本發(fā)明屬于基因多態(tài)性檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

近年來，食管癌是世界第六大常見惡性腫瘤死因，在特殊地區(qū)的發(fā)病率呈上升趨勢。我國的食管癌發(fā)病率居世界首位，食管癌死因在全國惡性腫瘤死因中位居第四，死亡人數(shù)占全國惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/5。近年的研究表明，食管癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)生和發(fā)展除與長期吸煙、飲酒、亞硝胺類及霉菌的攝人、膳食中缺乏維生素及微量元素(如鉬)、熱損傷(喜食燙食)等環(huán)境因素有關(guān)外，與個(gè)體遺傳易感性也有密切關(guān)系。KRAS(KRAS proto-oncogene)基因位于12號(hào)染色體上，是表皮生長因子受體(EGFR)功能信號(hào)的下游分子，在膜受體到腺苷環(huán)化酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。KRAS基因通過激活RAF/MEK/MAPK通路促進(jìn)癌癥的發(fā)生。KRAS基因的突變與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，在癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。這些突變位點(diǎn)，一個(gè)氨基酸的替換可以導(dǎo)致一個(gè)激活突變或者使KRAS的表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)miRNA let-7與KRAS 3’端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性位點(diǎn)rs712與結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔癌等多種癌癥相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類長期進(jìn)化過程中環(huán)境選擇的結(jié)果，已成為第3代分子遺傳的標(biāo)記，具有標(biāo)記密度高、穩(wěn)定、易于分型檢測的優(yōu)勢，是人種之間、個(gè)體之間差異的遺傳基礎(chǔ)之一，已確定為多種遺傳學(xué)相關(guān)疾病的易感基礎(chǔ)，成為患病危險(xiǎn)程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前進(jìn)行SNP基因型檢測的方法有多種，金標(biāo)準(zhǔn)為基因測序法，這是目前最準(zhǔn)確的檢測方法，但該方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難推廣。芯片法具有快速高通量的優(yōu)點(diǎn)，但是操作上復(fù)雜，步驟多，成本高也不易普及。

序列特異性引物PCR也稱等位基因特異性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA多聚酶不能修復(fù)DNA引物在3′末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配。所以，當(dāng)引物的3′端核苷酸與等位基因變異部位序列互補(bǔ)，則模板被擴(kuò)增。但是，當(dāng)引物3′端核苷酸與模板錯(cuò)配，則模板不會(huì)被擴(kuò)增或擴(kuò)增效率極低。每個(gè)等位基因的檢測，需設(shè)計(jì)兩套引物，一套為等位基因特異性引物，一套為普通引物。PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，通過紫外線透射來檢測DNA的存在與否，DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型。在同一反應(yīng)中的另一對(duì)引物(通常擴(kuò)增人生長激素基因的一段)總會(huì)產(chǎn)生一個(gè)DNA片斷，與SNP基因型無關(guān)，作為PCR有效性的控制?；蛱禺愋訮CR(AS-PCR)的缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率較低，擴(kuò)增特異性差，因此PCR產(chǎn)物的特異性與穩(wěn)定性無法保障，同時(shí)，分型結(jié)果也較容易誤判，穩(wěn)定性較差。TaqMan探針法是指PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5′端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)(就是說5’熒光基團(tuán)的發(fā)射波長正好是3’熒光基團(tuán)的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3’熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會(huì)將切割探針，釋放5′端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5′端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被探頭檢測到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。Taqman熒光探針法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。SNaPshot也被稱為minisequencing。該方法針對(duì)不同突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長度的引物SNaPshot反應(yīng)后，產(chǎn)物通過電泳分離、五色熒光檢測、Gene mapper分析，可在一次電泳膠內(nèi)檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)。應(yīng)用SNaPshot進(jìn)行定點(diǎn)的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接測序中的雙脫氧終止法，所不同的是PCR反應(yīng)中只有不同熒光標(biāo)記的ddNTP。由于每個(gè)SNP位點(diǎn)的引物3′端都緊靠SNP點(diǎn)，因此每一種引物在聚合酶作用下，根據(jù)模板的；序列，只延伸一個(gè)核苷酸。然后用先進(jìn)的熒光檢測系統(tǒng)，檢測延伸的那個(gè)核苷酸的種類。SNaPshot基因型分析方法的缺點(diǎn)在于所需試劑必須從國外進(jìn)口，而且成本較高，不適合實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用TaqI檢測食管癌易感性基因KRAS多態(tài)性位點(diǎn)rs712的方法，旨在解決現(xiàn)有的食管癌易感基因多態(tài)性檢測方法，克服操作復(fù)雜、需昂貴的儀器和繁瑣的步驟、檢測成本較高、適用范圍小、難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種引物，所述引物的序列為：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種應(yīng)用所述引物的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法，所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟：

步驟一，抽提樣品的基因組DNA；

步驟二，提供擴(kuò)增人KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物，上游引物:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，以提取的待測人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟三，使用限制性內(nèi)切酶TaqI進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；

步驟四，將酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以判定KRAS基因多態(tài)性rs712的各基因型。其中，經(jīng)電泳后有一條條帶者為野生型TT基因型，兩條條帶者為純合突變GG基因型，三條條帶者為雜合基因型TG基因型。

進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增的體系反應(yīng)條件：

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在94℃變性，再迅速冷卻至57℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后升溫至72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。

進(jìn)一步，所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟：

(l)獲取手術(shù)切取的食管癌組織，采用酚-氯仿法提取食管癌組織的基因組DNA作為待測DNA，提取步驟如下：

1)將食管癌組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取0.1g的組織進(jìn)行碾磨，加入1ml的滅菌水，顛倒混勻，10000rpm離心10min，棄上清，以上步驟重復(fù)兩次；

2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混勻，55℃水浴消化過夜；

3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液1:1，劇烈震蕩，使其變成奶咖色，12000rpm離心10min；

4)取上清時(shí)避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體，加入等體積的氯仿后顛倒混勻，12000rm離心10min；

5)取上清，加入1/10的醋酸鈉以及2.5倍的無水乙醇，顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清；

6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀懸浮，顛倒混勻數(shù)次，12000rpm離心10min，棄上清，室溫靜置5-10min使乙醇揮發(fā)干凈；

7)加入50μl滅菌水溶解DNA，即得食管癌組織基因組DNA；

(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取，在CHIP網(wǎng)站上進(jìn)行核對(duì)，明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對(duì)結(jié)果信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列：5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，制備PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCRMix7.5μl，雙蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl，充分混勻后即得15.0μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；按照第一階段：94℃變性5min，第二階段共包括30個(gè)循環(huán)三個(gè)步驟，首先94℃變性30s，57℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三階段：72℃延伸5min，最終4℃儲(chǔ)存以備用，即得長為384bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)擴(kuò)增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h，PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計(jì)15μl酶切體系，于水浴鍋中37℃酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物。

(4)酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。

進(jìn)一步，所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟：

(l)獲取外周血細(xì)胞，采用酚-氯仿法提取血細(xì)胞的基因組DNA作為待測DNA，提取步驟如下：

l)在1.5ml離心管中加入300μl血細(xì)胞后，再加入900μl細(xì)胞裂解液混和均勻，在冰上放置10min后，在離心機(jī)中12000rpm離心1min，棄上清，再次加入900μl細(xì)胞裂解液，用槍吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；

2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混勻，在70℃水浴鍋中放置10min后，12000rpm離心5min；

3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號(hào)的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μl無水乙醇，期間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA；

4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入)，室溫靜置2min，再12000rpm離心1min，棄廢液；

5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液；

8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過號(hào)的離心管中，敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味；

9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl，室溫放置5min，12000rpm離心1min，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA；

(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取，在CHIP網(wǎng)站上進(jìn)行核對(duì)，明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對(duì)結(jié)果信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列：5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，制備PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCRMix7.5μl，雙蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl，充分混勻后即得15.0μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；按照第一階段：94℃變性5min，第二階段共包括30個(gè)循環(huán)三個(gè)步驟，首先94℃變性30s，57℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三階段：72℃延伸5min，最終4℃儲(chǔ)存以備用，即得長為384bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)擴(kuò)增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h，PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計(jì)15μl酶切體系，于水浴鍋中37℃酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物；

(4)酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含所述引物的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的試劑盒。

本發(fā)明提供的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法，首先提取待測人基因組DNA模板，人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組模板；然后PCR擴(kuò)增基因組DNA，對(duì)提取的模板基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含多態(tài)附近序列的PCR產(chǎn)物；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物；酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型；該用TaqI檢測食管癌易感性基因多態(tài)性的方法，方法重復(fù)性好，操作較簡單，成本低，酶切結(jié)果容易辨識(shí)，適用范圍廣泛，由于識(shí)別特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶TaqI適用范圍廣，限制性內(nèi)切酶且引物合成以及各試劑價(jià)格低廉，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，極大地降低了檢測基因多態(tài)性的成本。本發(fā)明提供了一種檢測食管癌易感基因的方法，由于識(shí)別特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶TaqI適用范圍廣，價(jià)錢較為經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而大大降低了檢測SNP的成本。經(jīng)在線酶切位點(diǎn)分析(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/cutshow.php？name＝26419975-)發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)附近只有TaqI的酶切位點(diǎn)，而當(dāng)SNP位點(diǎn)由G變?yōu)門時(shí)，TaqI酶切位點(diǎn)消失，限制性內(nèi)切酶TaqI是最佳選擇。本發(fā)明提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人食管癌易感基因KRAS基因多態(tài)性rs712的方法，發(fā)現(xiàn)rs712帶有T基因型(尤其是GT基因型)的個(gè)體食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于帶有GG基因型個(gè)體。在此背景下提供此方便、快捷的檢測人食管癌易感基因KRAS多態(tài)性rs712的方法有望預(yù)測癌食管的易感性，可用于臨床的早期診斷。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有基因多態(tài)性基因分型技術(shù)中存在的缺陷，提供一種用TaqI檢測人食管癌易感基因KRAS多態(tài)性位點(diǎn)rs712的分型方法，該方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，再由限制酶圖譜分析此段序列的特異酶切位點(diǎn)，通過片段的多樣性來比對(duì)不同來源基因序列的差異性。簡而言之，就是先PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片段，然后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，電用后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。此方法重復(fù)性好，操作簡單，成本低廉，酶切結(jié)果容易辨識(shí)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物擴(kuò)增條件示意圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)的電泳圖譜；

圖中：M道：Marker(100bp DNA Ladder)；1道：rs712的TT基因型；2道：rs712的TG基因型；3道：rs712的GG基因型。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)TT基因型反向測序圖譜。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)TG基因型反向測序圖譜。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)GG基因型測序圖譜。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟：

S101：抽提樣品的基因組DNA；

S102：提供擴(kuò)增人KRAS基因多態(tài)性rs712位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物，上游引物:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，以提取的待測人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物；

S103：使用限制性內(nèi)切酶TaqI進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；

S104：將酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以判定KRAS基因多態(tài)性rs712的各基因型。其中，經(jīng)電泳后有一條條帶者為野生型TT基因型，兩條條帶者為純合突變GG基因型，三條條帶者為雜合基因型TG基因型。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

在本發(fā)明的實(shí)施中，正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)采用Primer6.0軟件進(jìn)行，設(shè)計(jì)的原則綜合考慮引物對(duì)PCR擴(kuò)增的靈敏度、特異度以及擴(kuò)增效率的影響。按照堿基互不配對(duì)的原則設(shè)計(jì)引物，引物長度一般在15～30堿基之間，過長或短均會(huì)造成特異性差，過長還會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物GC含量在40％～60％之間，Tm值最好在55℃-65℃，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機(jī)分布，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物應(yīng)具有特異性，引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測，以確保其與其它基因不具有互補(bǔ)性。在此基礎(chǔ)上，最終選取的上游引物SEQ ID NO：1序列為5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物SEQ ID NO：2序列:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’。由此引物擴(kuò)增出的面的片段384bp，擴(kuò)增產(chǎn)物如下：

下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第65位bp R代表G/T多態(tài)即SNP位點(diǎn)rs712。該長為384bp的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后可產(chǎn)生384bp，321bp(該片段下游序列相比上游序列由于TaqI酶切產(chǎn)生的粘性末端減少兩個(gè)單鏈堿基)，63bp(該片段下游序列相比上游序列由于TaqI酶切產(chǎn)生的粘性末端增加兩個(gè)單鏈堿基)共三種片段類型?；蛐团卸ńY(jié)果：TT基因型顯示一個(gè)片段：384bp；TG基因型顯示兩個(gè)個(gè)片段：384bp、321bp和63bp(63bp太小，所以未顯示出來)的；GG基因型顯示一個(gè)片段321bp(63bp太小，所以未顯示出來)。

凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的，可用于DNA片段的制備電泳。聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式：一是用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠，二是用于分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。但綜合考慮實(shí)用性、便利性以及經(jīng)濟(jì)性，使用瓊脂糖凝膠電泳不失為一種最佳選擇。在本發(fā)明中，引物擴(kuò)增條件如圖2所示，目的擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI5U水浴鍋中酶切6-14h。酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。

在本發(fā)明中，PCR擴(kuò)增體系的反應(yīng)條件并不受特別的限制，基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～94℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。而對(duì)于待測DNA也沒有較高的濃度及純度要求，既可以是人體體液或組織中提取的DNA，也可以是經(jīng)過預(yù)先降解處理的基因組。但為了方便實(shí)施以及減少受試者痛苦，一般優(yōu)先選擇從血液中進(jìn)行基因組DNA的提取。

本發(fā)明經(jīng)過多年研究，首次證明了KRAS基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs712位于3’-UTR端，是let-7的靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了在KRAS基因rs712G→T在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P<0.05)。在此基礎(chǔ)上本發(fā)明提供了一種檢測食管癌易感性基因的方法，利用本發(fā)明檢測位點(diǎn)的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為食管癌的易感基因多態(tài)性的基因型檢測提供了一個(gè)簡捷的新途徑。

實(shí)施例1.人食管癌組織標(biāo)本測定人KRAS rs712多態(tài)性

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，檢測人KRAS基因多態(tài)rs712的具體步驟如下：

(l)獲取手術(shù)切取的食管癌組織，采用酚-氯仿法提取食管癌組織的基因組DNA作為待測DNA，提取步驟如下：

1)將食管癌組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取0.1g的組織進(jìn)行碾磨，加入1ml的滅菌水，顛倒混勻，10000rpm離心10min，棄上清，以上步驟重復(fù)兩次。

2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混勻，55℃水浴消化過夜。

3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液(1:1)，劇烈震蕩，使其變成奶咖色。12000rpm離心10min。

4)取上清時(shí)避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入等體積的氯仿后顛倒混勻。12000rm離心10min。

5)取上清，注意避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入1/10的醋酸鈉以及2.5倍的無水乙醇，顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清。

6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀懸浮，顛倒混勻數(shù)次，12000rpm離心10min，棄上清，室溫靜置5-10min使乙醇揮發(fā)干凈。

7)加入50μl滅菌水溶解DNA，即得食管癌組織基因組DNA。

(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取，在CHIP網(wǎng)站上進(jìn)行核對(duì)，明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對(duì)結(jié)果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列：5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，制備PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCRMix7.5μl，雙蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl，充分混勻后即得15.0μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；按照第一階段：94℃變性5min，第二階段共包括30個(gè)循環(huán)三個(gè)步驟，首先94℃變性30s，57℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三階段：72℃延伸5min，最終4℃儲(chǔ)存以備用，即得長為384bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)擴(kuò)增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h，PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計(jì)15μl酶切體系，于水浴鍋中37℃酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物。

(4)酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型(見表1)。

表1rs712位點(diǎn)基因型判定

實(shí)施例2.人外周血全血標(biāo)本測定人KRAS rs712多態(tài)性

與實(shí)施例1的步驟基本相同，只是采用下面的方法從人外周血中提取基因組DNA作為待測DNA。

按照NEP004-1全血基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行待測血樣基因組DNA的提取，具體步驟如下：

l)在1.5ml離心管中加入300μl血細(xì)胞后，再加入900μl細(xì)胞裂解液混和均勻，在冰上放置10min后，在離心機(jī)中12000rpm離心1min，棄上清，再次加入900μl細(xì)胞裂解液，用槍吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；

2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混勻，在70℃水浴鍋中放置10min后，12000rpm離心5min。

3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號(hào)的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μl無水乙醇，期間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA；

4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入)，室溫靜置2min，再12000rpm離心1min，棄廢液；

5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液；

8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過號(hào)的離心管中，敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味；

9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl，室溫放置5min，12000rpm離心1min，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA。

提取完畢基因組DNA后按照案例一的步驟進(jìn)行基因型的鑒定，鑒定結(jié)果如下：將酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下拍照鑒定。對(duì)于不同的基因型，rs712位點(diǎn)不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖3)，TT基因型顯示一個(gè)片段：384bp；TG基因型顯示兩個(gè)個(gè)片段：384bp、321bp和63bp(63bp太小，所以未顯示出來)的；GG基因型顯示一個(gè)片段321bp(63bp太小，所以未顯示出來)。各基因型均經(jīng)測序以進(jìn)一步鑒定，測序結(jié)果(見圖4-6)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的描述。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

儀器：BCD-228CH冰箱(新飛電器)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(華峰儀器)，SmartGel凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè))，GT9612梯度PCR儀(百泰克生物)，WD900SL23-2型號(hào)微波爐(格蘭仕電器)，DG-300C型電泳儀(鼎國昌盛生物)等。

試劑：NEP004-1 DNA提取試劑盒(鼎國昌盛生物)，100bp DNA Ladder(萊風(fēng)生物)，2×Taq PCR Mix(萊風(fēng)生物)，TaqI(NEB)，瓊脂糖(SIGMA)等。

1.2引物設(shè)計(jì)

在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中，查KRAS rs712的核苷酸序列如下：

基因序列的第501個(gè)堿基R代表了G/T多態(tài)，即為rs712的多態(tài)性位點(diǎn)。將以上序列粘貼至引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0中，設(shè)置引物長度和擴(kuò)增目的片段長度等參數(shù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)GC含量和退火溫度等選擇最優(yōu)上下游引物，再將此引物與Pubmed中的Blast序列比對(duì)功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行引物比對(duì)，最終確定的上下游引物為正向引物序列：5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’，下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’，引物的合成可以采用本領(lǐng)域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成。

1.3限制性內(nèi)切酶的選擇

根據(jù)dbSNP中rs712位點(diǎn)的堿基序列，用NEBcutter在線限制性內(nèi)切酶分析軟件，在線搜索獲得可識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶的信息，綜合考慮其酶切特異性及經(jīng)濟(jì)適用性選擇最佳的限制性內(nèi)切酶TaqI。

1.4從全血中提取待測樣本的基因組DNA

嚴(yán)格按照離心柱型DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。

l)在1.5ml離心管中加入300μl血細(xì)胞后，再加入900μl細(xì)胞裂解液混和均勻，在冰上放置10min后，在離心機(jī)中12000rpm離心1min，棄上清，再次加入900μl細(xì)胞裂解液，用槍吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；

2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混勻，在70℃水浴鍋中放置10min后，12000rpm離心5min；

3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號(hào)的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μl無水乙醇，期間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA；

4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入)，室溫靜置2min，再12000rpm離心1min，棄廢液；

5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液；

8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過號(hào)的離心管中，敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味；

9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl，室溫放置5min，12000rpm離心1min，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA；

10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度。

2結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

(1)根據(jù)提取基因組DNA的濃度，將研究對(duì)象的DNA進(jìn)行稀釋，使終濃度為20μg/μl。

(2)PCR擴(kuò)增體系為2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用雙蒸水補(bǔ)充總體積至15μl。

(3)PCR反應(yīng)條件：第一個(gè)階段為預(yù)變性階段，94℃/5min；第二個(gè)階段包括三個(gè)步驟共30個(gè)循環(huán)，依次設(shè)置為94℃/30s、57℃退火時(shí)間45s、72℃/45s；第三個(gè)階段72℃/5min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物序列為：

下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第65位bp R代表T/G多態(tài)即SNP位點(diǎn)rs712。

2.2酶切反應(yīng)

酶切體系為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl、上限制性內(nèi)切酶TaqI 5U、Buffer 1.0μl，最后用雙蒸水補(bǔ)充總體積至15μl?；靹蚝笾糜谒″佒?7℃水浴4-16小時(shí)。

2.3基因型的判定

將酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠在4-10V/cm的條件下，電泳20-40min，至紫外燈下能分清明顯的條帶后并拍照鑒定。對(duì)于不同的基因型，rs712位點(diǎn)不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖3)，TT基因型顯示一個(gè)片段：384bp；TG基因型顯示兩個(gè)個(gè)片段：384bp、321bp和63bp(63bp太小，所以未顯示出來)的；GG基因型顯示一個(gè)片段321bp(63bp太小，所以未顯示出來)。各基因型均經(jīng)測序以進(jìn)一步鑒定，測序結(jié)果(見圖4-6)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。