一種片段縮合制備曲普瑞林的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種片段縮合制備曲普瑞林的方法，固相制備曲普瑞林的全保護的第一肽片段序列；液相制備曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列并脫除其氨基端保護基；液相中，脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與第一肽片段序列縮合，得到全保護的曲普瑞林；脫去全保護的曲普瑞林的側鏈保護基得到曲普瑞林粗肽，高效液相純化換鹽得到醋酸曲普瑞林；其中，所述的第一肽片段序列為曲普瑞林序列中的第1～7位氨基酸，所述的第二肽片段序列為曲普瑞林序列中的第8～10位氨基酸。本發(fā)明利用固液相結合片段縮合的方法制備曲普瑞林，提高了產(chǎn)率和純度，成本低，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種片段縮合制備曲普瑞林的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領域，具體涉及一種片段縮合制備曲普瑞林的方法。

【背景技術】
[0002] 曲普瑞林，英文名：Triptorelin，商品名：達菲林、達必佳，肽序列為：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pr〇-Gly-NH2，分子式：C64H82N18013，分子量：1310. 63。
[0003] 曲普瑞林作為一種促性腺激素釋放激素類似物，主要作用于垂體前葉，臨床用于 治療相關性激素病癥，包括晚期前列腺癌、子宮內膜異位、子宮肌瘤、體外受精、中樞性性早 熟癥等。
[0004]目前曲普瑞林的制備方法主要以逐個縮合為主。例如專利US4010125使用 Benzhydrylamine樹脂為起始原料，以Boc保護的氨基酸為單體，專利CN200710044419. 7 和CN201310013712.2 以及CN201310014882.2,均以RinkAmideMBHA樹脂或者RinkAmide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，依次逐個接上氨基酸，裂解獲得曲普瑞 林粗品，最后HPLC進行分尚純化，獲得目標廣物。
[0005] 以上方法有如下一些問題：a)曲普瑞林序列中存在Arg-Pro,在常規(guī)條件下用固 相方法縮合需要過量氨基酸，且縮合效率低，容易出現(xiàn)缺陷肽。這是由于氨基酸自身結構導 致的立體位阻使得縮合反應極為困難。b)使用Rink樹脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合 成不經(jīng)濟；并且相對于2-氯-三苯甲基氯樹脂價格不菲。c)全液相合成時，需要良好的后 處理技術。
[0006] 所以本領域技術人員仍然期待以高收率、低成本獲得具有良好品質的產(chǎn)品。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有制備方法收率低，而且產(chǎn)品純化困難，不易得到高純度的曲普瑞 林的問題，提供一種固液相結合片段縮合的方法制備曲普瑞林，提高產(chǎn)率和純度；由于采用 2_氯-三苯甲基氯樹脂使得成本降低，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0009]方案一：
[0010] 一種片段縮合制備曲普瑞林的方法，固相制備曲普瑞林的全保護的第一肽片段序 列；液相制備曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列并脫除其氨基端保護基；液相中，脫除 了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與第一肽片段序列縮合，得到全保護的曲普瑞 林；脫去全保護的曲普瑞林的側鏈保護基得到曲普瑞林粗肽，高效液相純化換鹽得到醋酸 曲普瑞林；
[0011] 其中，
[0012] 所述的第一肽片段序列為曲普瑞林序列中的第1?7位氨基酸，
[0013] 所述的第二肽片段序列為曲普瑞林序列中的第8?10位氨基酸。
[0014] 上述片段縮合制備曲普瑞林的方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0015] (1)固相制備曲普瑞林的全保護的第一肽片段序列樹脂，
[0016] 所述的全保護第一肽片段序列為：
[0017] Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D~Trp(Boc)-Leu-〇H,
[0018] 將全保護第一肽片段序列從固相載體上裂解；
[0019] ⑵液相合成曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列，
[0020] 所述的全保護的第二肽片段序列為：
[0021] Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ；
[0022] 脫除全保護的第二肽片段序列的氨基端保護基；
[0023] (3)液相中將步驟⑵得到的脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與 步驟（1)得到的全保護的第一肽片段序列縮合得到全保護曲普瑞林；
[0024] (4)將全保護曲普瑞林裂解脫去側鏈保護基得到曲普瑞林粗品；
[0025] (5)曲普瑞林粗品經(jīng)純化轉鹽得到醋酸曲普瑞林。
[0026] 步驟⑴中，全保護的第一肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相載體上獲 得；其中，所用的固相載體為酸敏感樹脂，優(yōu)選為2-氯-三苯甲基氯樹脂。
[0027] 固相制備曲普瑞林全保護第一肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保護試 劑為體積百分含量為20 %的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液； 優(yōu)選體積百分含量為20 %哌啶的DMF溶液。
[0028] 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按 摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合。優(yōu)選HBTU與HOBt 與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；待偶聯(lián)的氨基酸與HOBt的摩爾比是1:1。
[0029] 使用的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。優(yōu)選體積百 分含量為〇. 5?1 %TFA的DCM溶液。
[0030] 步驟（2)中，液相合成全保護的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH與 H_Gly_NH2反應得到Fmoc-Pr〇-Gly-NH2,脫去Fmoc保護后與Fmoc-Arg(Pbf)-〇H反應得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2。
[0031] 所述脫除全保護的第二肽片段序列的氨基端保護基也就是脫去 Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 的Fmoc保護，得到H_Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2。
[0032] 氨基脫保護試劑為體積百分含量16 %的哌啶的DMF溶液，或者體積百分含量為 1 %的DBU的DMF溶液，或者體積百分含量為50 %的二乙胺的DCM溶液；優(yōu)選體積百分含量 為50 %二乙胺的DCM溶液。縮合反應使用的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2 的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按摩爾比1:1 的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2 的組合，優(yōu)選DIC與HOBt按摩爾比1:1的組合；縮合反應的溶劑為THF、DMF、DCM、NMP和 DMS0中的任意一種或幾種的組合，優(yōu)選THF。
[0033] 步驟（3)中，將步驟⑵得到的脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列 與步驟（1)得到的全保護的第一肽片段序列縮合得到全保護曲普瑞林過程中，使用的縮合 劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比 1:1:2的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者DIC與HOBt按摩爾比1:1的組 合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合，優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾 比1:1:2的組合；縮合反應的溶劑為THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一種或幾種的組 合，優(yōu)選DMF。
[0034] 步驟⑷中，全保護曲普瑞林裂解使用的裂解液為TFA與H20按體積比95:5的混 合溶液、或者TFA與EDT與TIS與PhOH與H20按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA與EDT與TIS與H20按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。優(yōu)選TFA與EDT與TIS與 H20按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0035] 步驟（5)中，純化為反相高效液相色譜純化換鹽，即色譜柱為C18柱；流動相為 0. 25%v/v醋酸水溶液和80%v/v乙腈水溶液。
[0036]方案二：
[0037] -種片段縮合制備曲普瑞林的方法，固相制備曲普瑞林的全保護的第三肽片段序 列樹脂，然后將全保護的第三肽片段序列從樹脂上裂解下來，液相中與H-Gly_NH2縮合得到 全保護的曲普瑞林，然后脫去側鏈保護得到曲普瑞林粗品，純化轉鹽得到醋酸曲普瑞林；
[0038] 其中，所述的第三肽片段序列為曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
[0039] 上述片段縮合制備曲普瑞林的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0040] (a)固相制備曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂，
[0041] 所述的曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列為：
[0042] Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D~Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pr〇-〇 H,
[0043] 將全保護的第三肽片段序列從固相載體上裂解；
[0044] (b)液相中全保護第三肽片段序列與H-Gly_NH2縮合得到全保護的曲普瑞林；
[0045] (c)將全保護的曲普瑞林裂解脫去側鏈保護基得到曲普瑞林粗品；
[0046] (d)曲普瑞林粗品經(jīng)純化轉鹽得到醋酸曲普瑞林。
[0047] 步驟（a)中，曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固 相載體上獲得肽樹脂；其中，所用的固相載體為酸敏感樹脂，優(yōu)選為2-氯-三苯甲基氯樹 脂。
[0048] 固相制備曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保 護試劑為體積百分含量為20%的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液；優(yōu)選體積百分含量為20 %哌啶的DMF溶液。
[0049] 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按 摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合。優(yōu)選HBTU與HOBt 與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；待偶聯(lián)的氨基酸與HOBt的摩爾比是1:1。
[0050] 使用的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。優(yōu)選體積百 分含量為〇. 5?1 %TFA的DCM溶液。
[0051] 步驟（b)中曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列與H-Gly_NH2縮合的縮合劑為 HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的 組合、或者DIC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者 PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合，優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2 的組合；縮合反應的溶劑為THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一種或幾種的組合，優(yōu)選DMF。待偶聯(lián)的羧基端與HOBt的摩爾比是1:1。
[0052] 步驟（c)中，全保護曲普瑞林裂解使用的裂解液為TFA與H20按體積比95:5的混 合溶液、或者TFA與EDT與TIS與PhOH與H20按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA 與EDT與TIS與H20按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。優(yōu)選TFA與EDT與TIS與 H20按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0053] 步驟（d)中，純化為反相高效液相色譜純化換鹽，即色譜柱為C18柱；流動相為醋 酸水溶液和乙腈水溶液。
[0054] 有益效果：本發(fā)明相對現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：
[0055] 1、本發(fā)明利用較高荷載量的酸敏感樹脂為起始原料，先采用標準的固相肽合成技 術合成選定結構的高純度肽片段，液相合成困難序列，再采用液相偶聯(lián)技術使肽片段縮合， 從而獲得高純度（>98. 5% )、高收率（>40% )的目標肽。
[0056] 2、在合成存在"困難序列"的多肽時，往往采用片段縮合法。相比較連續(xù)固相與全 液相合成曲普瑞林的工藝，本發(fā)明：
[0057] a. 2-氯-三苯甲基氯樹脂重復使用方法簡便，價格低廉；每個片段可使用高荷載 量（>0. 8mmol/g樹脂）的固相載體，物料通量增加；
[0058] b.避開困難序列的肽片段合成中氨基酸及試劑投量為1. 5-2倍量，遠低于固相肽 合成常規(guī)的3-4倍甚至5倍、6倍過量，節(jié)約物料成本；
[0059] c.相比較全液相合成，固液相結合片段縮合技術取二者之優(yōu)點，兼有固相合成工 藝簡便和液相合成的低物料投入。
[0060] 3、采用超酸敏感型樹脂合成的較短氨基酸的側鏈保護肽片段序列純度非常高，不 必用色譜技術純化，只需要進行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其雜質主要為未偶合 的片段，而不是缺少一個或數(shù)個氨基酸的缺陷肽，在最終高效液相色譜純化中容易得多，從 而減少制備次數(shù)，降低了曲普瑞林的制備成本，有利于實現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0061] 圖1為本發(fā)明制備的曲普瑞林純肽分析色譜圖；
[0062] 圖2為本發(fā)明制備的曲普瑞林純肽質譜圖。

【具體實施方式】
[0063] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0064] 本發(fā)明中，合成曲普瑞林所涉及的目的肽及中間體的肽片段氨基酸序列見表1。本 發(fā)明中肽片段組合方式見表2。所使用的物料縮寫的含義見表3。
[0065] 表1曲普瑞林相應的編碼氨基酸序列
[0066]

【權利要求】
1. 一種片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制備曲普瑞林的全保護的第 一肽片段序列；液相制備曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列并脫除其氨基端保護基；液 相中，脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與第一肽片段序列縮合，得到全保 護的曲普瑞林；脫去全保護的曲普瑞林的側鏈保護基得到曲普瑞林粗肽，高效液相純化換 鹽得到醋酸曲普瑞林； 其中， 所述的第一肽片段序列為曲普瑞林序列中的第1?7位氨基酸， 所述的第二肽片段序列為曲普瑞林序列中的第8?10位氨基酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步 驟： (1) 固相制備曲普瑞林的全保護的第一肽片段序列樹脂， 所述的全保護第一肽片段序列為： Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-〇H, 將全保護第一肽片段序列從固相載體上裂解； (2) 液相合成曲普瑞林的全保護的第二肽片段序列， 所述的全保護的第二肽片段序列為： Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ； 脫除全保護的第二肽片段序列的氨基端保護基； (3) 液相中將步驟（2)得到的脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與步驟 (1)得到的全保護的第一肽片段序列縮合得到全保護曲普瑞林； (4) 將全保護曲普瑞林裂解脫去側鏈保護基得到曲普瑞林粗品； (5) 曲普瑞林粗品經(jīng)純化轉鹽得到醋酸曲普瑞林。
3. 根據(jù)權利要求2所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（1)中，全 保護的第一肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相載體上獲得；其中，所用的固相載 體為酸敏感樹脂； 固相制備曲普瑞林全保護第一肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保護試劑為 體積百分含量為20%的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液； 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、或者PyBOP與 HOBt與DIEA的組合； 使用的裂解劑為體積百分含量為〇. 5?1%的TFA的DCM溶液、體積百分含量為20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。
4. 根據(jù)權利要求2所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（2) 中，液相合成全保護的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH與H-Gly-NH2反應得到Fmoc-Pro_Gly-NH2,脫去Fmoc保護后與Fmoc-Arg(Pbf)-〇H反應得至lj Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ； 所述脫除全保護的第二肽片段序列的氨基端保護基也就是脫去 Fmoc-Arg (Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 的 Fmoc 保護，得到 H_Arg (Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 ; 氨基脫保護試劑為體積百分含量16%的哌啶的DMF溶液，或者體積百分含量為1%的 DBU的DMF溶液，或者體積百分含量為50 %的二乙胺的DCM溶液；縮合反應使用的縮合劑為 HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、 或者EDC與HOBt的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應使用的反應溶劑為 THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一種或幾種的組合。
5. 根據(jù)權利要求2所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（3)中，將 步驟（2)得到的脫除了氨基端保護基的全保護的第二肽片段序列與步驟（1)得到的全保護 的第一肽片段序列縮合得到全保護曲普瑞林過程中，使用的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA 的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者EDC與HOBt的組合、或者DIC與HOBt的組 合、或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應的溶劑為THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的 任意一種或幾種的組合。
6. -種片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制備曲普瑞林的全保護 的第三肽片段序列樹脂，然后將全保護的第三肽片段序列從樹脂上裂解下來，液相中與 H-Gly-NH2縮合得到全保護的曲普瑞林，然后脫去側鏈保護得到曲普瑞林粗品，純化轉鹽得 到醋酸曲普瑞林； 其中，所述的第三肽片段序列為曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
7. 根據(jù)權利要求6所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步 驟： (a) 固相制備曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂， 所述的曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列為： Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pr〇-〇H, 將全保護的第三肽片段序列從固相載體上裂解； (b) 液相中全保護第三肽片段序列與H-Gly-NH2縮合得到全保護的曲普瑞林； (c) 將全保護的曲普瑞林裂解脫去側鏈保護基得到曲普瑞林粗品； (d) 曲普瑞林粗品經(jīng)純化轉鹽得到醋酸曲普瑞林。
8. 根據(jù)權利要求7所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（a)中，曲 普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相載體上獲得肽樹脂；其 中，所用的固相載體為酸敏感樹脂； 固相制備曲普瑞林的全保護的第三肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保護試 劑為體積百分含量為20 %的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液； 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、或者PyBOP與 HOBt與DIEA的組合； 使用的裂解劑為體積百分含量為〇. 5?1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。
9. 根據(jù)權利要求7所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（b)中曲普 瑞林的全保護的第三肽片段序列與H-Gly-NH2縮合的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA的組 合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、或者EDC與HOBt的組合、 或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應的溶劑為THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任 意一種或幾種的組合。
10. 根據(jù)權利要求7所述的片段縮合制備曲普瑞林的方法，其特征在于，步驟（c)中，全 保護曲普瑞林裂解使用的裂解液為TFA與H20按體積比95:5的混合溶液、或者TFA與EDT 與TIS與PhOH與H20按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA與EDT與TIS與H20按體 積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
【文檔編號】C07K1/02GK104387454SQ201410743707
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權日:2014年12月8日
【發(fā)明者】彭雅麗, 常民, 王銳, 薛宏祥, 賀真 申請人:蘭州大學