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一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的裝置及方法與流程

文檔序號:12166596閱讀:1558來源:國知局
一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的裝置及方法與流程

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),具體地,本發(fā)明涉及一種能夠以膠帶為基礎(chǔ)微流控芯片多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的裝置及方法。



背景技術(shù):

從二十世紀(jì)七十年代開始,用于生物分子和細(xì)胞的圖案化技術(shù)開始出現(xiàn)。細(xì)胞圖案化技術(shù)主要分為兩類:一類是通過表面修飾形成細(xì)胞黏附生長的圖案化區(qū)域,使細(xì)胞選擇性地黏附生長形成圖案;另一類是通過可移除的物理障礙將細(xì)胞限制在圖案化的區(qū)域生長,形成細(xì)胞圖案?;谏鲜鰞煞N原理,各種細(xì)胞圖案化技術(shù)相繼出現(xiàn)并得以發(fā)展。

目前,細(xì)胞圖案化的方法主要有光刻和軟刻蝕。光刻最初應(yīng)用于半導(dǎo)體產(chǎn)業(yè)中,該技術(shù)利用紫外光或白光將掩膜上的幾何圖案轉(zhuǎn)移到基底上。該過程首先在基底上鋪一層光敏聚合物‐‐‐光刻膠,然后基底在光掩膜覆蓋下曝光顯影形成圖案。將表面修飾材料(如蛋白質(zhì)等)吸附在基底表面后,將基底浸入到有機(jī)溶劑中將光刻膠洗脫,這樣就在底面上形成表面修飾蛋白質(zhì)的圖形,細(xì)胞就會按照已修飾的圖形粘附和生長,形成細(xì)胞圖案。光刻技術(shù)以其較高的精確度成為在固體表面上圖案化的主要手段。但是,光刻過程需要潔凈空間和昂貴的設(shè)備并且對實驗者要求較高,限制了其在生物技術(shù)方面的廣泛應(yīng)用。此外,光刻加工過程中用到的化學(xué)試劑容易使生物大分子變性,使他們失去活性。

近年來,Whitesides等人發(fā)展了一系列更具生物相容性的圖案化方法,統(tǒng)稱為“軟刻蝕”。軟刻蝕技術(shù)通過使用高分子聚合物【例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)】在有圖案的底膜上形成印章,達(dá)到復(fù)制微米甚至納米尺度結(jié)構(gòu)的目的。常用到的有微接觸印刷、微流控圖案化以及模板圖案化。其中,傳統(tǒng)的微接觸印刷只能形成一種或兩種分子圖案,只有使用多級印章才可以形成多種分子的圖案,但其制備過程相對比較復(fù)雜。微流控圖案化是一個與微接觸印刷相關(guān)的過程,但與微接觸印刷不同的是PDMS模板底面具有微通道網(wǎng)絡(luò)。由于微流控圖案化是運(yùn)用不同分子的溶液來形成圖案,因此一般來說每一種分子的圖案在表面上都是連續(xù)分布的,這就限制了圖案形狀的多樣性。模板圖案化是一種不需要對基底進(jìn)行化學(xué)修飾也可進(jìn)行細(xì)胞圖案化的方法,但該方法制作圓形、方形等簡單圖案比較容易,邊角較多的圖案在PDMS的剝離過程中易損壞。更重要的是,制作微流控芯片的模具在普通生物學(xué)實驗室中難以獲得,從而難以應(yīng)用微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞遷移、細(xì)胞圖案化的研究。

可見,目前細(xì)胞圖案化方法的不足之處在于,操作過程對環(huán)境、設(shè)備和實驗者要求較高,依賴于光刻生產(chǎn)模具限制了生物學(xué)實驗室應(yīng)用微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞圖案化實驗。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的主要目的在于提供一種不需要光刻技術(shù),方便易操作,可以用于任何一種細(xì)胞的圖案化、多種細(xì)胞共培養(yǎng)的裝置及方法。

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供了一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的裝置,包括:聚二甲基硅氧烷印及細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底;在膠帶上利用打孔針打孔形成微米級孔的陣列作為模板,在所述模板上直接澆灌聚二甲基硅氧烷得到內(nèi)部有微米級柱子陣列的通道,揭下所述膠帶形成所述聚二甲基硅氧烷印,所述柱子的直徑為200‐800μm;所述聚二甲基硅氧烷印章放置在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底上;所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底的基底表面不做處理,或孵育一層鼠尾膠原。

優(yōu)選的,所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底的基底為玻璃、硅片、金屬或高分子材料如聚苯乙烯等。

優(yōu)選的,所述柱子的直徑為300μm,高度為100μm,兩相鄰柱子之間的距離為300μm。

優(yōu)選的,所述膠帶為3M膠帶,其由2層所述膠帶構(gòu)成,以保證柱子和管道的高度為100μm以上。

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明還提供了一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的方法,采用上述裝置,具體包括以下步驟:

步驟一、準(zhǔn)備細(xì)所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底,制備所述聚二甲基硅氧烷?。?/p>

步驟二、在水和冰醋酸溶劑中配成濃度為50μg/mL的鼠尾膠原,在低溫4℃條件下操作,滴加所述鼠尾膠原于所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將其放于培養(yǎng)箱12h后用PBS溶液清洗2次,再放入培養(yǎng)箱使其自然蒸干,將所述聚二甲基硅氧烷印放置在已經(jīng)孵育一層鼠尾膠原的所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,借助范德華力連接在一起形成可逆轉(zhuǎn)的密封;

步驟三、制備細(xì)胞的懸浮溶液并注入孵育一層鼠尾膠原的所述胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

優(yōu)選的,步驟三中的細(xì)胞的懸浮溶液為肺癌細(xì)胞的懸浮液,細(xì)胞濃度大于107個/ml,所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度為37℃、二氧化碳體積濃度5%,培養(yǎng)時間為2小時。

優(yōu)選的,還包括步驟四,在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底加入足量PBS溶液將聚二甲基硅氧烷印章完全浸沒,借助溶液給聚二甲基硅氧烷浮力,可將可逆轉(zhuǎn)的密封空間打通,揭掉所述聚二甲基硅氧烷印章,所述圓柱所在位置變成空余區(qū)域,再加入新的所述肺癌細(xì)胞的懸浮液,放入所述培養(yǎng)箱中按照上述條件培養(yǎng)7個小時。

優(yōu)選的,步驟四還可以為,即制備細(xì)胞HDF‐n懸浮液,所述懸浮液密度為105個/ml,將其加入到肺癌細(xì)胞圖案化的所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底放入所述細(xì)胞培養(yǎng)箱,溫度為37℃,二氧化碳體積濃度為5%,培養(yǎng)1小時,用PBS溶液反復(fù)清洗幾次,換上新細(xì)胞HDF‐n懸浮液,再放入所述細(xì)胞培養(yǎng)箱,觀察兩種細(xì)胞相互影響。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果在于:

打破了傳統(tǒng)微流控芯片制備對于光刻技術(shù)的限制,在普通實驗室就可以完成,降低了對潔凈空間的要求。而且因為模板可被重復(fù)利用,相對傳統(tǒng)細(xì)胞圖案化技術(shù)來說本發(fā)明是一個更加方便,有效和經(jīng)濟(jì)的圖案化方法。具體而言,本發(fā)明以膠帶為基礎(chǔ),利用打孔針和刻刀制備模板,無需光刻技術(shù),利用聚二甲基硅氧烷有利于細(xì)胞生長的特性,實現(xiàn)細(xì)胞的圖案化,突破了傳統(tǒng)細(xì)胞圖案化技術(shù)中對于光刻技術(shù)的限制。

附圖說明

圖1是用一定型號直徑300μm的打孔針在任意膠帶上打孔,形成微米級孔的陣列示意圖;

圖2是澆注聚二甲基硅氧烷制備具有直徑為微米級柱子陣列的網(wǎng)絡(luò)通道示意圖;

圖3是在聚二甲基硅氧烷印章微網(wǎng)絡(luò)通道中接種細(xì)胞示意圖;

圖4將聚二甲基硅氧烷印章揭掉得到細(xì)胞圖案示意圖;

圖5是利用本發(fā)明方法得到肺癌細(xì)胞(A549)生長遷移變化效果圖;

圖6是利用本發(fā)明方法得到體細(xì)胞人真皮成纖維細(xì)胞‐新生(HDF‐n)和肺癌細(xì)胞(A549)共培養(yǎng)效果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚,下面將結(jié)合附圖及具體實施例進(jìn)行詳細(xì)描述。

如圖1‐2所示,提供了一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的裝置,包括:聚二甲基硅氧烷印及細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底;在膠帶上利用打孔針打孔形成微米級孔的陣列作為模板,在所述模板上直接澆灌聚二甲基硅氧烷得到內(nèi)部有微米級柱子陣列的通道,揭下所述膠帶形成所述聚二甲基硅氧烷印,所述柱子的直徑為100‐800μm;所述聚二甲基硅氧烷印章放置在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底上;所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底的基底表面不做處理,或孵育一層鼠尾膠原,使細(xì)胞在更接近生物體真實環(huán)境中粘附生長。其制作過程不需要光刻技術(shù),方便易操作,能夠用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)觀察。

具體的,所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底的基底為玻璃、硅片、金屬或高分子材料,方便取材,成本低廉。

具體的,還給出了柱子的具體尺寸以保證滿足細(xì)胞培養(yǎng)的特殊需求,即所述柱子的直徑為300μm,高度為100μm,兩相鄰柱子之間的距離為300μm。

具體的,所述膠帶選擇為常用易得的3M膠帶,其由2層所述膠帶構(gòu)成,以保證柱子的高度為100μm。

為了明確操作方式,本發(fā)明還給出了一種多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的方法,采用上述裝置,具體包括以下步驟:

步驟一、準(zhǔn)備細(xì)所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底,制備所述聚二甲基硅氧烷??;準(zhǔn)備好用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器;

步驟二、在水和冰醋酸溶劑中配成濃度為50μg/mL的鼠尾膠原,在低溫4℃條件下操作,滴加所述鼠尾膠原于所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將其放于培養(yǎng)箱12h后用PBS溶液清洗2次,再放入培養(yǎng)箱使其自然蒸干,將所述聚二甲基硅氧烷印放置在已經(jīng)孵育一層鼠尾膠原的所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,借助范德華力連接在一起形成可逆轉(zhuǎn)的密封,使細(xì)胞在更接近生物體真實環(huán)境中粘附生長;

步驟三、制備細(xì)胞的懸浮溶液并注入孵育一層鼠尾膠原的所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,打破了傳統(tǒng)微流控芯片制備對于光刻技術(shù)的限制,建立了一種以膠帶為基礎(chǔ)微流控芯片多種細(xì)胞圖案化共培養(yǎng)的方法,可用于任何一種細(xì)胞的圖案化,多種細(xì)胞的共培養(yǎng)。還可用于研究藥物在細(xì)胞相互作用下的作用和功能,如圖3所示,得到了圖案化的培養(yǎng)細(xì)胞。

具體的,針對具體細(xì)胞,步驟三中的細(xì)胞的懸浮溶液為肺癌細(xì)胞的懸浮液,細(xì)胞濃度大于107個/ml,將其用于肺癌細(xì)胞的培養(yǎng),還給出了具體的培養(yǎng)條件,即所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度為37℃、二氧化碳體積濃度5%,培養(yǎng)時間為2小時,形成如圖4細(xì)胞圖案化。

具體的,為了觀察細(xì)胞遷移情況,還包括步驟四,在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底加入足量PBS溶液將聚二甲基硅氧烷印章完全浸沒,借助溶液給聚二甲基硅氧烷浮力,可將可逆轉(zhuǎn)的密封空間打通,揭掉所述聚二甲基硅氧烷印章,所述圓柱所在位置變成空余區(qū)域,再加入新的所述肺癌細(xì)胞的懸浮液,放入所述培養(yǎng)箱中按照上述條件培養(yǎng)7個小時,實驗結(jié)果見圖5所示,聚二甲基硅氧烷印章拿走后,圓柱所在位置變成空余區(qū)域,空余區(qū)域的面積隨著時間增長逐漸減少,經(jīng)過7個小時左右A549細(xì)胞基本沒有空余區(qū)域生長遷移,這樣我們通過空余區(qū)域面積的變化可以得到細(xì)胞遷移變化,

具體的,本方法還能夠用于觀察兩種細(xì)胞相互作用情況,即步驟四還可以為,即制備細(xì)胞HDF‐n懸浮液,所述懸浮液密度為105個/ml,將其加入到肺癌細(xì)胞圖案化的所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底中,將所述細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板基底放入所述細(xì)胞培養(yǎng)箱,溫度為37℃,二氧化碳體積濃度為5%,培養(yǎng)1小時,用PBS溶液反復(fù)清洗幾次,換上新細(xì)胞HDF‐n懸浮液,再放入所述細(xì)胞培養(yǎng)箱,觀察兩種細(xì)胞相互影響,實驗結(jié)果見圖6體細(xì)胞(HDF‐n)和癌細(xì)胞(A549)共同培養(yǎng)。

本發(fā)明提供的裝置及方法,打破了傳統(tǒng)微流控芯片制備對于光刻技術(shù)的限制,在普通實驗室就可以完成,降低了對潔凈空間的要求。而且因為模板可被重復(fù)利用,相對傳統(tǒng)細(xì)胞圖案化技術(shù)來說本發(fā)明是一個更加方便,有效和經(jīng)濟(jì)的圖案化方法。具體而言,本發(fā)明以膠帶為基礎(chǔ),利用打孔針和刻刀制備模板,無需光刻技術(shù),利用聚二甲基硅氧烷有利于細(xì)胞生長的特性,實現(xiàn)細(xì)胞的圖案化,突破了傳統(tǒng)細(xì)胞圖案化技術(shù)中對于光刻技術(shù)的限制。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤飾,這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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