專利名稱：一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種浮游微藻的培養(yǎng)方法，具體涉及一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻 混合培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
水體環(huán)境中微藻群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定不僅與微藻的生物量有關(guān)，還與其群落多樣 性指數(shù)密切相關(guān)，目前對微藻調(diào)控或?qū)τ诟∮挝⒃宓娜斯ざㄏ蚺囵B(yǎng)，多針對單種 或兩種優(yōu)良微藻開展，在復(fù)雜的水體環(huán)境中，容易導(dǎo)致某一階段個別微藻種類過 度繁殖，水體中的微藻群落多樣性指數(shù)相對偏低，不利于水環(huán)境中微藻群落的穩(wěn) 定，從而造成中前期藻相難培育、中期易突變、后期過旺盛的情況。
經(jīng)調(diào)査在對蝦養(yǎng)殖池中微綠球藻、隱藻和綠色顫藻均為優(yōu)勢微藻，其中前兩 者多被認(rèn)為是優(yōu)良微藻，可有效調(diào)控和優(yōu)化水體環(huán)境，顫藻作為藍(lán)藻則多被認(rèn)為 是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的有害微藻。其實綠色顫藻在各種水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中多為常見種，即 使在優(yōu)良的水體環(huán)境和微藻群落結(jié)構(gòu)中亦多有存在，在多種微藻共存生長情況下 存在一定數(shù)量的綠色顫藻，可維持水體中微藻種類和生態(tài)功能的平衡，但關(guān)鍵必 須將數(shù)量嚴(yán)格控制在一定的水平，以避免優(yōu)勢度水平過大，妨礙甚至抑制其他優(yōu) 良微藻的生長。
水體環(huán)境中的微生物與微藻間具有極其密切的聯(lián)系。某些細(xì)菌能夠不斷的向 細(xì)胞外分泌一些有機(jī)物質(zhì)，如胞外糖肽類物質(zhì)，有的細(xì)菌還可以分泌類維生素物 質(zhì)，促進(jìn)某些微藻生長；也有的細(xì)菌分泌能溶解藻細(xì)胞的酶物質(zhì)或其他活性物質(zhì)， 使某些種類的微藻生長受到抑制?；诩?xì)菌與藻類間所具有的特異性，可從特定 的環(huán)境中篩選有關(guān)菌種，并以之調(diào)控多種微藻的共同生長體系，使系統(tǒng)中不同種 類微藻以較優(yōu)比例和數(shù)量進(jìn)行生長。地衣芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑均具有較強(qiáng)的 產(chǎn)胞外酶活性，能促進(jìn)水環(huán)境中的物質(zhì)和能量循環(huán)，并且還能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)， 抑制病源菌的生長。由于具有無毒、無副作用、無污染、無殘留等特點，它被認(rèn)為是安全有效的有益微生物，并已廣泛應(yīng)用與農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、飼料加工等行 業(yè)。
因此，在進(jìn)行調(diào)控水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用微藻初期培養(yǎng)時，根據(jù)不同種類微藻的生態(tài) 特性、細(xì)菌與藻類間所具有的特異性關(guān)系，從菌藻協(xié)同調(diào)控的基礎(chǔ)出發(fā)，在微藻 混合培養(yǎng)系統(tǒng)中引入有益微生物，提高微藻總體數(shù)量，穩(wěn)定不同微藻數(shù)量比例， 從而為在中小型對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中引入高效穩(wěn)定的多藻種藻液，促進(jìn)和優(yōu)化生產(chǎn)初 期水環(huán)境中的微藻結(jié)構(gòu)，而目前關(guān)于此的研究正是急需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，該方法 使各微藻在混合培養(yǎng)中生長均衡，穩(wěn)定性好，避免混合培養(yǎng)體系中藻相的生物多 樣性單一，避免某種微藻的數(shù)量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢。
本發(fā)明提供的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，選取優(yōu)勢度大于0.15 的微藻置于氮濃度為12~16mg/L、磷濃度為2~6mg/L、鐵濃度為0.10 0.20mg/L 的培養(yǎng)液中進(jìn)行混合培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)過程中采用地衣芽孢桿菌進(jìn)行調(diào)控，培養(yǎng) 條件為溫度26 28。C，鹽度12 18%。， pH7.5~8.0，光照強(qiáng)度4000~5000Lx，光 暗比12h : 12h 14h : 10h。
在培養(yǎng)液中
氮源為硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀或尿素中的一種或幾種。 磷源為磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉或過磷酸鈣中的一種或幾種。 鐵源為檸檬酸鐵。
所述的微藻為微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的混合。
所述的微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的投放比例為0.7~1.3 : 0.7 1.3 : 0.7~1.3， 各微藻的初始投放密度為104~105cdlS/mL。
所述的芽孢桿菌的初始投放密度為104~105 CFU/mL。
在養(yǎng)殖水體水色為鮮綠色、豆綠色或綠褐色，養(yǎng)殖水體浮游微藻生物多樣性 指數(shù)大于1.60的養(yǎng)殖池中，篩選優(yōu)出勢度大于0.15的微藻種類進(jìn)行混合培養(yǎng)。 本發(fā)明的有益效果是-
(1)篩選出了多種優(yōu)勢微藻進(jìn)行混合培養(yǎng)，確保了微藻藻相的多樣性，并通 過地衣芽孢桿菌在培養(yǎng)系統(tǒng)中的添加，直接或間接地調(diào)控了各種微藻的數(shù)量比例，使微藻達(dá)到了均衡生長的效果；
(2) 在芽孢桿菌和各種微藻細(xì)胞增長的相關(guān)性方面采用了相關(guān)分析法，并采 用了通徑分析法評價芽孢桿菌對各種微藻的影響，通過實際驗證，得出了藻相穩(wěn) 定性培養(yǎng)的相關(guān)調(diào)控措施，保證了各種微藻生長的穩(wěn)定性；
(3) 以地衣芽孢桿菌平衡調(diào)控不同種類微藻的共生性培養(yǎng)，進(jìn)而優(yōu)化藻相調(diào) 控的技術(shù)模式，這可利用于優(yōu)化對蝦養(yǎng)殖池塘的微藻生態(tài)環(huán)境，避免養(yǎng)殖過程中 因池塘內(nèi)某個單一種類微藻過度繁殖或消亡造成的藻相生物多樣性單一，水環(huán)境 變化劇烈，養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量惡化等情況，具備實際操作性；
(4) 本發(fā)明方法可用作一種調(diào)控水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用微藻初期培養(yǎng)的方法，其作用 是從菌藻協(xié)同調(diào)控的基礎(chǔ)出發(fā)，在微藻混合培養(yǎng)系統(tǒng)中提高微藻總體數(shù)量，穩(wěn)定 不同微藻數(shù)量比例，從而為將高效培養(yǎng)的微藻引入中小型對奸養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行初 期藻相構(gòu)建與優(yōu)化提供了技術(shù)儲備。
具體實施例方式
以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實 施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范 圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。 實施例l
選擇微綠球藻(iV"朋oc/z/oro/w" ocw/ato)、隱藻(C，romonos gm ")禾口綠色賣貞 藻(0如//^0/^ cWw/"e)進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中應(yīng)用地衣芽孢桿菌CBod//^ /Zc/zem/onw'力進(jìn)行調(diào)控，使系統(tǒng)中的各種微藻按一定比例穩(wěn)定增長。
培養(yǎng)液為全人工配置無機(jī)培養(yǎng)液，陳海水煮沸冷卻后加入NaN03、 KH2P04 和檸檬酸鐵，使N、 P和Fe的濃度分別達(dá)到15mg/L、 2mg/L和0.12mg/L。 培 養(yǎng)過程中每3d測定一次氮和磷的濃度，酌情加入NaN03和KH2P04，使總氮和 磷的濃度達(dá)到初始水平。
培養(yǎng)過程中各個培養(yǎng)組的相關(guān)條件一致，以恒溫循環(huán)器水浴控溫，溫度為 26°C， pH8.2，光照強(qiáng)度5000Lx，光暗比為14h : 10h，營養(yǎng)液的鹽度為16%。。
藻相中各微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的投放比例為0.8 : 1.1 : 1.0，各微藻的 初始投放密度為8xl04Cells/mL;芽孢桿菌細(xì)胞的初始投放細(xì)胞密度為 3xl04CFU/mL;培養(yǎng)容器為1M3的白色透光玻璃鋼桶，以白色透光塑料薄膜覆蓋桶口，進(jìn)行充氣培養(yǎng)，擴(kuò)培過程按照上述調(diào)控措施對藻液培養(yǎng)進(jìn)行管理，并及 時添加相應(yīng)比例的培養(yǎng)液。
本方法實踐表明在混合培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)初期2~4d芽孢桿菌對微綠球藻有 促進(jìn)作用，但當(dāng)微綠球藻密度大于106ind/mL后芽孢桿菌則抑制微綠球藻的生長； 隱藻在整個混合培養(yǎng)過程中均可受芽孢桿菌的促生長作用，到培養(yǎng)6天以后，隱 藻細(xì)胞數(shù)較對照組提高了 55%以上；雖然芽孢桿菌針對顫藻的直接作用程度小， 但通過促進(jìn)或調(diào)控混合培養(yǎng)系統(tǒng)中微綠球藻和隱藻的增長，加速體系中營養(yǎng)的消 耗從而間接控制微藻的數(shù)量。
在培養(yǎng)14d后系統(tǒng)中添加芽孢桿菌的微藻總細(xì)胞數(shù)為10.6X106ind/mL，而 微綠球藻的細(xì)胞數(shù)為4.8X 106ind/mL較不添加芽孢桿菌的降低了 40.6%，隱藻和 綠色顫藻則分別為3.3 X 106ind/mL和2.5 X 106ind/mL,較不添加芽孢桿菌的分別 升高了 21.0%和2.5%。可見，培養(yǎng)過程通過利用地衣芽孢桿菌的添加促進(jìn)或調(diào) 控混合培養(yǎng)系統(tǒng)中各種藻的增長，或加速體系中營養(yǎng)的消耗從而間接控制微藻的 數(shù)量，有效調(diào)控各種微藻的數(shù)量比例，達(dá)到均衡生長的效果，避免某種微藻的數(shù) 量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢。 實施例2
選擇^t斂綠球藻(A^""oc/2/oro/w/s ora/ato)、 隱藻(O3^to附0wtw erara)禾口綠色顏 藻(6^"7/ator/" cA/w7'we)進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中應(yīng)用地衣芽孢桿菌C^^'〃w /^^w/om^)進(jìn)行調(diào)控，使系統(tǒng)中的各種微藻按一定比例穩(wěn)定增長。
培養(yǎng)液為全人工配置無機(jī)培養(yǎng)液，陳海水煮沸冷卻后加入NaN03、 KH2P04 和檸檬酸鐵，使N、 P和Fe的濃度分別達(dá)到16nig/L、 3mg/L和0.14mg/L。 培 養(yǎng)過程中每3 d測定一次氮和磷的濃度，酌情加入NaN03和KH2P04，使總氮和 磷的濃度達(dá)到初始水平。
培養(yǎng)過程中各個培養(yǎng)組的相關(guān)條件一致，以恒溫循環(huán)器水浴控溫，溫度為 28°C， pH7.8，光照強(qiáng)度4800Lx，光暗比為14h : 10h，營養(yǎng)液的鹽度為18%。。
藻相中各微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的投放比例為0.8 : 1.1 : 1.2，各微藻的 初始投放密度為10Vells/mL;芽孢桿菌細(xì)胞的初始投放細(xì)胞密度為104 CFU/mL。 培養(yǎng)容器為1M3的白色透光玻璃鋼桶，以白色透光塑料薄膜覆蓋桶口，進(jìn)行充 氣培養(yǎng)；擴(kuò)培過程按照上述調(diào)控措施對藻液培養(yǎng)進(jìn)行管理，并及時添加相應(yīng)比例 的培養(yǎng)液。本方法實踐表明在混合培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)初期l~4d芽孢桿菌對微綠球藻有 促進(jìn)作用，但當(dāng)微綠球藻密度大于6.0xl0Sind/mL后芽孢桿菌則抑制微綠球藻的 生長；隱藻在整個混合培養(yǎng)過程中均可受芽孢桿菌的促生長作用，到培養(yǎng)5天以 后，隱藻細(xì)胞數(shù)較對照組提高了 50%以上；雖然芽孢桿菌針對顫藻的直接作用程 度小，但通過促進(jìn)或調(diào)控混合培養(yǎng)系統(tǒng)中微綠球藻和隱藻的增長，加速體系中營 養(yǎng)的消耗從而間接控制微藻的數(shù)量。
在培養(yǎng)14d后系統(tǒng)中添加芽孢桿菌的微藻總細(xì)胞數(shù)為8.0xl06 ind/mL，而微 綠球藻的細(xì)胞數(shù)為3.2xl04nd/mL較不添加芽孢桿菌的降低了 38.0%,隱藻和綠 色顫藻則分別為2.8xl06ind/mL和2.0x106ind/mL，較不添加芽孢桿菌的分別升高 了 18%和2.5%。可見，培養(yǎng)過程通過利用地衣芽孢桿菌的添加促進(jìn)或調(diào)控混合 培養(yǎng)系統(tǒng)中各種藻的增長，或加速體系中營養(yǎng)的消耗從而間接控制微藻的數(shù)量， 有效調(diào)控各種微藻的數(shù)量比例，達(dá)到均衡生長的效果，避免某種微藻的數(shù)量出現(xiàn) 極端優(yōu)勢或劣勢。
實施例3
選擇池塘水色為鮮綠色、豆綠色或綠褐色，養(yǎng)殖水體浮游微藻生物多樣性指 數(shù)大于1.60，生產(chǎn)性能優(yōu)良的對蝦海水養(yǎng)殖池塘進(jìn)行全程跟蹤分析，篩選優(yōu)勢度 大于0.15以上的微綠球藻(jVa朋oc/z/ora戸^ ocw/",")、 隱藻(O，纖卵"x erara)禾口
綠色顫藻(O""toto"a CWW!'股)進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中應(yīng)用地衣芽孢桿菌
(5od//^ //c/^wz/ww的進(jìn)行調(diào)控，使系統(tǒng)中的各種微藻按一定比例穩(wěn)定增長。培 養(yǎng)過程中采用簡單相關(guān)分析法分析芽孢桿菌和各種微藻細(xì)胞增長的相關(guān)性；以通 徑分析法評價芽孢桿菌對各種微藻的影響。
培養(yǎng)液為全人工配置無機(jī)培養(yǎng)液，陳海水煮沸冷卻后加入KN03、Ca(H2P04)2 和檸檬酸鐵，使N、 P和Fe的濃度分別達(dá)到14mg/L、 2mg/L和0.14mg/L。 培 養(yǎng)過程中每3 d測定一次氮和磷的濃度，酌情加入KN03和Ca(H2P04)2，使總氮 和磷的濃度達(dá)到初始水平。
培養(yǎng)過程中各個培養(yǎng)組的相關(guān)條件一致，以恒溫循環(huán)器水浴控溫，溫度為 26~28°C， pH7.8，光照強(qiáng)度4000Lx，光暗比為12h : 12h，營養(yǎng)液的鹽度為15%。。
藻相中各微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的投放比例為1.0 : 1.0 : 1.0，各微藻的 初始投放密度為7X104Cells/mL;芽孢桿菌細(xì)胞的初始投放細(xì)胞密度為5X104 CFU/mL。培養(yǎng)容器為1MS的白色透光玻璃鋼桶，以白色透光塑料薄膜覆蓋桶口 ，進(jìn)行充氣培養(yǎng)。
擴(kuò)培過程按照上述調(diào)控措施對藻液培養(yǎng)進(jìn)行管理，并及時添加相應(yīng)比例的培 養(yǎng)液。培養(yǎng)過程通過利用地衣芽孢桿菌的添加促進(jìn)或調(diào)控混合培養(yǎng)系統(tǒng)中各種藻 的增長，或加速體系中營養(yǎng)的消耗從而間接控制微藻的數(shù)量，有效調(diào)控各種微藻 的數(shù)量比例，達(dá)到均衡生長的效果，避免某種微藻的數(shù)量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢。
本方法實踐表明在混合培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)初期l~4d芽孢桿菌對微綠球藻有 促進(jìn)作用，但當(dāng)微綠球藻密度大于6.5X 105ind/mL后芽孢桿菌則抑制微綠球藻的 生長；隱藻在整個混合培養(yǎng)過程中均可受芽孢桿菌的促生長作用，到培養(yǎng)6天以 后，隱藻細(xì)胞數(shù)較對照組提高了 51.6%;雖然芽孢桿菌針對顫藻的直接作用程度 小，但通過促進(jìn)或調(diào)控混合培養(yǎng)系統(tǒng)中微綠球藻和隱藻的增長，加速體系中營養(yǎng) 的消耗從而間接控制微藻的數(shù)量。
在培養(yǎng)16d后系統(tǒng)中添加芽孢桿菌的微藻總細(xì)胞數(shù)為8.5X106ind/mL,而微 綠球藻的細(xì)胞數(shù)為2.9X10、nd/mL較不添加芽孢桿菌的降低了 43.5%，隱藻和綠 色顫藻則分別為2.9X 106ind/mL和2.7X 106ind/mL，較不添加芽孢桿菌的分別升 高了 19.2%和3.1%。
總體而言，通過在培養(yǎng)體系中添加芽孢桿菌一方面既可有效提高個別種類微 藻的增長，又可有效調(diào)控各種微藻的數(shù)量比例，達(dá)到均衡生長的效果，避免某種 微藻的數(shù)量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢。
權(quán)利要求
1、一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征在于，選取優(yōu)勢度大于0.15的微藻置于氮濃度為12～16mg/L、磷濃度為2～6mg/L、鐵濃度為0.10～0.20mg/L的培養(yǎng)液中進(jìn)行混合培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)過程中采用地衣芽孢桿菌進(jìn)行調(diào)控，培養(yǎng)條件為溫度26～28℃，鹽度12～18‰，pH7.5～8.0，光照強(qiáng)度4000～5000Lx，光暗比12h∶12h～14h∶10h。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，培養(yǎng)液中氮源為硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀或尿素中的一 種或幾種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，培養(yǎng)液中磷源為磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉或過磷酸鈣中的一種或幾種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，培養(yǎng)液中鐵源為檸檬酸鐵。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，所述的微藻為微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的混合。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，所述的微綠球藻、隱藻和綠色顫藻的投放比例為0.7-1.3 : 0.7~1.3 : 0.7 1.3， 各微藻的初始投放密度為104 105CellS/mL。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，所述的芽孢桿菌的初始投放密度為104~105CFU/mL。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，其特征 在于，在養(yǎng)殖水體水色為鮮綠色、豆綠色或綠褐色，養(yǎng)殖水體浮游微藻生物多樣 性指數(shù)大于1.60的養(yǎng)殖池中，篩選出優(yōu)勢度大于0.15的微藻種類進(jìn)行混合培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芽孢桿菌調(diào)控浮游微藻混合培養(yǎng)的方法，選取優(yōu)勢度大于0.15的微藻置于氮濃度為12～16mg/L、磷濃度為2～6mg/L、鐵濃度為0.10～0.20mg/L的培養(yǎng)液中進(jìn)行混合培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)過程中采用地衣芽孢桿菌進(jìn)行調(diào)控，培養(yǎng)條件為溫度26～28℃，鹽度12～18‰，pH7.5～8.0，光照強(qiáng)度4000～5000Lx，光暗比12h∶12h～14h∶10h。采用該方法在混合培養(yǎng)體系中使用芽孢桿菌對各微藻進(jìn)行混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，各微藻生長均衡，穩(wěn)定性好，可避免混合培養(yǎng)體系中藻相的生物多樣性單一，避免某種微藻的數(shù)量出現(xiàn)極端優(yōu)勢或劣勢。
文檔編號C12R1/10GK101531977SQ200910038908
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日
發(fā)明者文國樑, 曹煜成, 李卓佳, 楊鶯鶯, 王少沛 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所