本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從刺五加的干燥根中分離得到的一種具有治療急性T淋巴細(xì)胞白血病作用的甾體類化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：刺五加Acanthopanaxsenticosu(Rupr.EtMaxim)Harms的干燥根及根莖入藥，其莖、葉也可藥用。刺五加與人參同屬于五加科植物，是一種落葉植物，因小枝密生針刺而得名。主產(chǎn)于中國東北部(黑龍江、吉林、遼寧、河北)、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及日本北海道等地，刺五加是我國東北地區(qū)典型的藥用植物，味辛、微苦、性溫、無毒。刺五加具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神、益精壯骨之功效。本草綱目稱刺五加為“本經(jīng)上品”，能“補(bǔ)中益氣，堅(jiān)筋骨強(qiáng)意志，久服輕身耐老”。民間有“寧得一把五加，不用金玉滿車”的說法。以刺五加為原料的中成藥種類繁多，如刺五加片、刺五加注射液、安神補(bǔ)腦膠囊、腦安片等；另外中醫(yī)處方對(duì)刺五加需求量也較大，刺五加全國年需求量500萬公斤以上，使刺五加的市場供應(yīng)日趨緊張。刺五加化學(xué)成分復(fù)雜，根和根莖的主要成分為酚苷類化合物，實(shí)驗(yàn)證明刺五加總苷是其生物活性成分之一。已分離出七種刺五加苷(A、B、C、D、E、F、G)含量比例8:30:10:12:4:2:l，分別為胡蘿卜苷(A)，紫丁香酚苷(B)，乙基半乳糖普(C)，紫丁香樹脂酚二糖苷(D)，此外還有E、F和G，以及L。近些年對(duì)刺五加莖葉的研究不斷深入，從葉中分離得到齊墩果酸為配基的五加葉苷I、K、L和M等。現(xiàn)代藥理研究表明刺五加可增強(qiáng)機(jī)體非特異性防御能力，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗損傷及抗疲勞作用外，還可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱等癥。近年來，經(jīng)過對(duì)刺五加生理活性和化學(xué)成分方面的研究，表明刺五加有效成分為苷類，其中刺五加苷B、E是主要有效成分。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種從刺五加的干燥根中分離得到的一種具有治療急性T淋巴細(xì)胞白血病作用的甾體類化合物及其制備方法。本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種新的甾體類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式的，所述的化合物的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將刺五加的干燥根粉碎，用75～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用75％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物。進(jìn)一步地，步驟(a)中，用80％乙醇熱回流提取，合并提取液。進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。所述的化合物在制備治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。所述的藥物組合物在制備治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。附圖說明圖1為一種新的甾體類化合物的結(jié)構(gòu)式；圖2為一種新的甾體類化合物的理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí)施例1：一種新的甾體類化合物的分離制備及結(jié)構(gòu)確證試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。制備方法：(a)刺五加的干燥根(10kg)粉碎，用80％乙醇熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用75％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏(163g)；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體積比為85:1(10個(gè)柱體積)、45:1(9個(gè)柱體積)、20:1(8個(gè)柱體積)、10:1(8個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3(49g)用200-300目正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積)、20:1(10個(gè)柱體積)和10:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2(31g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠ODS-C18分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(244mg)。結(jié)構(gòu)確證：白色粉末；HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z449.3014，結(jié)合核磁特征可得分子式為C28H42O3，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(1.74，m)，H-1(2.01，m)，H-2(5.68，m)，H-3(5.67，m)，H-4(1.99，m)，H-4(2.25，m)，H-6(5.91，d，J＝10.0)，H-7(5.12，d，J＝10.0)，H-11(1.38，m)，H-11(1.89，m)，H-12(1.35，m)，H-12(1.88，m)，H-15(1.43，m)，H-15(1.76，m)，H-16(1.38，m)，H-17(1.49，m)，H-18(0.89，s)，H-19(1.07，s)，H-20(2.01，m)，H-21(0.98，d，J＝6.5)，H-22(5.13，dd，J＝15.3，7.7)，H-23(5.16，dd，J＝15.3，7.0)，H-24(1.78，m)，H-25(1.37，m)，H-26(0.79，d，J＝7.0)，H-27(0.82，d，J＝7.0)，H-28(0.88，d，J＝6.6)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，DMSO-d6，150MHz)：29.7(CH2，1-C)，123.8(CH，2-C)，126.4(CH，3-C)，36.5(CH2，4-C)，72.6(C，5-C)，140.3(CH，6-C)，123.8(CH，7-C)，67.1(C，8-C)，75.2(C，9-C)，41.7(C，10-C)，25.3(CH2，11-C)，27.7(CH2，12-C)，41.8(C，13-C)，83.6(C，14-C)，28.1(CH2，15-C)，26.3(CH2，16-C)，51.6(CH，17-C)，15.2(CH3，18-C)，21.2(CH3，19-C)，39.1(CH，20-C)，20.7(CH3，21-C)，134.3(CH，22-C)，132.5(CH，23-C)，42.4(CH，24-C)，32.7(CH，25-C)，19.6(CH3，26-C)，20.1(CH3，27-C)，17.5(CH3，28-C)；碳原子標(biāo)記參見圖1。1HNMR譜顯示六個(gè)甲基信號(hào)[δH0.79(d，J＝7.0Hz，Me-26)，0.82(d，J＝7.0Hz，Me-27)，0.88(d，J＝6.6Hz，Me-28)，0.89(s，Me-18)，0.98(d，J＝6.5Hz，Me-21)，1.07(s，Me-19)]，六個(gè)烯烴次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH5.12(d，J＝10.0Hz，H-7)，5.13(dd，J＝15.3，7.7Hz，H-22)，5.16(dd，J＝15.3，7.0Hz，H-23)，5.68(m，H-2)，5.67(m，H-3)，5.91(d，J＝10.0Hz，H-6)]。13CNMR譜顯示28個(gè)共振碳信號(hào)，包括六個(gè)甲基信號(hào)[δC15.2(C-18)，17.5(C-28)，19.6(C-26)，20.1(C-27)，20.7(C-21)，21.2(C-19)]，六個(gè)亞甲基，十個(gè)次甲基[六個(gè)烯屬次甲基δC123.8(C-2)，123.8(C-7)，126.4(C-3)，132.5(C-23)，134.3(C-22)，140.3(C-6)]，六個(gè)季碳[四個(gè)含氧季碳δC67.1(C-8)，72.6(C-5)，75.2(C-9)，83.6(C-14)]。HMBC譜中，H2-4(δH1.99/2.25)與C-5(δC72.6)和C-6(δC140.3)；Me-19(δH1.07)與C-5(δC72.6)和C-9(δC75.2)；H-6(δH5.91)與C-8(δC67.1)和C-5(δC72.6)；H-7(δH5.12)與C-8(δC67.1)，C-9(δC75.2)和C-14(δC83.6)；以及Me-18(δH0.89)與C-14(δC83.6)的相關(guān)性表明C-5和C-14位各連有一個(gè)羥基，C-8和C-9之間存在環(huán)氧基團(tuán)。NOESY譜表明B環(huán)為船式構(gòu)型，則8,9-環(huán)氧基團(tuán)為α構(gòu)型。H-22和H-23之間大的耦合常數(shù)(15.3Hz)表明C-22和C-23之間的雙鍵為E構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。實(shí)施例2：一種新的甾體類化合物的藥理作用試驗(yàn)一、材料和儀器急性T淋巴細(xì)胞白血病Molt4細(xì)胞由暨南大學(xué)血液病研究所惠贈(zèng)；慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562細(xì)胞由暨南大學(xué)由生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈(zèng)?；衔餅樽灾?，HPLC歸一化純度大于98％，用DMSO分析純?nèi)芙馀渲瞥?.5μg/mL溶液備用。DMEM/F12培養(yǎng)基粉、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、四苯基氮哇藍(lán)試劑(MTT)購于美國Gibeo公司。新生牛血清(NewbomCalfSerum)購于中國杭州四季青公司。青霉素(Penicillin)、鏈霉素(Streptomycin)購于華北制藥公司中國。碘化丙睫(PT)購于美國Sigma公司。PI-AnnexinV雙染試劑盒購于中國北京寶賽生物技術(shù)公司。ROS高質(zhì)熒光測定試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)研究所。Rhodamine123購于美國MolecularProbes公司。CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma)，超凈工作臺(tái)(中國蘇州凈化儀器廠)，壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX40BI)(中國上海申安醫(yī)療器械廠)，TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)(中國上海安亭科學(xué)儀器廠)，MA260S型電子分析天平(中國上海第二天平儀器廠)，自動(dòng)雙重純水蒸餾器(中國上海玻璃儀器一廠)，SterivexTM，0.22μm無菌針頭式過濾器(美國Millipore公司)，XDS-1B光學(xué)倒置顯微鏡(中國重慶光學(xué)儀器廠)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BIO-RID公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BDFACSAria公司)。QL-901型旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。二、試驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng)人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Molt4細(xì)胞培養(yǎng)體系：DMEM/F12培養(yǎng)液含10％新生牛血清，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱，每2-3天傳代培養(yǎng)。選用對(duì)數(shù)生長期、0.2％臺(tái)盼藍(lán)拒染率>95％的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率3×104mLMolt4細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，終體積為200μL/孔，每組設(shè)5復(fù)孔，化合物設(shè)五個(gè)濃度分別為2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg//mL，20μg//mL。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h、72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL用PBS<ph＝7.4配)20μL，繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，離心，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解，酶標(biāo)儀檢測吸光值(測定波長570nm，參比波長690nm)，計(jì)算各組增殖抑制率。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。增殖抑制率(％)＝(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100％。3、PI單染檢測細(xì)胞周期2×l05/mLMolt4細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1800μL，化合物(Ⅰ)設(shè)三個(gè)濃度分別為5μg/mL，10μg/mL15μg/mL，終體積2500μL，設(shè)3復(fù)孔。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，預(yù)冷的0.01mol/LPBS洗滌細(xì)胞2次，用體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇4℃固定過夜，離心去上清，加入PI染色液(含RNA酶)，終濃度50μg/mL，避光染色30min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量，每個(gè)樣本隨機(jī)分析12000個(gè)細(xì)胞，得各組細(xì)胞生長周期比例，美國BDFACSortCellQuest軟件分析處理結(jié)果。4、AnnexinV-PI雙染測定細(xì)胞凋亡比例細(xì)胞處理及加藥方法均同上，培養(yǎng)48h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，各組取lmL細(xì)胞，預(yù)冷0.01mol/LPBS洗滌3次，吸盡上清，加入200μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，分別加入10μLAnnexinV-FITC和5μL，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30min，再加入300μL結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測。AnnexinV-FITC+、PI-的細(xì)胞群(即LR細(xì)胞群)為早期凋亡細(xì)胞。5、統(tǒng)計(jì)分析以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-wayANOVA)分析組間差異的顯著性。三、結(jié)果及結(jié)論1、化合物對(duì)Molt4細(xì)胞的增殖抑制作用化合物在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Molt4細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。DMSO(0.5％)組在48h、72h的增殖抑制率分別是5.2％±0.8％、6.40％±0.9％。不同濃度化合物處理組的增殖抑制率與DMSO組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相同濃度條件下，72h的增殖抑制率較48h高?；衔飳?duì)Molt4細(xì)胞48h、72h的IC50分別是19.4±0.2μg/mL、15.7±0.1μg/mL。不同濃度的化合物均顯示一定的增殖抑制效果，且具有時(shí)間、劑量賴關(guān)系。結(jié)果見表1(注：*標(biāo)記與Control組比較，P<0.01)。2、化合物對(duì)Molt4細(xì)胞周期的影響化合物作用Molt4細(xì)胞48h后，空白對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為37.5％±0.2％，S期細(xì)胞比例為50.6％±0.1％，G2期細(xì)胞比例為11.7％±0.1％，DMSO組G1期細(xì)胞比例為39.6％±0.1％，S期細(xì)胞比例為51.6％±0.2％，G2期細(xì)胞比例為8.7％±0.2％?；衔锼幬?0μg/mL、25μg/mL處理組G1期所占細(xì)胞比例分別為4.1％±0.1％、65.8％±0.1％，S期細(xì)胞所占的比例增加分別為85.1％±0.3％、87.1％±0.25(P<0.01)，G2期細(xì)胞所占比例分別為10.7％±0.2％、7.0％±0.1％，結(jié)果顯示G1期有明顯差別(P<0.05)說明化合物阻滯Molt4細(xì)胞處于周期S期。結(jié)果見表2(注：*標(biāo)記與Control組比較，P<0.01)。3、化合物作用Molt4細(xì)胞后的早期凋亡率化合物作用Molt4細(xì)胞48h后，AlmexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率。空白對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率6.6％±0.4％，DMSO對(duì)照組的早期凋亡率7.0％士0.3％，與空白對(duì)照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。化合物10μg/mL組、15μg/mL組早期凋亡率分別是9.5％±0.3％、15.0％±0.5％，與空白對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3(注：*標(biāo)記與Control組比較，P<0.05)。結(jié)論，在研究中我們發(fā)現(xiàn)化合物作用Molt4細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)其顯著的周期阻滯和凋亡，并使細(xì)胞周期停留于S期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖?；衔镌谥委熂毙訲淋巴細(xì)胞白血病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。表1化合物對(duì)Molt4細(xì)胞的增殖抑制作用(％，n＝3)組別48h抑制率(％)72h抑制率(％)DMSO5.2±0.86.4±0.9化合物2.5μg/mL6.3±1.38.4±1.1化合物5μg/mL10.5±2.411.6±2.5化合物10μg/mL18.6±1.6*26.9±2.7*化合物15μg/mL33.4±2.7*49.4±2.2*化合物20μg/mL53.2±4.4*65.4±1.6*表2各組細(xì)胞周期百分比(％，n＝3)表3化合物對(duì)Molt4細(xì)胞凋亡的影響(％，n＝3)組別細(xì)胞凋亡率Control6.6±0.2DMSO7.0±0.4化合物10μg/mL9.5±0.3*化合物15μg/mL15.0±0.3*實(shí)施例3片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。實(shí)施例4口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。實(shí)施例5膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。實(shí)施例6注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。實(shí)施例7無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3