蛋白可通過(guò)本申請(qǐng)中SEQIDNO.5和6顯示的核苷酸和氨基酸序列復(fù)制(參見(jiàn)實(shí)施例1)。與介紹中提到的文獻(xiàn)信息相一致，這采取了聚Y谷氨酸合成酶復(fù)合物另一個(gè)亞基的形式。在本
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中目前已知的、與其最相似的蛋白被發(fā)現(xiàn)是枯草芽孢桿菌的同源體YwsA，其己登記在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登記號(hào)AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性為77.8%，氨基酸水平上的同一性為89.9%(參見(jiàn)實(shí)施例2)。這些顯著的一致不僅表明了同樣的生物化學(xué)功能，而且表明在權(quán)力要求的范圍內(nèi)存在大量具有同樣功能的相關(guān)蛋白，它們同樣包含在本申請(qǐng)?zhí)岢龅谋Ｗo(hù)范圍內(nèi)。下面的實(shí)施方式被指定為該第三種部分解決方法-任何相應(yīng)的蛋白YwtA，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.5中顯示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。-任何參與聚氨基酸形成的蛋白YwtA(CapC,PgsC)，其氨基酸序列與SEQIDN0.6中顯示的氨基酸序列有至少94。/。的同一性，隨著優(yōu)選性增加，有至少95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。從地衣芽孢桿菌DSM13獲得的特異性蛋白在每種情況下都是最優(yōu)選的，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)中被具體描述，并且可100%復(fù)制。第四種部分解決方法展示了蛋白YwtB(CapA，PgsA)，其參與聚氨基酸的形成，為其編碼的核苷酸序列ywtB，與SEQIDN0.7中顯示的核苷酸序列有至少72%的同一性。這種特異性酶通過(guò)分析地衣芽孢桿菌DSM13的基因組獲得(參見(jiàn)實(shí)施例l)。該蛋白可通過(guò)本申請(qǐng)中SEQIDNO.7和8中顯示的核苷酸和氨基酸序列復(fù)制(參見(jiàn)實(shí)施例l)。與介紹中提到的文獻(xiàn)信息相一致，這采取了聚Y谷氨酸合成酶復(fù)合物第三個(gè)亞基的形式。在本
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中目前已知的、與其最相似的蛋白被發(fā)現(xiàn)是、與枯草芽孢桿菌的同源體YwsA，其已登記在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登記號(hào)AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性為67.1%，氨基酸水平上的同一性為65.8%(參見(jiàn)實(shí)施例2)。這些顯著的一致不僅表明了同樣的生物化學(xué)功能，而且表明在權(quán)利要求的的范圍內(nèi)存在大量具有同樣功能的相關(guān)蛋白，它們同樣包含在本申請(qǐng)?zhí)岢龅谋Ｗo(hù)范圍內(nèi)。下面的實(shí)施方式被指定為該第四種部分解決方法-任何相應(yīng)的蛋白YwtB，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.7顯示的核苷酸序列有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。-任何參與聚氨基酸形成的蛋白YwtB(C叩A(chǔ),PgsA)，其氨基酸序列與SEQIDNO.8顯示的氨基酸序列至有少70%的同一性，并隨著優(yōu)選性增加，有至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。從地衣芽孢桿菌DSM13獲得的特異性蛋白在每種情況下都是最優(yōu)選的，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)中被具體描述，并且100%可復(fù)制。第五種部分解決方法展示了蛋白YwtD(Dep，PgdS)，其參與聚氨基酸的降解，為其編碼的核苷酸序列ywtD，與SEQIDN0.9顯示的核苷酸序列有至少67%的同一性。這種特異性酶通過(guò)分析地衣芽孢桿菌DSM13的基因組獲得(參見(jiàn)實(shí)施例1)。該蛋白可通過(guò)本申請(qǐng)中SEQIDNO.9和IO顯示的核苷酸和氨基酸序列重制(參見(jiàn)實(shí)施例l)。與介紹中提到的文獻(xiàn)信息相一致，這采取了y-DL-谷氨酰水解酶、D-PGA分解酶或PGA分解酶的形式。在本
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中目前已知的、與其最相似的蛋白被發(fā)現(xiàn)是枯草芽孢桿菌的同源體YwtD，其已登記在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登記號(hào)AB080748,其在核酸水平上的同源同一性為62.3%，氨基酸水平上的同一性為57.3%(參見(jiàn)實(shí)施例2)。這些顯著的一致不僅表明了同樣的生物化學(xué)功能，而且表明在權(quán)利要求的范圍內(nèi)存在大量具有同樣功能的相關(guān)蛋白，它們同樣包含在本申請(qǐng)?zhí)岢龅谋Ｗo(hù)范圍內(nèi)。下面的實(shí)施方式被指定為該第五種部分解決方法-任何相應(yīng)的蛋白YwtD，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.9顯示的核苷酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。-任何參與聚氨基酸降解的蛋白YwtD(Dep,PgdS)，其氨基酸序列與SEQIDNO.IO顯示的氨基酸序列有至少62%的同一性，隨著優(yōu)選性增加，至少有65%、70°/。、75%、80%、90°/。、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。從地衣芽孢桿菌DSM13獲得的特異性蛋白在每種情況下都是最優(yōu)選的，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)中被具體描述，并且100%可復(fù)制。這些情況中每種都給出優(yōu)選，在本發(fā)明前述蛋白的每種情況下，所述蛋白參與聚氨基酸的形成或降解，并由微生物天然產(chǎn)生，該微生物優(yōu)選為細(xì)菌，特別優(yōu)選為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其中優(yōu)選芽孢桿菌屬之一，其中特別優(yōu)選為地衣芽孢桿菌種之一，其中更為特別優(yōu)選是地衣芽孢桿菌DSM13。這是因?yàn)椋鶕?jù)面臨的問(wèn)題，改善微生物的發(fā)酵是有利益的，因?yàn)檫@些具體的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的細(xì)菌是經(jīng)常使用的，特別是那些能夠分泌產(chǎn)生有價(jià)值的產(chǎn)物和蛋白的細(xì)菌例如芽孢桿菌。此外，就此有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。另外，如前所述，可能可以檢測(cè)到地衣芽孢桿菌序列表中指出的蛋白，特別是地衣芽孢桿菌DSM13。預(yù)計(jì)相關(guān)生物體的關(guān)系度增加，將涉及核苷酸和氨基酸序列的同一性程度增加，并且可交換性因此增加。按照到目前為止的陳述，下列每種情況中的相關(guān)核酸將被指定為本發(fā)明所陳述的部分解決方法的進(jìn)一步表示--核酸ywsC(capB,pgsB)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，其核苷酸序列與SEQIDNO.1顯示的核苷酸序列有至少80%的同一性；-相應(yīng)的核酸ywsC，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.1顯示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性；-核酸ywsC'(截短的ywsC變體)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，其核苷酸序列與SEQIDNO.3顯示的核苷酸序列有至少83%的同一性;-相應(yīng)的核酸ywsC'，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.3顯示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性；-核酸ywtA(capC，pgsC)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，其核苷酸序列與SEQIDN0.5顯示的核苷酸序列顯有至少82%的同一性；-相應(yīng)的核酸ywtA，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDN0.5顯示的核苷酸序列有至少85%、卯％、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100°/。的同一性；-核酸ywtB(capA，pgsA),其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，其核苷酸序列與SEQIDNO.7顯示的核苷酸序列有至少72%的同一性；-相應(yīng)的核酸ywtB，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDNO.7顯示的核苷酸序列有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性；-核酸ywtD(dep，pgdS)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的降解，其核苷酸序列與SEQIDNO.9顯示的核苷酸序列有至少67%的同一性；以及-相應(yīng)的核酸ywtD，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性增加，與SEQIDN0.9顯示的核苷酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100°/。的同一性。在此提供的核酸可被現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法用于失活或增強(qiáng)相關(guān)蛋白的活性。因此，通過(guò)例如適當(dāng)?shù)娜笔лd體(參見(jiàn)下文)，失活變得可能；活性的增強(qiáng)可以通過(guò)過(guò)量表達(dá)來(lái)進(jìn)行，這可以在表達(dá)載體(參見(jiàn)下文)的幫助下實(shí)現(xiàn)。因此，提出的問(wèn)題可以使用這些核酸，通過(guò)ywsC、ywsC'、ywtA禾卩/或ywtB的失活和/或增強(qiáng)ywtD基因的活性來(lái)解決。在每種情況下顯示的同源性范圍內(nèi)的相應(yīng)基因，可以從所需的生物體中獲得，例如在序列l(wèi)、3、5、7或9的基礎(chǔ)上制備的探針的幫助下。這些完整的基因也可以用作產(chǎn)生PCR引物的模型，通過(guò)它們可以從相應(yīng)的總DNA制備物中容易地制備相關(guān)的基因；這些基因隨后提供了前述的蛋白。在此成功率通常隨著相關(guān)菌株與被用來(lái)構(gòu)建探針或PCR引物的菌株的接近度而增加，在本情況下是地衣芽孢桿菌。這些情況中每種都給出優(yōu)選，在本發(fā)明核酸的每種情況下，所述核酸天然存在于微生物中，該微生物優(yōu)選為細(xì)菌，特別優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其中優(yōu)選芽孢桿菌屬之一，其中特別優(yōu)選地衣芽孢桿菌種之一，其中非常特別優(yōu)選地衣芽孢桿菌DSM13。這是因?yàn)椋缟纤?，利用這些基因用于這些微生物的發(fā)酵是特別有利益的。另一方面，本發(fā)明還關(guān)系到通過(guò)本文描述的基因和/或蛋白，調(diào)節(jié)聚氨基酸代謝的可能性，特別是Y-谷氨酸至少對(duì)它們的合成、修飾和/或降解進(jìn)行部分調(diào)節(jié)。其成功率一般來(lái)說(shuō)，特別是在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中，隨著相關(guān)基因與天然細(xì)胞的基因之間同一性的程度而增加。此外，有可能原則上易于從所有天然生物體中分離出基因和蛋白的可選實(shí)施方式。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式展示了編碼本發(fā)明上述蛋白的所有核酸。因此，在使用同義密碼子編碼相應(yīng)的氨基酸中存在差異，特別是在關(guān)系遙遠(yuǎn)的物種之間，由此蛋白生物合成元件也通過(guò)例如適當(dāng)裝載的tRNAs的可用數(shù)量與此相適應(yīng)。將所述基因之一轉(zhuǎn)入到相關(guān)性較低的物種中，如果該基因根據(jù)密碼子進(jìn)行了適當(dāng)?shù)淖钸m化，可以特別成功地用于例如缺失突變或相關(guān)蛋白的合成。因此，有可能在DNA水平上引入增加的百分差異，而在氨基酸水平上沒(méi)有影響。因此，這樣的核酸也代表了本發(fā)明的實(shí)施。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明前面指出的的核酸區(qū)域的載體。這是因?yàn)闉榱瞬僮髋c本發(fā)明相關(guān)的核酸，例如特別是制備本發(fā)明的蛋白產(chǎn)物，它們將適當(dāng)連接到載體中。這樣的載體和相關(guān)的工作方法在現(xiàn)有技術(shù)中有詳細(xì)的描述。有大量和各種各樣的載體可以商購(gòu)，用于克隆和表達(dá)。它們包括例如從細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒衍生的載體，或主要是合成的載體。它們也可以按照它們能將自身構(gòu)建進(jìn)入載體的細(xì)胞類(lèi)型的性質(zhì)區(qū)分，例如革蘭氏陰性菌載體、革蘭氏陽(yáng)性菌載體、酵母載體或高等真核生物載體。它們?yōu)槔绶肿由飳W(xué)和生物化學(xué)研究以及相關(guān)基因或相關(guān)蛋白的表達(dá)，形成了適當(dāng)?shù)钠瘘c(diǎn)。正如與此相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)所顯見(jiàn)，它們事實(shí)上是不可或缺的，-特別是在制備用于缺失或增強(qiáng)表達(dá)的結(jié)構(gòu)體時(shí)。其中優(yōu)選的載體是含有兩種或多種本發(fā)明上述核酸的載體。這是因?yàn)閺牧硪环矫鎭?lái)說(shuō)，相關(guān)的基因可以被同時(shí)儲(chǔ)存，或可以在同樣的啟動(dòng)子控制下表達(dá)。根據(jù)另一項(xiàng)申請(qǐng)，同時(shí)包含兩種或多種本發(fā)明基因的完整拷貝的載體，可以用于保持同時(shí)失去了多種這些基因的缺失突變體的存活(挽救)。之后的定向取出該載體導(dǎo)致這些多種基因被同時(shí)關(guān)閉。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是克隆載體。這是因?yàn)榭寺≥d體除了所需基因的儲(chǔ)存、生物學(xué)擴(kuò)增或選擇之外，還適合于其分子生物學(xué)特征。同時(shí)，它們代表了權(quán)利要求的核酸的可轉(zhuǎn)運(yùn)和可儲(chǔ)存的形式，也是與細(xì)胞無(wú)關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)的起點(diǎn)，例如PCR或體外突變方法。本發(fā)明的載體優(yōu)選為表達(dá)載體。這是因?yàn)檫@樣的表達(dá)載體是在生物學(xué)生產(chǎn)系統(tǒng)中供應(yīng)相應(yīng)的核酸并生產(chǎn)相關(guān)的蛋白的基礎(chǔ)。本發(fā)明該主題內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)施方式是由表達(dá)所必需的遺傳元件構(gòu)成的表達(dá)載體，例如原來(lái)位于該基因前方的天然啟動(dòng)子，或來(lái)自不同生物體的啟動(dòng)子。這些元件可以被安排成例如所謂的表達(dá)盒的形式。對(duì)于一個(gè)或所有調(diào)控元件來(lái)說(shuō)，另一個(gè)可選的可能性也由相應(yīng)的宿主細(xì)胞提供。特別優(yōu)選與其它性質(zhì)相關(guān)的表達(dá)載體，例如與選定的表達(dá)系統(tǒng)、特別是宿主細(xì)胞相匹配的最適拷貝數(shù)(參見(jiàn)下文)。在以復(fù)制子形式存在的載體的基礎(chǔ)上形成完整的基因產(chǎn)物的可能性，對(duì)于上述的挽救和特定基因的關(guān)閉來(lái)說(shuō)是特別重要的。相反，使用表達(dá)載體最有可能增加本發(fā)明的蛋白生成，因此增加了相關(guān)的活性。細(xì)胞在經(jīng)過(guò)遺傳修飾后，含有上面指定的本發(fā)明的核酸中的一種，從而形成了本發(fā)明的分離的主題內(nèi)容。這是因?yàn)檫@些細(xì)胞含有合成本發(fā)明的蛋白的遺傳信息。這些細(xì)胞是指已經(jīng)通過(guò)現(xiàn)有的方法提供了本發(fā)明的核酸的特定細(xì)胞、或從這樣的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。為此目的而適當(dāng)選擇的宿主細(xì)胞是可以被相對(duì)簡(jiǎn)單地培養(yǎng)和/或提供高產(chǎn)物產(chǎn)率的細(xì)胞。在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞可能不受專(zhuān)利保護(hù)的國(guó)家中，原則上必需將本發(fā)明的這些人類(lèi)胚胎干細(xì)胞從授予的保護(hù)中排除。本發(fā)明的細(xì)胞使得例如相應(yīng)基因的擴(kuò)增成為可能，也使這些基因的突變或轉(zhuǎn)錄和翻譯，并最終通過(guò)生物技術(shù)生產(chǎn)相關(guān)的蛋白成為可能。這種遺傳信息既可以作為分離的遺傳元件存在于染色體外，即在細(xì)菌的情況下意味著位于質(zhì)粒中，也可以整合在染色體中。合適的系統(tǒng)的選擇取決于一些問(wèn)題，例如基因或生物體的本質(zhì)和儲(chǔ)存時(shí)間、或者突變或選擇的本質(zhì)。除了在特定YwtD中過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞之外，這包括了特別是那些通過(guò)反式載體含有ywsC、ywsC'、ywtA和ywtB基因之一、因此可以用于相應(yīng)的缺失的細(xì)胞(參見(jiàn)下文)。這解釋了優(yōu)選實(shí)施方案，其中所述核酸在這種細(xì)胞中是載體、特別是前面描述的載體的一部分。其中細(xì)菌是優(yōu)選的宿主細(xì)胞。這是因?yàn)榧?xì)菌有繁殖時(shí)間短和對(duì)培養(yǎng)條件要求低的特點(diǎn)。因此可能建立起成本效益方法。此外，在細(xì)菌的發(fā)酵技術(shù)方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)。由于各種各樣的因素，革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可能適合于特定的生產(chǎn)，這些因素應(yīng)該個(gè)別通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，例如營(yíng)養(yǎng)源、產(chǎn)物形成率、需要的時(shí)間等。優(yōu)選的實(shí)施方案包含了革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是大腸桿菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、假單胞菌(Pseudomonas)或黃單胞菌(Xanthomonas)屬的細(xì)菌，特別是大腸桿菌K12(E.coIiK12)、大腸桿菌B(E.coliB)或植生克雷伯氏桿菌(Klebsiellaplanticola)的菌株，最特別的是大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌RV308、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大腸桿菌XL-1或植生克雷伯氏桿菌(Rf)菌株的衍生株。這是因?yàn)閷?duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌來(lái)說(shuō)，大量蛋白被分泌到周質(zhì)空間中。這對(duì)于特定的應(yīng)用來(lái)說(shuō)可能是有利的。專(zhuān)利申請(qǐng)WO01/81597Al也公開(kāi)了使用革蘭氏陰性細(xì)菌將表達(dá)的蛋白排出的方法。上面提到的優(yōu)選的革蘭氏陰性細(xì)菌通常易得，即可以商購(gòu)或通過(guò)公共菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得，并可以被最適化以用于與其它成分聯(lián)合的特定制備條件，例如同樣可以大量獲得的載體。替代而優(yōu)選性并不減少的實(shí)施方式包含了革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是芽孢桿菌、葡萄球菌或棒狀桿菌屬的細(xì)菌，更特別是緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、球形芽孢桿菌(B.globigii)或嗜堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒狀禾干菌(Corynebacteri腿glutamicum)菌株，其中非常特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌DSM13衍生株c這是因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌有基本的區(qū)別，在于能夠立即將分泌的蛋白釋放到細(xì)胞周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，如果需要的話(huà)可以從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中直接純化本發(fā)明的表達(dá)的蛋白。此外，它們與大多數(shù)工業(yè)重要的酶源生物相關(guān)或一致，并且它們本身大多數(shù)產(chǎn)生類(lèi)似的酶，因此它們具有類(lèi)似的密碼子用法，并且它們的蛋白合成元件天然就是適當(dāng)構(gòu)建的。地衣芽孢桿菌DSM13的衍生株是極為優(yōu)選的，因?yàn)橐环矫嫠鼈冊(cè)诒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
同樣被廣泛地用作生物技術(shù)生產(chǎn)菌株，另一方面本申請(qǐng)中本發(fā)明的基因和蛋白就是來(lái)自地衣芽孢桿菌DSM13，因此在這樣的菌株中實(shí)施本發(fā)明應(yīng)該最有可能成功。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式由制備一種或多種上述基因產(chǎn)物YwsC,YwsC',YwtA，YwtB和YwtD的方法構(gòu)成。這包括任何用于制備本發(fā)明上述蛋白的方法，例如化學(xué)合成方法。但是就此而言，所有上述在各個(gè)方面已經(jīng)討論過(guò)的、在本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已經(jīng)建立的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和生物技術(shù)制備方法都是優(yōu)選的。其目的主要是獲得本發(fā)明的蛋白，以便可以將它們進(jìn)行適當(dāng)?shù)膽?yīng)用，例如用于聚y谷氨酸的合成、修飾或降解。就此而論優(yōu)選的方法是使用了本發(fā)明前面指明的核酸的方法，優(yōu)選為使用了本發(fā)明前面指明的載體的方法，特別優(yōu)選的是使用了本發(fā)明前面指明的細(xì)胞的方法。這是因?yàn)樗龊怂?、特別是序列表SEQIDNO.1、3、5、7和9中標(biāo)識(shí)的核酸，使得相應(yīng)的優(yōu)選遺傳信息適用于微生物可利用的方式，即遺傳生產(chǎn)方法。更加優(yōu)選的是提供可以被宿主細(xì)胞特別成功地利用的載體，或這些細(xì)胞本身。相關(guān)的生產(chǎn)方法為熟練的工作人員所熟悉。本發(fā)明的實(shí)施方式可以以相關(guān)的核酸序列為基礎(chǔ)，并且是無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中蛋白的生物合成在體外復(fù)制。所有提到的元件也可以結(jié)合到新方法上，以制備本發(fā)明的蛋白。而且對(duì)于本發(fā)明的每種蛋白可以想象出大量可能的方法步驟的組合，以至于對(duì)于每個(gè)特定的個(gè)體情況來(lái)說(shuō)，最適的方法需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。對(duì)于使用密碼子的宿主菌株而言，核酸序列適合一種或多種密碼子時(shí)，這種類(lèi)型的發(fā)明方法更為優(yōu)選。這是因?yàn)?，根?jù)前面的陳述，將所述基因之一轉(zhuǎn)移到相關(guān)性較小的菌種中時(shí)，如果對(duì)有關(guān)的密碼子用法進(jìn)行了適當(dāng)?shù)淖钸m化，可以被特別成功地使用。本發(fā)明的另一種表示方法是使用本發(fā)明前述核酸ywsC、本發(fā)明前述核酸ywsC'、本發(fā)明前述核酸ywtA、本發(fā)明前述核酸ywtB或相應(yīng)的核酸，所述核酸編碼本發(fā)明上述蛋白之一，或者其各部分在各種情況下用于微生物內(nèi)各自相關(guān)基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB的功能失活。。在本申請(qǐng)中，功能性失活意味著任何形式的修飾或突變，通過(guò)這些修飾或突變，相關(guān)的蛋白作為參與聚氨基酸形成的酶或作為該酶亞基的功能被抑制。其所包括的實(shí)施方式形成了事實(shí)上完整但無(wú)活性的蛋白，而該蛋白失活的部分存在于細(xì)胞中，有賴(lài)于相關(guān)的基因不再翻譯或者甚至完全缺失的可能性。因此在本實(shí)施方案中這些因子或基因的具體"使用"，在于它們?cè)谙嚓P(guān)的細(xì)胞中不再以它們天然的方式精確地發(fā)揮作用。這是按照本發(fā)明的主題內(nèi)容在遺傳水平上通過(guò)關(guān)閉相關(guān)的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。失活基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB的替代實(shí)施方式是使用本發(fā)明前述核酸ywtD或相應(yīng)的核酸，所述核酸編碼本發(fā)明前述蛋白之一，用于增加微生物內(nèi)相關(guān)基因ywtD的活性。這是因?yàn)?，如介紹所述，該酶在體內(nèi)的功能是降解GLA。因此增加該活性導(dǎo)致了培養(yǎng)基中聚氨基酸濃度的降低，根據(jù)本發(fā)明，這對(duì)相關(guān)微生物的工業(yè)發(fā)酵具有積極效應(yīng)。這種活性的增加有利地發(fā)生在遺傳水平上。這樣的方法其本身是己知的。例如，可以通過(guò)將該基因轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體中來(lái)進(jìn)行這樣的載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到用于發(fā)酵的細(xì)胞中，并在某些條件下被適當(dāng)?shù)丶せ睿员愠藘?nèi)源形成的YwtD外，衍生的蛋白也可以發(fā)揮作用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，兩種用法是在微生物發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生功能性失活或活性的增加，優(yōu)選將聚氨基酸引起的粘液減少到50%、特別優(yōu)選少于20%、非常特別優(yōu)選少于5%，所有中間的整數(shù)或百分?jǐn)?shù)再一次被理解為適當(dāng)?shù)膬?yōu)選分級(jí)。為了確定這些值，將未處理的菌株和處理的菌株的細(xì)胞在其它條件相同的情況下進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)?shù)販y(cè)定相應(yīng)培養(yǎng)基的粘度。因?yàn)榫甑钠渌鼦l件相同，粘度的差別是由聚氨基酸的不同含量造成的。根據(jù)本發(fā)明，粘度的減小是需要的。通過(guò)從兩個(gè)發(fā)酵中取樣并用已知的方法測(cè)定含有聚氨基酸的粘液的量，可以獲得比較值，以百分?jǐn)?shù)表示。隨著優(yōu)選性增加，從本發(fā)明的過(guò)渡到靜止生長(zhǎng)期的樣品中測(cè)定的值少于對(duì)照發(fā)酵的相應(yīng)值的50%、40°/。、30%、20%、10%、5%，非常特別優(yōu)選少于1%。這是因?yàn)楸景l(fā)明的問(wèn)題是改進(jìn)用于生物技術(shù)生產(chǎn)的微生物發(fā)酵。因此，這值得或者、特別是當(dāng)多個(gè)基因受到影響時(shí)、通常需要在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上執(zhí)行相關(guān)的分子生物學(xué)構(gòu)建，并在適當(dāng)?shù)那闆r下，在僅僅代表中間階段的宿主細(xì)胞上執(zhí)行構(gòu)建，例如在大腸桿菌中構(gòu)建缺失載體。但是按照本發(fā)明，需要對(duì)基因ywsC，ywsC'，ywtA或ywtB進(jìn)行失活，以顯示出希望獲得的效果，特別是在發(fā)酵過(guò)程中。ywtD基因活性的增加可以通過(guò)例如可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)控制，該啟動(dòng)子舉例而言是相關(guān)的轉(zhuǎn)入基因。因此，該基因的活性可以通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中合適的時(shí)間加入誘導(dǎo)劑來(lái)有計(jì)劃地開(kāi)啟。另外，該基因也可以與對(duì)應(yīng)激信號(hào)作出反應(yīng)的啟動(dòng)子偶聯(lián)，例如氧氣含量太低，這也可以在被粘液阻塞的發(fā)酵罐中當(dāng)混合不夠時(shí)發(fā)生。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的應(yīng)用是這樣，隨著優(yōu)選性的增加，ywsC，ywsC'，ywtA和ywtB基因中的2種、3禾中或4種被失活，優(yōu)選與ywtD基因介導(dǎo)的活性增加相結(jié)合。此時(shí)可以回顧，在相關(guān)生物體體內(nèi)，可能基因ywsC和ywsC'并不同時(shí)存在，而是在每種情況下只存在其中一種。在這些情況下可能所述基因最多有3種被失活，因此在這種情況下，這代表了最優(yōu)選的實(shí)施方式。在失活的分子生物形式被選來(lái)用于失活這些基因之一的情況下，該實(shí)施方式作為防護(hù)措施是不完整的，并且細(xì)胞仍有相應(yīng)的殘留活性。這特別適用于枯草芽孢桿菌之外的宿主細(xì)胞，根據(jù)Ashiuchi等的論文(參見(jiàn)上文)，已經(jīng)證實(shí)這些基因在每種情況下只存在一個(gè)拷貝。將缺失方法與增強(qiáng)ywtD介導(dǎo)的活性的方法相結(jié)合特別有價(jià)值，從而將兩個(gè)原理上作用不同的系統(tǒng)結(jié)合在一起。在用于使一種或多種ywsC，ywsC'，ywtA和ywtB基因功能性失活的一個(gè)實(shí)施方式中，使用了編碼失活的蛋白并具有點(diǎn)突變的核酸。這種類(lèi)型的核酸可以通過(guò)已知的點(diǎn)突變方法產(chǎn)生。這樣的方法在例如相關(guān)的手冊(cè)中有描述，例如Fritsch,Sambrook禾口Maniatis。"Molecularcloning:alaboratorymanual"，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NewYork，1989。此外，現(xiàn)在有大量商品化的構(gòu)建試劑盒可以使用，例如Stratagene公司(LaJolla,USA)的QuickChange試劑盒。其原理是合成具有單個(gè)交換的寡聚核苷酸(誤配引物)，然后與單鏈形式的基因雜交；隨后的DNA聚合產(chǎn)生了相應(yīng)的點(diǎn)突變。為了達(dá)到這個(gè)目的，可能使用這些基因相應(yīng)的種屬特異性序列。由于高度的同源性，本發(fā)明中在SEQIDNO.1、3、5和7提供的序列的基礎(chǔ)上執(zhí)行該反應(yīng)是可能的和特別有利的。這些序列也可以用來(lái)為相關(guān)的種屬設(shè)計(jì)適合的誤配引物，特別是在圖6至IO和圖1至5的比對(duì)中，以鑒定出來(lái)的保守區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)。在這種應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方式中，每種情況下使用具有缺失突變或插入突變的核酸進(jìn)行功能性失活，優(yōu)選包括蛋白編碼區(qū)的邊界序列，每種情況下包含至少70-150個(gè)核酸位置。這些方法本身對(duì)于專(zhuān)業(yè)工作人員來(lái)說(shuō)也是熟知的。因此可能通過(guò)使用限制性?xún)?nèi)切酶在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體上切除相關(guān)基因的一部分，防止宿主細(xì)胞中一種或多種因子YwsC、YwsC'、YwtA和YwtB的形成，然后將載體轉(zhuǎn)入所需的宿主，在此通過(guò)那時(shí)仍有可能的同源重組將活性基因用無(wú)活性拷貝替代。在插入突變的實(shí)施方式中，可能只需要斷裂導(dǎo)入完整的基因，或另一個(gè)基因，例如選擇性標(biāo)記，而非部分基因。因此可能以已知的方式進(jìn)行突變事件的表現(xiàn)型檢查。為了保證在每種情況下在導(dǎo)入到細(xì)胞中的缺陷基因與內(nèi)源性存在于例如染色體上的完整基因拷貝之間，每種情況下所必需的這種重組事件，需要根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有知識(shí)，即每種情況下在不一致的序列部分的兩邊序列中，有至少70到150個(gè)連續(xù)的核酸位置是一致的，位于它們中間的部分并不重要。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案僅包含兩個(gè)側(cè)翼區(qū)，至少有一個(gè)具有這樣的大小。在這種應(yīng)用的替代實(shí)施方式中，使用的核酸共含有兩個(gè)核酸片段，它們?cè)诿糠N情況下包含至少70個(gè)到150個(gè)核酸位置，并且至少部分側(cè)翼，優(yōu)選整個(gè)側(cè)翼，是蛋白的編碼區(qū)。關(guān)于這一點(diǎn)，可以通過(guò)已知的方法確定側(cè)翼區(qū)從已知的序列開(kāi)始，例如在外向方向的PCR引物的幫助下，并以基因組DNA制備物為模板(錨定PCR)。這是因?yàn)槠尾⒎潜仨毷堑鞍拙幋a的，以便通過(guò)同源重組使兩個(gè)基因拷貝的交換成為可能。根據(jù)本發(fā)明，可以在SEQIDNO.1、3、5和7的基礎(chǔ)上為此設(shè)計(jì)所需的引物，也為其它品種的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其中特別是芽孢桿菌屬的菌種。作為這種實(shí)驗(yàn)方法的一種替代方式，可能要從相關(guān)菌種取得這樣的基因，其至少有部分不編碼多數(shù)這類(lèi)基因，相關(guān)菌種來(lái)自例如B.subtilisdatabaseentries、例如SubdListdatabaseoftheInstitutePasteur,Paris,France(http:〃genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含了描述的本發(fā)明的應(yīng)用之一，其中表達(dá)載體被用于所述的ywtD基因介導(dǎo)的活性增加，優(yōu)選的載體含有該基因和調(diào)控該基因的核酸片段。正如前面已經(jīng)陳述的那樣，該基因以及衍生的蛋白的活性的增加可以因此從外部人為調(diào)控，或通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中占優(yōu)勢(shì)的條件進(jìn)行自動(dòng)的調(diào)適，以達(dá)到減少聚氨基酸濃度的要求。此處的應(yīng)用對(duì)于本發(fā)明描述的編碼ywtD的核酸是特別有利的，非常特別有利的是使用SEQIDNO.9中的核酸。本發(fā)明也可以以遺傳修飾的微生物的形式執(zhí)行，對(duì)此上面的陳述可相應(yīng)應(yīng)用。它們是非常普通的微生物，其中基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的至少一種被功能性失活，或者ywtD具有增加的活性。它們優(yōu)選是這樣的微生物，其中隨著優(yōu)選性的增加，基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的2種、3種或4種被失活，并優(yōu)選伴隨著ywtD基因介導(dǎo)的活性的增加。優(yōu)選的微生物是細(xì)菌的形式。其中按照本文的描述，優(yōu)選的微生物是革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、假單胞菌或黃單胞菌屬的細(xì)菌，特別是大腸桿菌K12、大腸桿菌B或植生克雷伯氏桿菌的菌株，最特別的是大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌RV308、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大腸桿菌XL-1或植生克雷伯氏桿菌(Rf)菌株的衍生株。按照到目前為止的陳述，優(yōu)選性并不少的微生物是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是芽孢桿菌、葡萄球菌或棒狀桿菌屬的細(xì)菌，更特別是緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌或嗜堿芽孢桿菌、肉葡萄球菌或谷氨酸棒狀桿菌菌株，其中非常特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌DSM13。按照本申請(qǐng)所基于的問(wèn)題，目的主要是改進(jìn)工業(yè)發(fā)酵方法。因此，本發(fā)明尤其在相應(yīng)的本發(fā)明的發(fā)酵方法中執(zhí)行。這些方法是非常普遍的發(fā)酵本發(fā)明上述微生物的方法。按照此前的陳述，相應(yīng)優(yōu)選以此為特征的方法。這些特別包括了基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的一種或多種被功能性失活，或者ywtD的活性被增加的實(shí)施方式，特別是這兩種方法的組合。為此，特別優(yōu)選的來(lái)源是本發(fā)明上述的核酸，特別是SEQIDNO.1、3、5、7或9顯示的核酸。這也相應(yīng)應(yīng)用于所選的適合于相應(yīng)的發(fā)酵的菌種。根據(jù)前面的陳述，其中優(yōu)選性增加的是與地衣芽孢桿菌DSM13相關(guān)程度增加的菌種，因?yàn)檫@樣就增加了所述核酸應(yīng)用的成功前景。在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，優(yōu)選的是用于制備有價(jià)值的產(chǎn)物的方法，特別是用于制備低分子量化合物或蛋白的方法。這是因?yàn)檫@是工業(yè)發(fā)酵最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。在優(yōu)選的方法中低分子量化合物是天然產(chǎn)物、膳食補(bǔ)劑或藥物相關(guān)化合物。通過(guò)這種方式生產(chǎn)了例如氨基酸或維生素，它們被特別用作膳食補(bǔ)劑。藥物相關(guān)化合物可以是藥物的前體或中間體，或甚至是后來(lái)的藥物本身。在所有這些情況下，也采用了術(shù)語(yǔ)生物轉(zhuǎn)化，據(jù)此，微生物的代謝性質(zhì)被用來(lái)替換整個(gè)或至少個(gè)別步驟的復(fù)雜化學(xué)合成。同樣優(yōu)選的相應(yīng)方法是，通過(guò)這種方式生產(chǎn)的蛋白是酶，特別是a-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂酶、氧化還原酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、氧化酶和半纖維素酶中的一種。通過(guò)這樣的方法制備的工業(yè)酶被用于例如食品工業(yè)中。因此，a-淀粉酶被用于例如防止面包變味或澄清果汁。蛋白酶被用于蛋白的分解。所有這些酶已經(jīng)被描述用在去污劑或清潔劑組合物中，這原是被革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌天然制備的枯草桿菌蛋白酶所特別占據(jù)的顯著位置。它們被用于特別是紡織和皮革工業(yè)中，用于天然原材料的加工處理。對(duì)于所有這些酶來(lái)說(shuō)另一種可能性是用在生物轉(zhuǎn)化中作為化學(xué)反應(yīng)的催化劑。這些酶多數(shù)源自芽孢桿菌菌株，因此可以在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中特別成功地生產(chǎn)，特別是芽孢桿菌屬的細(xì)菌，在許多情況下也包括地衣芽孢桿菌DSM13。特別是基于這些微生物系統(tǒng)的生產(chǎn)方法可以在本發(fā)明的幫助下被改進(jìn)，因?yàn)镾EQIDNO.l、3、5、7和9特別指明的序列正是明確從該菌種中衍生出來(lái)的。最后，可以在本申請(qǐng)中使用的因子也可以被正性使用，意即在它們的天然功能的意義上，意味著與聚Y谷氨酸的定向制備、修飾或降解相關(guān)。因此形成的一個(gè)實(shí)施方式是通過(guò)微生物方法制備、修飾或降解聚Y谷氨酸，其中本發(fā)明上述的核酸ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB禾口/或ywtD之一或編碼本發(fā)明上述蛋白的相應(yīng)核酸之一被用來(lái)轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選形成本發(fā)明上述的相應(yīng)蛋白。其中優(yōu)選的方法使用的微生物來(lái)自芽孢桿菌屬，特別是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。因此正如在例如專(zhuān)利申請(qǐng)JP08308590A或WO02/055671Al中描述的那樣，通過(guò)微生物、特別是在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中生產(chǎn)GLA是可能的。本申請(qǐng)?zhí)峁┑腄NA序列可以被用于例如在適合的細(xì)胞中增加相應(yīng)的基因的活性，因此增加產(chǎn)量。作為其替代方法，制備、修飾或降解聚Y谷氨酸的無(wú)細(xì)胞方法現(xiàn)在也是可能的，其中包含了參與聚氨基酸形成的上述的本發(fā)明基因產(chǎn)物YwsC、YwsC'、YwtA、YwtB和/或YwtD，優(yōu)選使用本發(fā)明上述的相應(yīng)核酸。因此，這些因子可以在例如生物反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。這樣的酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。這種類(lèi)型的相應(yīng)方法中特別優(yōu)選的是使用2種、優(yōu)選3種、特別優(yōu)選4種不同的所述基因產(chǎn)物或核酸。正如介紹所描述，這是因?yàn)橐蜃覻wsC、YwtA和YwtB特別經(jīng)常形成緊密結(jié)合的復(fù)合物，因此必須談到共同活性。同時(shí)的或隨后的YwtD活性可以用于例如影響形成的聚氨基酸的生物物理性質(zhì)，以及例如改造以用于化妝用品中。下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例所有的分子生物學(xué)工作步驟都按照例如在Fritsch、Sambrook和Maniatis的"Molecularcloning:alaboratorymanual"(ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NewYork,1989)或類(lèi)似的相關(guān)著作中指示的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。酶、構(gòu)建試劑盒以及儀器按照相應(yīng)的制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)使用。實(shí)施例1從地衣芽孢桿菌DSM13中鑒定基因ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB和ywtD通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從地衣芽孢桿菌DSM13菌株中制備基因組DNA，任何人都可以從DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb，38124Braunschweig(http:〃www.dsmz.de)獲得該菌株，將基因組DNA機(jī)械分離，并在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳分離。為了對(duì)較小的片段進(jìn)行鳥(niǎo)槍法克隆，將大小在2至2.5kb的片段從瓊脂糖凝膠上洗脫下來(lái)，脫磷酸，并作為平末端片段連接到載體pTZ19R-Cm的SmaI限制性酶切位點(diǎn)中。該載體是從Fermentas(St.Leon-Rot)獲得的質(zhì)粒pTZ19R的衍生物，被賦予了氯霉素抗性。這樣就獲得了較小片段的基因文庫(kù)。在第二次鳥(niǎo)槍法克隆中，通過(guò)酶SauIIIaI部分消化獲得的基因組片段被連接到Stratagene公司(LaJolla，USA)的SuperCos1載體系統(tǒng)("CosmidVectorKit")中，從而產(chǎn)生了涵蓋主要是較大片段的基因文庫(kù)。從用相關(guān)基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化獲得的大腸桿菌DH5oc中分離相關(guān)的重組質(zhì)粒并進(jìn)行序列測(cè)定(D.Hannahan(1983):"StudyontransformationonEscherichiacoli";J.Mol.Microbiol.,vol巡，p557-580)。在這種情況下使用染料終止方法(染料終止劑化學(xué))，通過(guò)自動(dòng)測(cè)序儀MegaBACE1000/4000(AmershamBioscience,Piscataway,USA)禾卩ABIPrism377(AppliedBiosystems,FosterCity，USA)進(jìn)行。通過(guò)這種方法，獲得了本申請(qǐng)的序列表中指示的序列SEQIDNO.1、3、5、7和9，在這些序列的基礎(chǔ)上得到了基因ywsC、ywsC'(ywsC的截短變體)、ywtA、ywtB和ywtD。從它們推演出的氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO.2、4、6、8和10中的相應(yīng)序列中。截短變體ywsC'(或YwsC')對(duì)應(yīng)于基因或蛋白ywsC(或YwsC)，因?yàn)樵趫D6中顯示，枯草芽孢桿菌中同源蛋白的氨基酸序列的比較顯示出的多肽，在N端短了16個(gè)氨基酸，而其它部分具有相當(dāng)高的同源性，并因此具有類(lèi)似的活性?？蓮?fù)制性現(xiàn)在這些基因和基因產(chǎn)物可以通過(guò)現(xiàn)有的方法人工合成，而不需要在這些序列的基礎(chǔ)上以定向的方式復(fù)制所描述的序列。作為其另一個(gè)可選擇的方案，從芽孢桿菌菌株、特別是可從DSMZ獲得的地衣芽孢桿菌菌株DSM13通過(guò)PCR分離相關(guān)的基因是可能的，通過(guò)PCR，使用序列表中顯示的相應(yīng)的邊界序列合成引物是可能的。如果使用其它的菌株，獲得在每種情況下與其同源的基因，PCR的成功率將隨著選擇的菌株與地衣芽孢桿菌DSM13的關(guān)系的接近程度而增加，因?yàn)檫@可能與引物結(jié)合區(qū)域中序列同一性的增加是相關(guān)聯(lián)的。實(shí)施例2序列同源性在確定了實(shí)施例1中的DNA和氨基酸序列后，通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD，USA;http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)禾口SubtilistoftheInstitutePasteru,Paris,France(http:〃genolist.pasteur.fr/Subtilist/genome.cgi)中進(jìn)行搜索，可以確定到目前為止公開(kāi)的在每種情況下最相似的同源序列。被確定的DNA和氨基酸序列通過(guò)圖1到10中顯示的比對(duì)進(jìn)行相互比較；所用的計(jì)算機(jī)程序是VectorNTISuite第七版，從Informaxlnc.(Bethesda,USA)獲得。在這種情況下，使用該程序的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，意味著對(duì)于DNA序列的比較來(lái)說(shuō)K-元組大小是2，最佳對(duì)角線(xiàn)數(shù)量為4，窗口大小為4，間隙罰分是5，間隙斷開(kāi)罰分是15，間隙擴(kuò)展罰分是6.66。對(duì)于氨基酸序列的比較來(lái)說(shuō)，使用下面的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)K-元組大小是1，最佳對(duì)角線(xiàn)數(shù)量為5，窗口大小為5，間隙罰分是3，間隙斷開(kāi)罰分是IO，間隙擴(kuò)展罰分是O.l。這些序列比較的結(jié)果匯編在下面的表1中，登記號(hào)表示在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的登記號(hào)。表1:與實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白最相似的基因和蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>顯然，發(fā)現(xiàn)的基因和從其獲得的基因產(chǎn)物是新的基因和蛋白，與迄今為止公開(kāi)的現(xiàn)有技術(shù)中的基因和蛋白有顯著的不同。實(shí)施例3地衣芽孢桿菌中ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因中的一種或多種功能性失活制備缺失載體的原理這些基因中的每個(gè)可以通過(guò)例如所謂的缺失載體來(lái)進(jìn)行功能性失活。該方法被描述在例如J.Vehmaanpera等(1991)的論文"GeneticmanipulationofBacillusamyliquefaciens";J.Biotechnol"voll9，p221-240。適合于此的載體是pE194，其特征被描述在T丄Gryczan等(1982)的論文"ReplicationandincompatibilitypropertiesofplasmidpE194in5ac"/ww6"7/，，J.Bacteriol.,vol152,p722-735。該缺失載體的優(yōu)點(diǎn)是它具有溫度依賴(lài)性的復(fù)制起點(diǎn)。pE194在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中能夠在33。C下復(fù)制，所以最初在該溫度下篩選成功的轉(zhuǎn)化。然后將含有載體的細(xì)胞在42。C下培養(yǎng)。缺失載體在該溫度下不再?gòu)?fù)制，并施加選擇壓力使質(zhì)粒通過(guò)以前選擇的同源區(qū)域整合到染色體中。然后通過(guò)第二個(gè)同源區(qū)域發(fā)生的第二次同源重組，導(dǎo)致將載體與完整的基因拷貝一起從染色體上切除，從而在體內(nèi)刪除了位于染色體上的基因。第二次重組的另一種可能性是整合的逆反應(yīng)，意味著載體重組出染色體，因此染色體上的基因?qū)⑼暾Ａ簟Ｒ虼吮仨毻ㄟ^(guò)現(xiàn)有的方法對(duì)基因缺失進(jìn)行檢測(cè)，例如在用適當(dāng)?shù)拿笇?duì)染色體DNA進(jìn)行限制性消化后進(jìn)行southern雜交檢測(cè)，或在PCR技術(shù)的幫助下在被擴(kuò)增的區(qū)域的大小的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢測(cè)。因此必需選擇被刪除基因的兩個(gè)同源區(qū)域，在每種情況下每個(gè)區(qū)域包含70個(gè)堿基對(duì)，例如位于被選定基因的5'區(qū)域和3'區(qū)域。它們被克隆到載體中，方式是它們位于失活蛋白的編碼部分的兩側(cè)，或直接相連，不含中間區(qū)域。這樣就獲得了缺失載體。本文涉及的ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因的刪除本發(fā)明的缺失載體是通過(guò)對(duì)這4種或3種基因的5'和3'區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建的。序列表中顯示的序列SEQIDNO.1、3、5和7可用于設(shè)計(jì)適合的引物，它們來(lái)源于地衣芽孢桿菌，但是由于預(yù)期的同源性，應(yīng)該也適合于其它菌株，特別是芽孢桿菌屬的菌株。兩個(gè)擴(kuò)增的區(qū)域經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)闹虚g克隆，直接連接到用于這種操作的載體上，例如在適合于大腸桿菌的克隆步驟的pUC18載體上。下一步是亞克隆到被選擇用來(lái)缺失的載體pE194中，并將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌DB104中，這可以通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，參考Chang&Cohen(1979;"HighFrenquencyTransformationof5ac/〃wssw6"7z'sProtoplastsbyPlasmidDNA";ilfo/ec.Ge".Gew".(1979)，V0II68,plll-115)。所有的工作步驟必須在33。C下進(jìn)行，以確保載體的復(fù)制。接下來(lái)，經(jīng)過(guò)了中間克隆的載體通過(guò)通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化到所需的宿主菌株，在本情況下是地衣芽孢桿菌中。通過(guò)這種方法獲得并通過(guò)常規(guī)方法(通過(guò)質(zhì)粒的抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選；通過(guò)質(zhì)粒制備和插入片段的PCR檢查)被鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，然后在42。C下培養(yǎng)，通過(guò)加入紅霉素造成對(duì)質(zhì)粒存在的選擇壓力。缺失質(zhì)粒不能在該溫度下復(fù)制，只有其中的載體整合到了染色體上的細(xì)胞能夠存活，這種整合最可能發(fā)生在同源的或一致的區(qū)域中。然后可以通過(guò)在無(wú)紅霉素選擇壓力下于33°C培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)缺失載體的切除，染色體編碼的基因被完全從染色體上刪除。刪除的成功度檢查是用適當(dāng)?shù)拿笇?duì)染色體DNA進(jìn)行限制性消化后進(jìn)行southern雜交、或通過(guò)PCR技術(shù)的幫助。這種相關(guān)基因被刪除的轉(zhuǎn)化子也可以通過(guò)形成GLA的能力的受限甚或完全失去來(lái)鑒別。附圖描述圖1:地衣芽孢桿菌DSM13的ywsC基因(SEQIDNO.1)(B丄ywsC)與枯草芽孢桿菌的同源基因ywsC(B.s.ywsC)的比對(duì)。圖2:地衣芽孢桿菌DSM13的ywsC，基因(SEQIDNO.3)(B丄ywsC')與枯草芽孢桿菌的同源基因ywsC(B.s.ywsC)的比對(duì)。圖3:地衣芽孢桿菌DSM13的ywtA基因(SEQIDNO.5)(B丄ywtA)與枯草芽孢桿菌的同源基因ywtA(B.s.ywtA)的比對(duì)。圖4:地衣芽孢桿菌DSM13的ywtB基因(SEQIDNO.7)(B丄ywtB)與枯草芽孢桿菌的同源基因ywtB(B.s.ywtB)的比對(duì)。圖5:地衣芽孢桿菌DSM13的ywtD基因(SEQIDNO.9)(B丄ywtD)與枯草芽孢桿菌的同源基因ywtD(B.s.ywtD)的比對(duì)。圖6:地衣芽孢桿菌DSM13的YwsC蛋白(SEQIDNO.2)(B丄YwsC)與枯草芽孢桿菌的同源蛋白YwsC(B.s.YwsC)的比對(duì)。圖7:地衣芽孢桿菌DSM13的YwsC'蛋白(SEQIDNO.4)(B丄YwsC')與枯草芽孢桿菌的同源蛋白YwsC(B.s.YwsC)的比對(duì)。圖8:地衣芽孢桿菌DSM13的YwtA蛋白(SEQIDNO.6)(B丄YwtA)與枯草芽孢桿菌的同源蛋白YwtA(B.s.YwtA)的比對(duì)。圖9:地衣芽孢桿菌DSM13的YwtB蛋白(SEQIDNO.8)(B丄YwtB)與枯草芽孢桿菌的同源蛋白YwtB(B.s.YwtB)的比對(duì)。圖10:地衣芽孢桿菌DSM13的YwtD蛋白(SEQIDNO.10)(B丄YwtD)與枯草芽孢桿菌的同源蛋白YwtD(B.s.YwtD)的比對(duì)。權(quán)利要求1.一種蛋白YwsC(CapB，PgsB)，其參與聚氨基酸的形成，并且為其編碼的核苷酸序列ywsC與SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列顯示出至少80％的同一性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白YwsC，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。3.—種蛋白YwsC(CapB，PgsB)，其參與聚氨基酸的形成，其氨基酸序列與SEQIDNO.2中表示的氨基酸序列顯示出至少91%的同一性，隨著優(yōu)選性的增加，顯示出至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。4.一種蛋白YwsC，(YwsC的截短變體)，其參與聚氨基酸的形成，并且為其編碼的核苷酸序列ywsC'與SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列顯示出至少83%的同一性。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白YwsC'，為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92°/。、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。6.—種蛋白YwsC'(YwsC的截短變體)，其參與聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列與SEQIDNO.4中表示的氨基酸序列顯示出至少94%的同一性，隨著優(yōu)選性的增加，顯示出至少95%、96。/。、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。7.—種蛋白YwtA(CapC,PgsC)，其參與聚氨基酸的形成，并且為其編碼的核苷酸序列ywtA與SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列顯示出至少82%的同一性。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蛋白YwtA，其中為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。9.一種蛋白YwtA(CapC，PgsC)，其參與聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列與SEQIDNO.6中表示的氨基酸序列顯示出至少94%的同—性，隨著優(yōu)選性的增加，顯示出至少95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。10.—種蛋白YwtB(CapA，PgsA)，其參與聚氨基酸的形成，并且為其編碼的核苷酸序列yWtB與SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列顯示出至少72%的同一性。11，根據(jù)權(quán)利要求IO所述的蛋白YwtB，其中為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列顯示出至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。12.—種蛋白YwtB(CapA,PgsA)，其參與聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列與SEQIDNO.8中表示的氨基酸序列顯示出至少70%的同一性，隨著優(yōu)選性的增加，顯示出至少75%、80%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。13.—種蛋白YwtD(Dep，PgdS)，其參與聚氨基酸的降解，并且為其編碼的核苷酸序列ywtD與SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列顯示出至少67%的同一性。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的蛋白YwtD，其中為其編碼的核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDN0.9中表示的核苷酸序列顯示出至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。15.—種蛋白YwtD(Dep，PgdS),其參與聚氨基酸的降解，并且其氨基酸序列與SEQIDNO.10中表示的氨基酸序列顯示出至少62%的同一性，隨著優(yōu)選性的增加，顯示出至少65%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。16.根據(jù)權(quán)利要求1至3、4至6、7至9、10至12、或13至15中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的參與聚氨基酸形成或降解的蛋白，其由微生物天然產(chǎn)生，該微生物優(yōu)選為細(xì)菌，特別優(yōu)選為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，并且其中優(yōu)選為芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌(B.Ucheniformis)，以及其中非常特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌DSM13。17.—種核酸ywsC(capB，pgsB)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列與SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列顯示出至少80%的同一性。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸ywsC，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。19.一種核酸ywsC，(ywsC的截短變體)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列與SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列顯示出至少83%的同一性。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸ywsC'，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92%、94%、96°/。、97°/。、98°/。、99%，并特別優(yōu)選100%的同一性。21.—種核酸ywtA(capC,pgsC)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列與SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列顯示出至少82%的同一性。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸ywtA，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列顯示出至少85%、90%、92°/。、94%、96%、97%、98%、99°/。，并特別優(yōu)選100%的同一性。23.—種核酸ywtB(capA，pgsA)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列與SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列顯示出至少72%的同一性。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸ywtB，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列顯示出至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%,并特別優(yōu)選100%的同一性。25.—種核酸ywtD(dep，pgdS)，其編碼的基因產(chǎn)物參與聚氨基酸的降解，并且其核苷酸序列與SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列顯示出至少67%的同一性。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸ywtD，其核苷酸序列隨著優(yōu)選性的增加，與SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列顯示出至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特別優(yōu)選100°/。的同一性。27.根據(jù)權(quán)利要求17和/或18、19和/或20、21禾口/或22、23和/或24、或者25和/或26中任一項(xiàng)所述的核酸，其天然存在于微生物中，該微生物優(yōu)選為細(xì)菌，特別優(yōu)選為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，并且其中優(yōu)選為芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其中特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌，以及其中非常特別優(yōu)選的是地衣芽孢桿菌DSM13。28.—種核酸，其編碼權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的蛋白。29.—種載體，其含有權(quán)利要求17至28所述的核酸之一。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體，其含有兩種或更多種權(quán)利要求17至28所述的核酸。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的克隆載體。32.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的表達(dá)載體。33.—種細(xì)胞，其在遺傳修飾后含有權(quán)利要求17至28所述的核酸之一。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述核酸是載體的一部分，特別是權(quán)利要求29至32中任一項(xiàng)所述的載體的一部分。35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的細(xì)胞，該細(xì)胞是細(xì)菌。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，該細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、假單胞菌或黃單胞菌屬的細(xì)菌之一，特別是大腸桿菌K12、大腸桿菌B或植生克雷伯氏桿菌(Klebsiellaplanticola)菌株，非常特別的是大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌RV308、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大腸桿菌XL-1或植生克雷伯氏桿菌(Rf)菌株的衍生株。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，該細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是芽孢桿菌、葡萄球菌或棒狀桿菌屬之一，非常特別是緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.myloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、球形芽孢桿菌(B.globigii)或嗜堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株，其中非常特別優(yōu)選的又是地衣芽孢桿菌DSM13的衍生株。38.—種方法，用于制備根據(jù)權(quán)利要求1至16所述的基因產(chǎn)物YwsC、YwsC，、YwtA、YwtB和YwtD中的一種或多種。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中使用權(quán)利要求17至28中任一項(xiàng)所述的核酸，優(yōu)選使用權(quán)利要求29至32中任一項(xiàng)所述的載體，特別優(yōu)選使用權(quán)利要求33至37中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的方法，其中核苷酸序列的一個(gè)、或者優(yōu)選多個(gè)密碼子被改變以適應(yīng)宿主菌株的密碼子用法。41.根據(jù)權(quán)利要求17禾n/或18所述的核酸ywsC的用途，根據(jù)權(quán)利要求19和/或20所述的核酸ywsC'的用途，根據(jù)權(quán)利要求21和/或22所述的核酸ywtA的用途，根據(jù)權(quán)利要求23和/或24所述的核酸ywtB的用途，或根據(jù)權(quán)利要求28所述的相應(yīng)核酸的用途，或每種情況下其部分核酸的用途，用于對(duì)微生物中的相關(guān)基因進(jìn)行功能性失活，這些基因在每種情況下分別為ywsC、ywsC'、ywtA和ywtB。42.根據(jù)權(quán)利要求25和/或26所述的核酸ywtD的用途，或根據(jù)權(quán)利要求28所述的的相應(yīng)核酸的用途，用于增強(qiáng)微生物中相關(guān)基因ywtD的活性。43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的用途，其中功能性失活或活性增加發(fā)生在微生物的發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)選將聚氨基酸引起的粘液減少到50%，特別優(yōu)選減少到少于20%，非常特別優(yōu)選減少到少于5%。44.根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)所述的用途，其中隨著優(yōu)選性的增加，ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因中的2種、3種或4種被失活，優(yōu)選與ywtD基因介導(dǎo)的活性的增強(qiáng)組合。45.根據(jù)權(quán)利要求41至44中任一項(xiàng)所述的用途，其中在每種情況下，編碼無(wú)活性蛋白并具有點(diǎn)突變的核酸用于功能性失活。46.根據(jù)權(quán)利要求41至45中任一項(xiàng)所述的用途，其中在每種情況下被用于功能性失活的核酸具有缺失突變或插入突變，優(yōu)選包含邊界序列，該序列在每種情況下包含蛋白編碼區(qū)域的至少70到150個(gè)核酸位置。47.根據(jù)權(quán)利要求41至46中任一項(xiàng)所述的用途，其中表達(dá)載體用于ywtD基因介導(dǎo)的活性的增強(qiáng)，優(yōu)選的表達(dá)載體包含該基因以及調(diào)控該基因的核酸片段。48.—種微生物，其中基因ywsC、ywsC，、ywtA或ywtB中的至少一種被功能性失活，或ywtD具有增強(qiáng)的活性。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的微生物，其中隨著優(yōu)選性的增加，ywsC、ywsC，、ywtA或ywtB基因中的2種、3種或4種被失活，優(yōu)選與ywtD基因介導(dǎo)的活性的增強(qiáng)組合。50.根據(jù)權(quán)利要求48或49所述的微生物，其為是細(xì)菌。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的微生物，其為革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、假單胞菌或黃單胞菌屬之一，特別是大腸桿菌K12、大腸桿菌B或植生克雷伯氏桿菌菌株，非常特別的是大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌RV308、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大腸桿菌XL-1或植生克雷伯氏桿菌(Rf)菌株的衍生株。52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的微生物，其為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是芽孢桿菌、葡萄球菌或棒狀桿菌屬之一，非常特別是緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌或嗜堿芽孢桿菌、肉葡萄球菌或谷氨酸棒狀桿菌菌株，其中非常特別優(yōu)選的又是地衣芽孢桿菌DSM13。53.—種方法，用于對(duì)權(quán)利要求48到52中任一項(xiàng)所述的微生物進(jìn)行發(fā)酵。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，該方法用于制備有價(jià)值產(chǎn)物，特別是低分子量化合物或蛋白。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中的低分子量化合物是天然產(chǎn)物、膳食補(bǔ)劑或藥物相關(guān)化合物。56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中的蛋白是酶，特別是oc-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂酶、氧化還原酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、氧化酶和半纖維素酶中的一種。57.—種制備、修飾或降解聚Y谷氨酸的微生物方法，其中根據(jù)權(quán)利要求17和/或18、19禾口/或20、21和/或22、23禾口/或24、或者25和/或26中任一項(xiàng)所述的核酸之一，或根據(jù)權(quán)利要求28所述的相應(yīng)核酸，被用于轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選形成根據(jù)權(quán)利要求1至16中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的相應(yīng)蛋白。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中使用芽孢桿菌屬的微生物，特別是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。59.—種制備、修飾或降解聚Y谷氨酸的無(wú)細(xì)胞方法，其中包含根據(jù)權(quán)利要求1至3、4至6、7至9、10至12、或者13至15中任一項(xiàng)所述的參與聚氨基酸形成的基因產(chǎn)物，優(yōu)選使用根據(jù)權(quán)利要求17至28中任一項(xiàng)所述的相應(yīng)核酸。60.根據(jù)權(quán)利要求57到59中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用了2種、優(yōu)選3種、特別優(yōu)選4種不同的所述基因產(chǎn)物和核酸。全文摘要本發(fā)明涉及5種或4種來(lái)自地衣芽胞桿菌的新基因及其基因產(chǎn)物，以及充分相似的基因和蛋白，其在體內(nèi)參與聚氨基酸的形成。所討論的基因是ywsC、ywsC’、ywtA、ywtB和ywtD或其編碼的蛋白?；騳wsC、ywsC’、ywrA和ywtB能通過(guò)微生物來(lái)改進(jìn)生物技術(shù)生產(chǎn)方法，其中它們被功能性失活；相反，基因ywtD，其編碼的肽降解聚γ谷氨酸，能通過(guò)增加表達(dá)的方式有助于生物技術(shù)生產(chǎn)方法的改進(jìn)。所述基因能確實(shí)、優(yōu)選用于導(dǎo)致聚γ谷氨酸的修飾或降解。文檔編號(hào)C12N5/10GK101384615SQ200580020969公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2005年6月11日優(yōu)先權(quán)日2004年6月26日發(fā)明者克里斯蒂娜·赫茨伯格,卡爾-海茵茨·毛雷爾,安克·亨納,斯特凡·埃弗斯,格哈德·戈特沙爾克,比吉特·法伊特,海科·利澤岡,科尼利厄斯·貝斯勒,約爾格·費(fèi)舍,阿爾明·埃倫賴(lài)希申請(qǐng)人:漢高兩合股份公司