一種提高牛鏈球菌S1菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)D,L?乳酸的方法與流程

文檔序號：12249350閱讀：700來源：國知局

本發(fā)明屬于應用微生物技術領域，具體涉及一種提高牛鏈球菌S1菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)D,L-乳酸的方法。整個發(fā)酵工藝包括菌株的種子培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸。

背景技術：

乳酸是世界公認的三大有機酸之一，根據(jù)其旋光性質可以分為L-乳酸、D-乳酸以及D,L-乳酸。其中，D,L-乳酸廣泛應用于香料、食品、飲料行業(yè)，也是醫(yī)藥、化工、皮革、印染等行業(yè)的重要原料。由于其廣泛的市場需求，催生了高效率D,L-乳酸生產(chǎn)研究的開展。目前D,L-乳酸生產(chǎn)工藝主要包括化學合成法及酶轉化法，雖然產(chǎn)出的D,L-乳酸效率較高，但仍然達不到100％，所以生產(chǎn)后期還需要進行工業(yè)分離提純。相較于這兩種傳統(tǒng)而又經(jīng)典的生產(chǎn)工藝，利用微生物發(fā)酵法進行D,L-乳酸生產(chǎn)將大幅度的降低其生產(chǎn)成本、簡化其工藝復雜程度，且能得到與化學合成法及酶轉化法效率相當?shù)腄,L-乳酸。另外，利用菌株發(fā)酵生產(chǎn)乳酸對發(fā)酵原料要求低、環(huán)境友好，已成為世界上主流的生產(chǎn)方法。

牛鏈球菌(Streptococcus bovis，S.bovis)是反芻動物瘤胃中的常駐細菌，能夠發(fā)酵淀粉產(chǎn)混合酸(甲酸、乙酸、乳酸等)。在反芻動物飼喂高精料后，牛鏈球菌會迅速增殖，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，導致瘤胃乳酸中毒。由于其良好的發(fā)酵淀粉特性并且能夠產(chǎn)生乳酸，對特定的牛鏈球菌菌株進行篩選并改善其發(fā)酵環(huán)境為進一步提高其產(chǎn)乳酸效率提供可能。

國外研究S.bovis菌株發(fā)酵淀粉生產(chǎn)乳酸工藝的當前仍然鮮見報道。公開報道的僅有Narita等人2004年利用S.bovis 148株發(fā)酵淀粉生產(chǎn)L-乳酸的工藝。其通過向培養(yǎng)基添加0.2％的淀粉，研究不同溫度對其產(chǎn)乳酸純度影響發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度設置在37℃時，產(chǎn)乳酸純度能夠達到95.6％。有關S.bovis利用葡萄糖產(chǎn)酸特征的國外研究則報道的較多。美國康奈爾大學的Russell教授課題組以及日本明治大學Asanuma教授課題組先后開展了S.bovis JB1菌株在不同葡萄糖濃度及pH條件下產(chǎn)酸特征變化的研究工作，發(fā)現(xiàn)酵解培養(yǎng)基中葡萄糖濃度及pH可以改變S.bovis JB1產(chǎn)乳酸在總有機酸中的比例。這為進一步提高S.bovis產(chǎn)乳酸效率提供了理論依據(jù)。

國內(nèi)有關S.bovis利用淀粉發(fā)酵產(chǎn)高純?nèi)樗岬膱蟮郎袩o。本研究室的陳連民等于2015年從山羊瘤胃中分離出了一株具有良好產(chǎn)乳酸特性的S.bovis S1菌株(專利申請號：201610473872.9)。在利用該菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)乳酸試驗中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵40小時后D,L-乳酸占總有機酸(甲酸、乙酸、乳酸)的74.24％。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過對S.bovis S1菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸工藝進行優(yōu)化，達到利用成本低廉的淀粉提高發(fā)酵產(chǎn)D,L-乳酸的目的，具體為一種提高牛鏈球菌S1菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)D,L-乳酸的方法。本發(fā)明所培養(yǎng)菌種已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學保藏中心，日期：2016年8月01日，編號：CCTCC AB 2016240，分類名：Streptococcus bovis S1

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是：

一種提高牛鏈球菌S1菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)D,L-乳酸的方法，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸。在厭氧工作站進行種子培養(yǎng)后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中直接接種種子培養(yǎng)液，在水浴控溫，發(fā)酵罐密閉且無需通入其他氣體條件下，以淀粉為發(fā)酵底物，滴加緩沖液控制發(fā)酵液pH進行發(fā)酵產(chǎn)酸，工藝全過程保持厭氧。

所述種子培養(yǎng)液是以水為溶質，向其中加入質量比為1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％葡萄糖，0.3％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐溫80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％檸檬酸銨，0.5％C₂H₃NaO₂，在將配置的種子培養(yǎng)基液高溫105到110℃滅菌除氧后密封冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.8到7.0。

所述發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)液是以水為溶質，向其中加入質量比為1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，0.1～0.9％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐溫80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％檸檬酸銨，0.5％C₂H₃NaO₂。將配置的發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基液在105到110℃高溫滅菌10分鐘除氧后密封冷卻，調(diào)節(jié)pH為5.5到6.5。

進一步，發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)液中優(yōu)選用0.3～0.9％可溶性淀粉；進一步優(yōu)選0.9％可溶性淀粉。

向發(fā)酵培養(yǎng)基中直接接種種子培養(yǎng)液具體過程為：取出凍存的細菌液，以1％的接種量接種種子培養(yǎng)液，34到37℃厭氧培養(yǎng)，待到種子培養(yǎng)液渾濁度OD值為0.4時，所述培養(yǎng)時間為3到6小時，取出種子培養(yǎng)液接種到另一種子培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，再次待到培養(yǎng)液渾濁度OD值為0.4時，所述培養(yǎng)時間為2到4小時，取出種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)液接種。

所述發(fā)酵產(chǎn)酸是將種子培養(yǎng)液以3％到5％的量接種到發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)液，發(fā)酵水浴溫度控制為36℃到38℃，無需通入特殊氣體，根據(jù)發(fā)酵液pH變化調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH穩(wěn)定維持在6.4到6.8，并設置培養(yǎng)液攪拌速度為100到200rpm，發(fā)酵36到56小時。

本發(fā)明的有益效果在于提供了一種利用S.bovis S1菌株發(fā)酵淀粉產(chǎn)生高比例D,L-乳酸的方法。從菌株的種子培養(yǎng)到發(fā)酵產(chǎn)酸全程保持厭氧，步驟簡單，操作方便，發(fā)酵過程中不需要進行特殊氣體的補充，以淀粉為唯一碳源，節(jié)約了生產(chǎn)成本并能夠獲得較高比例的D,L-乳酸(占總有機酸比例90％以上)，具有重大的經(jīng)濟效益。

具體實施方式

實施例1