本發(fā)明涉及微藻生物膜培養(yǎng)技術領域，具體而言，涉及一種微藻生物膜的培養(yǎng)方法。

背景技術：

微藻是分布廣泛的單細胞低等植物，具有光合效率高(6％～20％)，生長速度快，產量高，不依賴耕地和淡水，胞內可積累脂肪(部分菌株可達30％～70％)等優(yōu)勢。傳統(tǒng)的微藻細胞培養(yǎng)和獲取技術成本高，產量低，濃度僅為0.5～1.0g/L，藻體含水量大，使得微藻油價格昂貴。生物膜培養(yǎng)方式使微藻生物質集中，收獲方便，含水量大大降低，節(jié)約水資源，保護環(huán)境。畜禽污水條件下生物膜生長效果較好，既可以得到高產量的生物質(如污水中B.braunii-357生物膜產量比Modified Basal培養(yǎng)提高44.6％)，又能吸收氮、磷成分，降低培養(yǎng)成本，但在沒有額外通入CO₂或添加其他碳源的情況下，生物膜含油量較低，如B.braunii-357生物膜油含量僅為11.6％，而同等條件下Modified Basal培養(yǎng)的油含量為24.8％；土生綠球藻(Chlorococcum sp.)生物膜在兩種培養(yǎng)條件下的油含量分別為8.99％，10.05％。

微藻油脂肪酸分子碳鏈長度、分子結構是決定生物燃料燃點、穩(wěn)定性和流動性等理化性質的重要因素；培養(yǎng)條件對微藻油脂的組成、分子結構和理化特性都會產生影響。微藻在生長過程中分泌大量的胞外聚合物(EPS，Extracellular polymeric substances)。EPS是胞外高分子聚合物，主要成分是多糖和蛋白質，一方面有助于對微藻菌株生物膜的吸附生長；另一方面在外界環(huán)境營養(yǎng)缺乏時，可作為生物膜間接儲存的營養(yǎng)物質，以可利用的形式提供能量供微生物生長。畜禽污水中培養(yǎng)14d的Chlorococcum sp.和B.braunii-357的EPS含量分別為5.53，3.2g/m²。

目前，有關提高微藻油含量的研究多集中在生化調控和基因工程等方面，例如，處于生長不利的條件(缺氮、磷或在高光照等)下，會誘發(fā)微藻積累脂肪，但積累油脂的量還不夠高。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種微藻生物膜的培養(yǎng)方法，該方法利用胞外聚合物(EPS)刺激微藻生物膜積累油脂能力，以解決上述問題。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的胞外聚合物的制備方法，該方法對微藻正常代謝過程中產生的EPS進行回收，可對微藻及培養(yǎng)液進行更充分的利用。

為了實現本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種微藻生物膜的培養(yǎng)方法，使用微藻在生長過程中分泌的胞外聚合物刺激培養(yǎng)生物膜藻體以提高微藻的油脂積累量。

胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)是在一定環(huán)境條件下由微藻分泌于體外的一些高分子聚合物。EPS刺激培養(yǎng)的微藻生物膜可以吸收利用多糖等成分積累脂質，且具有油含量高、不飽和脂肪酸比例適中、不含有反式脂肪酸分子等優(yōu)點，油脂脂肪酸純度及品質得到改善，油脂品質符合內燃機燃料的特征，為獲得高油含量和高品質的生物柴油原料提供了新思路。

優(yōu)選的，如上所述的微藻生物膜的培養(yǎng)方法，在所述刺激培養(yǎng)生物膜藻體時，所述胞外聚合物為唯一或主要的營養(yǎng)物質來源。

本發(fā)明在培養(yǎng)生物膜藻體時，不添加其他培養(yǎng)基。由于在有機碳源培養(yǎng)時，微藻油脂合成傾向于飽和脂肪酸。EPS中有多糖及蛋白質成分，使得油脂中飽和脂肪酸含量更高，而單不飽和脂肪酸(C16:1，C18:1)、多不飽和脂肪酸(C18:2)和碳鏈較長的脂肪酸(C20以上)含量低于抑制組。

優(yōu)選的，如上所述的微藻生物膜的培養(yǎng)方法，在所述刺激培養(yǎng)生物膜藻體時，將藻體接種于胞外聚合物溶液中進行培養(yǎng)；

在所述胞外聚合物溶液中，多糖濃度為50～80mg/L，蛋白質濃度為30～60mg/L。

優(yōu)選的，如上所述的微藻生物膜的培養(yǎng)方法，接種于胞外聚合物溶液中的藻體濃度為4～10g/L。

優(yōu)選的，如上所述的微藻生物膜的培養(yǎng)方法，所述藻體為B.braunii-357。

優(yōu)選的，如上所述的微藻生物膜的培養(yǎng)方法，在所述刺激培養(yǎng)生物膜藻體時，培養(yǎng)條件為：

pH＝6～8，光照度為8000～12000lx，溫度為24～28℃，光照時間10～14h/d，培養(yǎng)周期為7～13d。

如上所述的胞外聚合物的制備方法，采用層級式平板反應器培養(yǎng)生物膜藻體，在培養(yǎng)結束后提取所述胞外聚合物。

優(yōu)選的，如上所述的胞外聚合物的制備方法，在所述培養(yǎng)生物膜藻體時，所用培養(yǎng)基為畜禽養(yǎng)殖污水；

進一步優(yōu)選的，所述畜禽養(yǎng)殖污水的總氮濃度為130～180mg/L，總磷濃度為35～75mg/L。

優(yōu)選的，如上所述的胞外聚合物的制備方法，接種于畜禽養(yǎng)殖污水中的藻體濃度為0.05～0.2g/L。

優(yōu)選的，如上所述的胞外聚合物的制備方法，在所述培養(yǎng)生物膜藻體時，培養(yǎng)條件為：

pH＝6～8，光照度為8000～8500lx，溫度為24～28℃，光照時間10～14h/d，培養(yǎng)周期為12～16d。

本發(fā)明采用胞外聚合物對微藻進行培育，有助于微藻吸附生長和生物膜的形成。為了研究EPS對微藻生物膜油脂含量及脂肪酸組成的影響，對布朗葡萄藻生物膜進行EPS刺激培養(yǎng)，同時設計營養(yǎng)抑制組作為對照。結果顯示：抑制組和EPS組的油脂含量分別提高至42.2％和51.3％，油脂的中性三酰甘油酯(TAG)占比均達93％左右，飽和脂肪酸分別占55.4％，62.6％，不飽和脂肪酸分別占38.7％，31％；不飽和脂肪酸方面，抑制組的油酸分子均為反式結構，EPS組均為順式結構。用EPS刺激生物膜藻體，所得微藻油的油脂含量、純度、日產率以及TAG比例都得以提高，油脂脂肪酸組成和品質得到改善。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例中提供的層級式平板反應器結構示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例中B.braunii-357刺激前后油含量的變化情況；

圖3為本發(fā)明實施例中抑制和EPS刺激培養(yǎng)產生的微藻油。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

實施例

1材料與方法

1.1藻種與培養(yǎng)

1.1.1藻種

布朗葡萄藻(Botryococcus braunii FACHB-357)，購自中國科學院淡水藻種庫。

1.1.2培養(yǎng)基與育種

采用Modified Basal培養(yǎng)基接種、放大培養(yǎng)，操作在無菌環(huán)境下進行，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌鍋中滅菌15min，然后調節(jié)pH至7；將藻細胞接種在含有120mL培養(yǎng)基的250mL錐形瓶內，置于雙層調速多用振蕩器上培養(yǎng)，振蕩頻率為120r/min，環(huán)境溫度維持在26±2℃，明暗比為12h:12h，光照強度為60～80μmol·m²/s。培養(yǎng)用的畜禽養(yǎng)殖污水由養(yǎng)豬場的豬糞便和養(yǎng)鴨場排放的廢水，經浸泡、溶解、過濾、離心、稀釋而得。污水的初始總氮(TN)、總磷(TP)分別為150，55mg/L。

1.2儀器與設備

722N型可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)、5B-3B(A)型(V8版)多參數水質分析儀(連華科技)、HBB908-CE珠磨式破壁機(Hamilton Beach Brands,Inc.)、TGL-16gR低溫高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)、RE52AA型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、HY-6型雙層調速振蕩器(常州市凱航儀器有限公司)、5973N/5973I型氣相色譜-質譜儀(GC-MS)(美國Agilent)、ZD-9552型脫色搖床(太倉市科教器材廠)、DF-1型恒溫磁力攪拌器(金壇市中大儀器廠)。

1.3實驗設計

1.3.1階段1：生物膜培養(yǎng)

為了便于藻細胞收獲，獲取濃縮的微藻生物質以及從藻體上提取EPS，采用層級式平板反應器培養(yǎng)生物膜(圖1)。反應器共4層，每層設有平板玻璃槽，尺寸為110cm×27.5cm，槽底部用玻璃纖維增強塑料板(Glassfiber Reinforced Plastic，GFRP，厚1mm)作為吸附材料。玻璃槽中分別加入培養(yǎng)基10L(每個玻璃槽裝有200L/h的水泵，為使泵正常工作，培養(yǎng)基體積應不少于4L，培養(yǎng)基流速約為0.152m3/s)。日光燈固定在玻璃槽上方，光照度為8000～15000lx。將處于生長對數期的懸浮B.braunii-357藻液接種于玻璃槽中培養(yǎng)，接種濃度為0.1g/L，環(huán)境溫度控制在26±2℃，pH＝7，光照度為8000～8500lx，明暗比為12h:12h，培養(yǎng)周期為14d。隔天測量生物膜干重，培養(yǎng)結束后收獲藻體、提取油脂、提取EPS，測定生物質干重、油含量和EPS成分，進入下一階段。

1.3.2階段2：刺激培養(yǎng)

為了研究EPS對微藻油脂的影響，進行分組實驗，分別編號為A和B，置于雙層調速多用振蕩器上培養(yǎng)。A組和B組分別添加蒸餾水和預先制備好的EPS溶液(表1)(多糖濃度為64.50±3.23mg/L，蛋白質濃度為45.6±2.25mg/L)各100mL于250mL三角瓶中，每個三角瓶接種B.braunii-357制成濃藻液(7.4g/L)10mL，置于雙層調速多用振蕩器上培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10d，pH＝7，光照度為10000lx，溫度為26±2℃，明暗比為12h:12h。培養(yǎng)結束后，測定生物質干重、培養(yǎng)基成分的濃度、油含量及油脂GC-MS。實驗各階段涉及到的培養(yǎng)、提取和測定均設置平行樣。

表1 B.braunii-357生物膜刺激培養(yǎng)

成分提取及測定

1.4.1污水TN，TP的測定

污水TN，TP的測定分別按照《水質總氮的測定-堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》(GB 11894-1989)、《水質總磷的測定-鉬酸銨分光光度法》(GB 11893-1989)進行。下文中涉及到的TN、TP測定均按照此標準進行。

1.4.2油脂提取

采用珠磨式破壁法和旋轉蒸發(fā)分離法提取油脂。

1.4.3油脂GC-MS分析

首先將少許微藻油除水(油樣流動性好，未進行甲酯化處理)，經0.22μm濾膜過濾，溶于2mL分析純丙酮。GC-MS分析條件：Agilent6890N-5975B氣相色譜質譜聯(lián)用儀，毛細管柱DB-5ms(型號為Agilent122-5532，0.25mm×30m×0.25μm)；在180℃下保溫1min，然后以3℃/min的升溫速率升至260℃并保溫2min；進樣口溫度為250℃，氣化室溫度為250℃，離子源溫度為250℃，載氣為氦氣，流速為1.0mL/min，分流比為1:100，進樣量為1μL；檢測時間為30min。微藻油脂中不同組分的質量分數按照面積歸一化法計算。

1.4.4EPS提取及其多糖、蛋白質濃度的測定

(1)第一階段實驗結束時，從吸附材料上收獲B.braunii-357生物膜，通過預處理、反應、離心等步驟進行EPS的提取，分3步將S-EPS(soluble EPS)，L-EPS(loosely bound EPS)，T-EPS(tightly bound EPS)提取出來。

將條形吸附材料上的生物膜刮下，用蒸餾水制成懸浮液，量取10mL藻液，加入離心管，超聲波處理10min，將藻液于4℃環(huán)境中放置20min，然后離心(3400r/min)15min，上清液經0.22μm濾膜(Q/YY8-1-88，上海市新亞凈化器件廠)過濾，即得S-EPS部分；離心管中的沉淀重制成懸浮液，加入0.06mL的37％甲酰胺溶液，4℃環(huán)境中反應60min，然后高速離心15min，上清液經0.22μm濾膜過濾，所得即為S-EPS和L-EPS部分；用9mM的NaCl溶液作為緩沖液將離心管的沉淀重制成懸浮液10mL，加NaOH溶液將pH調至11，4℃條件下震蕩反應180min，然后高速離心15min，上清液經0.22μm濾膜過濾，即得S-EPS，L-EPS和T-EPS這3部分的混合液。

(2)得到的EPS混合液呈堿性，用稀HCl將其pH調至7.0。

(3)測定總的EPS溶液成分(EPS成分中多糖和蛋白質占90％以上，只測定這兩種成分)。用蒽酮比色法測得多糖濃度為64.50±3.23mg/L；用考馬斯亮藍法測得蛋白質濃度為45.6±2.25mg/L。

分析與討論

2.1兩種培養(yǎng)策略下的油脂含量的變化

B.braunii-357刺激前后微藻油含量的變化情況見圖2。從圖2可以看出，經營養(yǎng)抑制和EPS刺激培養(yǎng)后，微藻油含量從16.54％分別增加到42.2％和51.3％。生物膜培養(yǎng)結束時(階段1：第14d)生物質產量為62.5g/m²，整個培養(yǎng)周期內油產率分別為1098mg/(m²·d)和1336mg/(m²·d)，理想情況下?lián)Q算結果為5014.2L/(hm²·a)和6095.5L/(hm²·a)，產油量明顯高于玉米、大豆等常規(guī)油料作物，也比之前研究中報道的的搖擺振蕩反應器[生物質產量為2.59g/m2，產油率為260mg/(m²·d)和光稀釋式反應器的高[產油率為260mg/(m²·d)]。

EPS組培養(yǎng)基富含多糖和蛋白質。表2顯示培養(yǎng)結束時(階段2：第10d)培養(yǎng)基中的多糖濃度由64.5±3.23mg/L降至29.8±1.49mg/L，蛋白質濃度由45.6±2.25mg/L降至0mg/L，濃度下降比例分別為54％和100％。抑制組油含量增加主要是因為饑餓環(huán)境。主要營養(yǎng)物質(N，P，Si等)的缺乏有助于多數藻類胞內油脂的積累。蒸餾水環(huán)境(N，P等缺乏)引發(fā)細胞周期停滯，使碳元素由蛋白質或碳水化合物向合成脂質方向流動，細胞代謝轉向油脂合成，TAG主要在這一階段大量合成。

表2 EPS培養(yǎng)基中多糖和蛋白質濃度變化

EPS組的油含量高于營養(yǎng)抑制組。一方面是N，P等營養(yǎng)元素的缺乏促使油脂合成，另一方面是由于培養(yǎng)基中EPS的存在。微藻具有利用有機碳源的能力，有機碳源培養(yǎng)會增加油含量。之前有研究發(fā)現，添加葡萄糖的同時減少無機氮源培養(yǎng)的Chlorella protothecoides生長很快，油含量比光合自養(yǎng)時提高3倍。許多細菌可以分解EPS物質，以滿足微生物自身代謝和生長的能量需求。Ceyhan研究了12種菌株分解自身EPS和其它菌株的EPS進行吸收代謝的能力，發(fā)現有8株可以利用Burkholderia cepacia的EPS，有7株可以吸收Pseudomonas sp.和Sphingomonas paucimobilis的EPS。還有研究認為EPS的破壞屬于酶促降解，這種稱為糖水解型酶的物質大量存在于EPS提取液或者培養(yǎng)基中。當在生物膜懸浮液中加入EPS時，微生物種群大量聚集，產生特定的具有激發(fā)效應的酶，刺激EPS分子降解。有研究認為細胞吸收EPS中多糖和蛋白質的速度不同，且EPS的降解吸收分為快速吸收利用、分泌S-EPS、重新分解吸收等階段。本發(fā)明對比抑制組和EPS組的結果，認為微藻可以吸收培養(yǎng)基中糖和蛋白成分(即EPS)積累油脂。

2.2兩種培養(yǎng)策略下的油脂成分及脂肪酸組成的變化

抑制和EPS組的B.braunii-357TAG的詳細成分對比見表3。

表3 脂肪酸、芳香類化合物、酯類衍生物及其他

注：表格中橫線代表極少量或者無.

微藻油脂成分以TAG和C14～C22的長鏈脂肪酸為主，其中，TAG是轉化生物柴油的最佳脂類。兩種刺激條件下，B.braunii-357的油脂TAG比例較高，均高達90％以上，極性油脂成分較少，EPS組油脂飽和脂肪酸高于抑制組，不飽和脂肪酸含量低于抑制組。棕櫚酸是微藻油脂中含量最多的脂肪酸之一，也是生產生物柴油的主要原料之一。之前有研究報道的藻株Chlorella vulgaris(UTEX 265)的生物膜中，棕櫚酸占30％。EPS組棕櫚酸含量(55.44±2.86％)高于抑制組(48.17±1.89％)，營養(yǎng)抑制組和EPS組的油酸分別達到32.59±2.19％，26.87±2.35％。其它物質成分則很少，抑制組的芳香類化合物、酯類衍生物及其它成分均高于EPS組，其中的甲磺酸硬脂酸酯含硫，而EPS組不含或含極少的硫化合物。EPS組的芳香族化合物也低于抑制組，從排放要求來看，能減少含硫化合物等有害物質的排放。綜上可知，EPS組油脂含量、脂肪酸純度及品質好于抑制組。

微藻異養(yǎng)生長速度快于自養(yǎng)，添加有機碳源不僅增加油含量也促進TAG比例的增加。有報道稱，以有機碳源(如葡萄糖、玉米粉水解液等)培養(yǎng)時，微藻油脂合成傾向于飽和脂肪酸，即異養(yǎng)培養(yǎng)時飽和脂肪酸比例大，當有機碳源濃度增加時，飽和脂肪酸比例增大，不飽和脂肪酸降低；與此相反，自養(yǎng)培養(yǎng)時，不飽和脂肪酸成分居多。一定含量的油酸成分能合理的平衡抗氧化性和冷濾點的矛盾關系，但油酸甲酯過高又會降低抗氧化性能，不利于儲存。在碳鏈等長時，所含不飽和鍵越多，熔點越低，增加流動性。理想的生物柴油的分子雙鍵應盡可能少，最好只有一個雙鍵。EPS組培養(yǎng)基中有多糖及蛋白質成分，使得油脂中飽和脂肪酸多于抑制組，單不飽和脂肪酸(C16:1，C18:1)、多不飽和脂肪酸(C18:2)和碳鏈較長的脂肪酸(C20以上)含量低于抑制組。

圖3是本發(fā)明兩種培養(yǎng)情況下所得油脂原樣。直觀上看，EPS組油脂黏度較低，流動性好于營養(yǎng)抑制組。

2.3對不飽和脂肪酸的順反異構的影響

不飽和脂肪酸分子的空間結構有順反異構(Cis-trans isomerism)之分，分為順式(cis-)結構和反式(trans-)結構。順反異構體在熔點、分子穩(wěn)定性都有區(qū)別，反式脂肪酸和飽和脂肪酸一樣是直鏈，所以性質也比較穩(wěn)定。表3顯示了B.braunii-357油脂中4種不飽和脂肪酸C16:1，C18:1，C18:2，C20:1的順反異構情況。從表3可以看出，抑制組的油酸分子中反式結構占100％，EPS組的不飽和脂肪酸均為順式結構；抑制組蓖麻油酸甲酯也為反式結構。不飽和脂肪酸的順反異構將會影響微藻生物燃料的理化特性。

脂肪酸分子在碳鏈等長、不飽和鍵個數相同時，反式分子溶點高于順式分子，如十八烷酸(硬脂酸，stearic acid，C18:0)熔點為69.6℃，順-9-十八烯酸(油酸，octadecenoic acid，C18:1)的熔點為16.3℃，反-9-十八烯酸(反油酸，trans-octadecenoic acid，C18:1)的熔點為43.7℃，順，順-9，12-十八二烯酸(亞油酸，linoleic acid)的熔點為-12℃^[28]。因此，順式脂肪酸具有較好的低溫流動性能。Gross在旋轉式反應器(Revolving Algal Biofilm Photobioreactor，RABP)培養(yǎng)藻株Chlorella vulgaris(UTEX 265)生物膜，所得藻油脂肪酸中的順式油酸分子遠多于反式分子；而對照的懸浮培養(yǎng)組恰恰相反，反式分子占據大多數，順式分子較少?？梢姡锬づ囵B(yǎng)的順式不飽和脂肪酸的含量高于普通懸浮培養(yǎng)，EPS刺激培養(yǎng)可進一步提高順式不飽和脂肪酸含量，增強油脂流動性。

另外，微藻油脂和植物油脂十分類似，某些藻類油脂可食用(如食用油、DHA等)，還含有蛋白質和碳水化合物等成分。在一定溫度和壓力的條件下，植物油可將順式不飽和脂肪酸轉變成室溫下更穩(wěn)定的反式脂肪酸。油脂中存在反式脂肪酸，對人體健康是有害的。

3結論

發(fā)火性、低溫流動性以及抗氧化性等是評價生物柴油作為內燃機燃料基本特性的幾個重要指標，而脂肪酸的碳鏈長度、飽和與不飽和脂肪酸比例、脂肪酸分子順反結構等因素會綜合影響微藻油脂的物理特性。結果顯示，與營養(yǎng)抑制培養(yǎng)方式相比，EPS刺激培養(yǎng)的B.braunii-357生物膜可以吸收利用多糖等成分積累脂質，且具有油含量高、不飽和脂肪酸比例適中、不含有反式脂肪酸分子等優(yōu)點，油脂脂肪酸純度及品質得到改善，油脂品質符合內燃機燃料的特征，為獲得高油含量和高品質的生物柴油原料提供了新思路。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。