本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的一種在雛鴨間傳播迅速和高度致死性的傳染病，主要特征為肝臟腫大，有出血斑點(diǎn)和神經(jīng)癥狀，在新疫區(qū)，本病致死率很高，可達(dá)90％以上。鴨肝炎病毒I型屬于小RNA病毒科，呈球形或類球形，直徑在20-40NM，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力強(qiáng)，在自然環(huán)境中可較長時(shí)間存活。DHV病毒II型屬于星狀病毒，DHV病毒III型屬于小RNA病毒。DVH病毒三種血清型之間無交叉保護(hù)作用。目前在我國鴨肝炎病毒I型是主要的流行血清型。

鴨瘟又名鴨病毒性腸炎，是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病可引起7日齡以上的雛鴨發(fā)病。該病的特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率極高。引起鴨瘟的病原體鴨瘟病毒(DPV)屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒屬(Herpesvirus)中的濾過性的病毒，病毒粒子呈球形，直徑為120～180nm，有囊膜，病毒核酸型為DNA。病毒在病鴨體內(nèi)分散于各種內(nèi)臟器官、血液、分泌物和排泄物中，其中以肝、肺、腦含毒量最高。本病毒對(duì)禽類和哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞沒有凝集現(xiàn)象，毒株間在毒力上有差異，但免疫原性相似。

I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒是危害養(yǎng)鴨業(yè)的兩種重要病原，引起雛鴨混合感染，導(dǎo)致大批雛鴨染病死亡，造成嚴(yán)重的損失。目前對(duì)這兩種病毒通常需要分別進(jìn)行檢測，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高。多重PCR(multiplex PCR)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，可用于同時(shí)鑒定多種微生物。授權(quán)公告號(hào)為CN104450939B的發(fā)明專利公開了一種粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速檢測方法，可同時(shí)對(duì)粉蕉枯萎病和大蕉枯萎病的病菌進(jìn)行檢測。靈敏度高、方便快捷、省時(shí)省力。因此，如果能開發(fā)出一種同時(shí)檢測I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的方法，將會(huì)大大節(jié)約人力和時(shí)間成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括如下步驟：

(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因?yàn)槟繕?biāo)片段I，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的特異性引物對(duì)I，所述特異性引物對(duì)I的序列如下：

上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3'(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3'(如SEQ ID NO.2所示)；

(2)選取鴨瘟病毒中高度保守的基因?yàn)槟繕?biāo)片段Ⅱ，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的特異性引物對(duì)Ⅱ，所述特異性引物對(duì)Ⅱ的序列如下：

上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3'(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'(如SEQ ID NO.4所示)；

(3)分別對(duì)I型鴨肝炎病毒的基因組RNA和鴨瘟病毒的基因組DNA進(jìn)行提取；

(4)將步驟(3)中得到的DNA和RNA混合作為模板，聯(lián)合使用特異性引物I和特異性引物Ⅱ進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增；

(5)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟(4)中得到的二重PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

上述方法可以同時(shí)對(duì)DNA病毒(鴨瘟病毒)和RNA病毒(I型鴨肝炎病毒)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，從一套實(shí)驗(yàn)中同時(shí)得到兩份結(jié)果，大大減少分別檢測所花費(fèi)的時(shí)間和人力成本；特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ均具有良好的特異性，能夠擴(kuò)增出高度特異的片段，并且雜質(zhì)極少，也為后續(xù)的鑒定操作提供了便利。

進(jìn)一步地，所述二重PCR的反應(yīng)體系中包括如下組分：

I型鴨肝炎病毒基因組RNA≥2.65ng/mL、鴨瘟病毒基因組DNA≥1.35ng/mL、特異性引物對(duì)I0.15～0.4μM、特異性引物對(duì)Ⅱ0.15～0.4μM、dNTP 0.4mM、M-MLV 1U/μL、RNA酶抑制劑2U/μL、DNA聚合酶0.05U/μL以及體積份數(shù)為10～30％的10×PCR反應(yīng)液。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)體系中所述特異性引物對(duì)I和所述特異性引物對(duì)Ⅱ的濃度均為0.35μM。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)體系中所述I型鴨肝炎病毒基因組RNA的濃度為2.65*10-3～2.65μg/mL，所述鴨瘟病毒基因組DNA的濃度為1.35*10-3～1.35μg/mL。

進(jìn)一步地，所述二重PCR的反應(yīng)條件如下：

45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，54～60℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均經(jīng)過優(yōu)化，使用其對(duì)I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以在同一條件下、一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)獲得兩種獲得產(chǎn)量較高、特異性好、純度高的產(chǎn)物，操作簡單、省時(shí)省力；RNA酶抑制劑可以抑制環(huán)境中存在的微量RNA酶的活性，防止模板RNA被降解，有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

進(jìn)一步地，所述目的片段I的長度為399bp，所述目的片段Ⅱ的長度為232bp。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法操作簡單、省時(shí)省力，可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR和RT-PCR，同時(shí)對(duì)DNA病毒(鴨瘟病毒)和RNA病毒(I型鴨肝炎病毒)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，從一套實(shí)驗(yàn)中同時(shí)得到兩份結(jié)果，大大減少分別檢測所花費(fèi)的時(shí)間和人力成本；根據(jù)I型鴨肝炎病毒RNA和鴨瘟病毒DNA的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ均具有良好的特異性，能夠擴(kuò)增出高度特異的片段，并且產(chǎn)物雜質(zhì)極少，適合推廣使用。

附圖說明

圖1為不同引物用量的二重PCR擴(kuò)增電泳圖；

其中：M:DL2000DNA Marker；1:0.3μL；2:0.4μL；3:0.5μL；4:0.6μL；5:0.7μL；6:0.8μL；

圖2為不同退火溫度的二重PCR擴(kuò)增電泳圖；

其中：M:DL2000DNA Marker；1:54℃；2:55℃；3:56℃；4:57℃；5:58℃；6:59℃；7:60℃；

圖3為不同模板濃度的二重PCR擴(kuò)增電泳圖；

其中：M：DL2000DNA Marker；1:2.65μg/mL DHV+1.35μg/mL DEV；2:0.265μg/mL DHV+0.135μg/mL DEV；3:26.5ng/mL DHV+13.5ng/mL DEV；4:2.65ng/mL DHV+1.35ng/mL DEV；5:0.265ng/mL DHV+0.135ng/mL DEV；6:26.5pg/mL DHV+13.5pg/mL；

圖4為不同病毒種類的二重PCR擴(kuò)增電泳圖；

其中：M：DL2000DNA Marker；1.DHV+DEV；2.DHV；3.DEV；4.AIV；5.ARV；6.AEV；7.EDSV；8.GPV；9.MDPV；10.NDV；11.DTMUV。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括如下步驟：

(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因?yàn)槟繕?biāo)片段I，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的特異性引物對(duì)I，所述特異性引物對(duì)I的序列如下：

上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3'；

下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3'；

(2)選取鴨瘟病毒中高度保守的基因?yàn)槟繕?biāo)片段Ⅱ，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的特異性引物對(duì)Ⅱ，所述特異性引物對(duì)Ⅱ的序列如下：

上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3'；

下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'；

(3)分別對(duì)I型鴨肝炎病毒的基因組RNA和鴨瘟病毒的基因組DNA進(jìn)行提?。?/p>

(4)將步驟(3)中得到的DNA和RNA混合作為模板，聯(lián)合使用特異性引物I和特異性引物Ⅱ進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增；

(5)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟(4)中得到的二重PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

實(shí)施例2

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.3μL、2×PCR緩沖液6.0μL、10mmol/L的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、200U的反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL、40U/μL的RNA酶抑制劑0.5μL，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例3

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.4μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例4

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(26.5ng/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(13.5ng/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.5μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例5

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65ng/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35ng/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.6μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例6

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例7

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.8μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例8

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例9

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例10

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例11

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例12

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例13

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例2所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

實(shí)施例14

一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括實(shí)施例3所述的各步驟，其中二重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：I型鴨肝炎病毒基因組RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鴨瘟病毒基因組DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特異性引物對(duì)I和特異性引物對(duì)Ⅱ各0.7μL、10×PCR緩沖液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制劑1U，，用ddH₂O水補(bǔ)足至20μL。

反應(yīng)條件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應(yīng)。

對(duì)照例1

對(duì)I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，采用的模板濃度為I型鴨肝炎病毒RNA0.265ng/ml、鴨瘟病毒DNA0.135ng/ml，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例14。

對(duì)照例2

對(duì)I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，采用的模板濃度為I型鴨肝炎病毒RNA26.5pg/ml、鴨瘟病毒DNA13.5pg/ml，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例14。

對(duì)照例3

以I型鴨肝炎病毒(DHV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例4

以鴨瘟病毒(DEV)的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例5

以禽流感病毒(AIV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例6

以鴨黃病毒(ARV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例7

以禽傳染性腦脊髓炎病毒(AEV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例8

以減蛋綜合征病毒(DESV)的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例9

以小鵝瘟病毒(GPV)的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例10

以番鴨細(xì)小病毒(MDPV)的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例11

以新城疫病毒(DESV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)照例12

以鴨坦布蘇病毒(DESV)的基因組RNA為模板，采用實(shí)施例14所述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

實(shí)驗(yàn)例1

二重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

(1)最適引物用量的確定

以實(shí)施例2～7為實(shí)驗(yàn)例1～6，分別按照所述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并用紫外燈掃描拍照，比較各條帶的清晰度和寬度。

如圖1所示，當(dāng)退火溫度控制在58℃時(shí)，10μmol/L的引物用量在0.3～0.8μL范圍內(nèi)均可以獲得明亮、清晰的條帶、達(dá)到較好的PCR效果，其中引物用量達(dá)到0.7μL時(shí)，兩條條帶的清晰度和亮度均達(dá)到最適效果。因此，反應(yīng)體系中引物的最適用量為0.7μL，即引物的最適濃度為0.35μM。

(2)最適退火溫度的確定

以實(shí)施例8～14為實(shí)驗(yàn)例1～7，分別按照所述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并用紫外燈掃描拍照，比較各條帶的清晰度和寬度。

如圖2所示，當(dāng)10μmol/L的引物用量控制在0.7μL、退火溫度在54～60℃時(shí)范圍內(nèi)梯度變化時(shí)，均可以獲得明亮、清晰的條帶、達(dá)到較好的PCR效果，其中引物用量退火溫度達(dá)到58℃時(shí)，兩條條帶的清晰度和亮度均達(dá)到最佳效果。因此，反應(yīng)條件中最適的退火溫度為58℃。

實(shí)驗(yàn)例2

敏感性試驗(yàn)

以實(shí)施例2～5中得到的PCR產(chǎn)物為實(shí)驗(yàn)組2～5，以對(duì)照例1～2中得到的PCR產(chǎn)物為對(duì)照組1～2，用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓120V、時(shí)間20min，比較條帶情況。

如圖3所示，經(jīng)過二重PCR后能擴(kuò)增出肉眼可見的條帶的最低濃度為2.65ng/mL和1.35ng/mL，低于該濃度則無法擴(kuò)增。因此，該二重PCR方法最低能檢測2.65ng/mL的I型鴨肝炎病毒RNA和1.35ng/mL的鴨瘟病毒DNA。

實(shí)驗(yàn)例3

特異性試驗(yàn)

以實(shí)施例12中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為實(shí)驗(yàn)例1，分別以對(duì)照例3～12中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照組1～10，用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓120V、時(shí)間20min，比較條帶情況。

如圖4所示，DHV擴(kuò)增條帶為399bp，DEV擴(kuò)增條帶為232bp，均與實(shí)施例14中的擴(kuò)增條帶大小相符；而AIV，ARV，REV，EDSV，GPV，MDPV，NDV，DTMUV病毒均未擴(kuò)增出條帶。這表明該二重PCR擴(kuò)增方法具有高度特異性。

實(shí)驗(yàn)例4

臨床試驗(yàn)

從江蘇徐州地區(qū)的鴨群中隨機(jī)抽取166份肛拭子，依照實(shí)施例20提供的檢測方法對(duì)樣品中的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒同時(shí)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，檢出I型鴨肝炎病毒2份，陽性率為1.2％；鴨瘟病毒43份，陽性率為26％；未檢測出其他常見病毒。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120> 鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcttaaggc ccggtgcccc gttct 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtagggtag ggaatagtaa agtaa 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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